GB15193.5-2003骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn).pdf

I CS 0 7 . 1 0 0C 5 3中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB 1 5 1 9 3 . 5 -2 0 0 3 代替 G B 1 5 1 9 3 . 5 -1 9 9 4骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)Bo n e ma r r o w c e l l mi c r o n u c l e u s t e s t2 0 0 3 - 0 9 - 2 4 發(fā)布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 實(shí)施華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 化 管 理 委 員 會(huì)發(fā) 布中中GB 1 51 9 3 . 5 - 2 0 0 3月 U呂本標(biāo)準(zhǔn)全文強(qiáng)制。本標(biāo)準(zhǔn)代替 G B 1 5 1 9 3 . 5 -1 9 9 4 ( 骨髓微核試驗(yàn) 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B 1 5 1 9 3 . 5 -1 9 9 4 相比主要修改如下:在“ 范圍” 中增加了受試物的具體內(nèi)容: 食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中所涉及的可能 對(duì)健康造成危害的化學(xué)、 生物和物理因素， 檢驗(yàn)對(duì)象包括食品添加劑( 含營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑) 、 食品新 資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設(shè)備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等; 增加不適用范圍;在“ 劑量分組” 內(nèi)容中: 將高劑量組的設(shè)計(jì)方法增加“ 急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量( 最大 使用濃度和最大灌胃 容量) 求不出L D 。 時(shí)， 高劑量組則按以 下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人 的可能攝人量的1 0 。 倍; 或c ) 一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)” ;將“ 結(jié)果評(píng)價(jià)” 統(tǒng)一改為“ 結(jié)果判定” ， 并增加“ 一般陰性對(duì)照組的微核率5 % 0 ， 供參考。但應(yīng)有 本試驗(yàn)室所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)微核率作參考” 。自 本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施之日 起， G B 1 5 1 9 3 . 5 -1 9 9 4 同時(shí)廢止。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所、 浙江省衛(wèi)生防疫站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人: 徐鳳丹、 韓馳、 趙碩。本標(biāo)準(zhǔn)于1 9 9 4 年首次發(fā)布， 本次為第一次修訂GB 1 5 1 9 3 . 5 - 2 0 0 3骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)1 范 圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微核試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中所涉及的可能對(duì)健康造成危害的化學(xué)、生物和物理因素的致突變作用， 檢驗(yàn)對(duì)象包括食品添加劑( 含營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑) 、 食品新資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設(shè)備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等。 本標(biāo)準(zhǔn)不適用于有證據(jù)表明受試物或其代謝產(chǎn)物不能達(dá)到靶組織的情況2 原理 微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)人子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)， 仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無(wú)著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后， 單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核， 被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成， 由于比核小得多故稱(chēng)微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。另外， 也可能在受到紡錘體毒物的作用時(shí)， 主核沒(méi)有能夠形成， 代之以一組小核。此時(shí)小核往往比一般典型的微核稍大3 儀器與試劑3 . 1 儀器 解剖器械， 生物顯微鏡， 載玻片等。3 . 2 試荊 全部試劑除注明外， 均為分析純， 試驗(yàn)用水為蒸餾水。3 . 2 . 1 小牛血清: 小牛血清濾菌后放人5 6 恒溫水浴保溫1h 進(jìn)行滅活。通常儲(chǔ)存于4 冰箱里亦可用大、 小鼠血清代替3 . 2 . 2 G i e m s a 染液: 稱(chēng)取G i e m s a 染液3 . 8 g ， 加人3 7 5 m l ， 甲醇( 分析純) 研磨， 待完全溶解后， 再加人1 2 5 m L 甘油。置3 7 恒溫箱保溫4 8 h 振搖數(shù)次。過(guò)濾兩周后用3 . 2 . 3 G i e m s a 應(yīng)用液: 取1 份G i e m s a 染液與6 份磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用時(shí)配制。3 . 2 . 4 1 / 1 5 m o l / L磷酸鹽緩沖液( p H 6 . 8 ) : 磷酸二氫鉀( KH 2 P 0 , ) 4 . 5 0 g 磷酸氫二鈉 ( N a , H P O , 1 2 H, 0 ) 1 1 . 8 1 g 加蒸餾水至1 0 0 0 m L3 . 2 . 5 甲醇( 分析純) 。4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠是微核試驗(yàn)的常規(guī)動(dòng)物， 也可選用大鼠。通常用 7 周一1 2 周齡， 體重 2 5 g -3 09的小鼠或體重1 5 0 g -2 0 0 g 的大鼠。每組用兩種性別的動(dòng)物至少各5 只。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)環(huán)境至少3 天。5 荊量及分組 受試物應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組， 最高劑量組原則上為動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和/ 或個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量， 一般可取 1 / 2 L D , o ， 低劑量組應(yīng)不表現(xiàn)出毒性， 分別取 1 / 4 L D , 。 和 1 / 8 L D , 。 作為中、 低劑量急性毒 4 7GB 1 51 9 3 . 5 - 2 0 0 3性試驗(yàn)給予受試物最大劑量( 最大使用濃度和最大灌胃容量) 動(dòng)物無(wú)死亡而求不出L D , 。 時(shí)， 高劑量組則按以下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人的可能攝人量的1 0 0 倍; 或c ) 一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)， 再下設(shè)中、 低劑量組。另設(shè)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物可用環(huán)磷酞胺4 0 m g / k g 體重經(jīng)口或腹腔注射( 首選經(jīng)口) 給予6 操作步驟6 . 1 受試物配制 一般用蒸餾水作溶劑， 如受試物不溶于水， 可用食用油、 醫(yī)用淀粉、 狡甲基纖維素等配成乳化液或懸濁液。受試物應(yīng)于灌胃前新鮮配制， 除非有資料表明以溶液( 或懸濁液、 乳濁液等) 保存具有穩(wěn)定性。6 . 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 經(jīng)口灌胃。根據(jù)細(xì)胞周期和不同物質(zhì)的作用特點(diǎn)， 可先做預(yù)試， 確定取材時(shí)間。常用 3 0 h給受試物法。即兩次給受試物間隔2 4 h ， 第二次給受試物后6 h , 頸椎脫臼處死動(dòng)物。6 . 3 標(biāo)本制備 取胸骨或股骨， 用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻， 常規(guī)涂片， 或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔制成細(xì)胞懸液涂片， 涂片自 然干燥后放人甲醇中固定5 m i n -1 0 m i n 。當(dāng)日固定后保存。將固定好的涂片放人G i e m s a 應(yīng)用液中， 染色1 0 m i n -1 5 m i n 。立即用p H 6 . 8 的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、 晾干。寫(xiě)好標(biāo)簽， 陰涼干燥處保存。6 . 4 閱片 選擇細(xì)胞完整、 分散均勻， 著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域， 在油鏡下觀察。以有核細(xì)胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。 本法系觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。用G i e m s a 染色法， 嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色， 成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)的、 圓形、 邊緣光滑整齊， 嗜色性與核質(zhì)一致， 呈紫紅色或藍(lán)紫色， 直徑通常為紅細(xì)胞的1 / 2 0- 1 / 5。 用雙盲法閱片。每只動(dòng)物計(jì)數(shù) 1 0 0 0 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞， 觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)， 微核率以千分率表示。 觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞( P C E / R B C ， 可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)之一。一般計(jì)數(shù) 2 0 0 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞。受試物組未成熟紅細(xì)胞占紅細(xì)胞總數(shù)的比例不應(yīng)少于對(duì)照組的2 07 數(shù)據(jù)處理一般采用卡方檢驗(yàn)、 泊松分布、 或雙側(cè) t 檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)