GB15193.5-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn).pdf

書 書 書中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)犌犅 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 發(fā)布 實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā) 布書 書 書犌犅 前言本標(biāo)準(zhǔn)代替 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 。本標(biāo)準(zhǔn)與 相比，主要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)” ； 修改了范圍； 增加了術(shù)語和定義； 增加了試驗(yàn)報(bào)告； 增加了試驗(yàn)的解釋； 修改了試驗(yàn)?zāi)康暮驮恚?修改了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物； 修改了給予程序； 修改了標(biāo)本制作； 修改了閱片的內(nèi)容。犌犅 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性作用。術(shù)語和定義 微核細(xì)胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍留在細(xì)胞質(zhì)中的整條染色單體或染色體的無著絲斷片或環(huán)。在末期單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成。 著絲粒在細(xì)胞分裂期染色體與紡錘體纖維連接的區(qū)域，以使子染色體有序移動(dòng)到子細(xì)胞兩極。 正染紅細(xì)胞成熟的紅細(xì)胞，其缺乏核糖體并可用選擇性核糖體染料與未成熟的嗜多染紅細(xì)胞區(qū)分。 嗜多染紅細(xì)胞未成熟的紅細(xì)胞處于發(fā)育的中間期，仍含有核糖體，故可用選擇性核糖體染料與成熟的正染紅細(xì)胞區(qū)分。 總紅細(xì)胞正染紅細(xì)胞和嗜多染紅細(xì)胞的總和。試驗(yàn)?zāi)康暮驮聿溉閯?dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)通過分析動(dòng)物骨髓和（或）外周血紅細(xì)胞，用于檢測(cè)受試物引起的成熟紅細(xì)胞染色體損傷或有絲分裂裝置損傷，導(dǎo)致形成含有遲滯的染色體斷片或整條染色體的微核。這種情況的出現(xiàn)通常是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。此外也可能在受到紡錘體毒物的作用時(shí)，主核未能形成代之以一組小核，此時(shí)小核比一般典型的微核稍大。儀器和試劑 儀器解剖器械、生物顯微鏡、載玻片等。犌犅 試劑注：全部試劑除注明外均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。 小牛血清：小牛血清濾菌后放入 恒溫水浴保溫進(jìn)行滅活。通常儲(chǔ)存于冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。 染液：稱取 染料 ，加入 甲醇研磨，待完全溶解后，再加入 甘油。置 恒溫箱保溫 ，期間振搖數(shù)次，取出過濾，兩周后可用。 應(yīng)用液：取一份 染液與份磷酸鹽緩沖液混合而成?，F(xiàn)用現(xiàn)配。 磷酸鹽緩沖液（ ） ：磷酸二氫鉀（） 磷酸氫二鈉（ ） 加蒸餾水至 甲醇。試驗(yàn)方法 受試物 受試物的配制：應(yīng)將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等） ，不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲(chǔ)存穩(wěn)定者除外。 給予途徑：應(yīng)采用灌胃法。陽性對(duì)照物也可采用腹腔注射的方法。灌胃體積一般不超過 體重，如為水溶液時(shí)，最大灌胃體積可達(dá) 體重；如為油性液體，灌胃體積應(yīng)不超過 體重；各組灌胃體積一致。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物種、系選擇：在利用骨髓時(shí)，推薦使用小鼠或大鼠。利用外周血時(shí)，推薦用小鼠。如果已經(jīng)證實(shí)某品系動(dòng)物脾臟不清除有微核的嗜多染紅細(xì)胞，或?qū)σ鹑旧w結(jié)構(gòu)或數(shù)目畸變的化學(xué)物檢測(cè)有足夠的敏感性，則此種動(dòng)物可以利用。通常用周齡 周齡，體重 的小鼠或體重 的大鼠，在試驗(yàn)開始時(shí)，動(dòng)物體重差異應(yīng)不超過每種性別平均體重的 。每組用兩種性別的動(dòng)物至少各只。 動(dòng)物準(zhǔn)備：試驗(yàn)前動(dòng)物在試驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)進(jìn)行至少環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。 動(dòng)物飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定（ 、 、 、 、 ） 。每個(gè)受試物組動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠只。試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂飼基礎(chǔ)飼料，自由飲水。 劑量受試物應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，最高劑量組原則上為動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和（或）個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量，一般可取 ，低劑量組應(yīng)不表現(xiàn)出毒性，分別取 和 作為中、低劑量。急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動(dòng)物無死亡而求不出 時(shí)，高劑量組則按以下順序：） 體重；）人的可能攝入量的 倍；）一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)，再下設(shè)中、低劑量組。另設(shè)溶媒對(duì)照組。陽性對(duì)照物可用環(huán)磷酰犌犅 胺 體重經(jīng)口或腹腔注射（首選經(jīng)口）給予。 試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo) 受試物給予經(jīng)口灌胃。根據(jù)細(xì)胞周期和不同物質(zhì)的作用特點(diǎn)，可先做預(yù)試，確定取材時(shí)間。常用 給受試物法。即兩次給受試物間隔 ，第二次給受試物后采集骨髓樣品。試驗(yàn)還可以有以下種采樣方式：）以受試物次給予動(dòng)物。以適當(dāng)?shù)拈g隔采集骨髓樣品至少次，開始不早于給予后 ，最后不晚于給予后 。早于給予后 的采樣，應(yīng)說明理由。外周血采樣以適當(dāng)?shù)拈g隔至少次，開始不早于給予后 ，最后不晚于給予后 。如在一個(gè)采樣時(shí)間發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，則不需要進(jìn)一步采樣。）每天次給予，共次或多次（間隔 ）給予，可在末次給予后 之間采集骨髓次，對(duì)外周血可在末次給予后 之間采樣次。若選用外周血正染紅細(xì)胞的含微核細(xì)胞率作為試驗(yàn)觀察終點(diǎn)，動(dòng)物給予的時(shí)間應(yīng)達(dá)周以上。 標(biāo)本制作 骨髓樣品：處死后取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔制成細(xì)胞懸液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定 。當(dāng)日固定后保存。將固定好的涂片放入 應(yīng)用液中，染色 。立即用 的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。寫好標(biāo)簽，陰涼干燥處保存。 外周血樣品：從尾靜脈或其他適當(dāng)?shù)难懿杉庵苎?，血?xì)胞立即在存活狀態(tài)染色或制備涂片并染色。為排除與使用非染料相關(guān)的人工假象可利用特異性染料（如吖啶橙或 加 ） 。這種方法的好處是不會(huì)排除常用染料（如 ）的使用。 閱片 選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察。以有核細(xì)胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。 本方法系觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。用 染色法，嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的 。 對(duì)每個(gè)動(dòng)物的骨髓至少觀察 個(gè)紅細(xì)胞，對(duì)外周血至少觀察 個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中比例，嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中比例不應(yīng)低于對(duì)照值的 。每個(gè)動(dòng)物至少觀察 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞以計(jì)數(shù)有微核嗜多染紅細(xì)胞頻率，即含微核細(xì)胞率，以千分率表示。如一個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中有多個(gè)微核存在時(shí)，只按一個(gè)細(xì)胞計(jì)。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià) 數(shù)據(jù)處理按動(dòng)物性別分別統(tǒng)計(jì)各組含微核細(xì)胞率的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，利用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法如泊松（ ）分布或檢驗(yàn)，對(duì)受試樣品各劑量組與溶劑對(duì)照組的含微核細(xì)胞率進(jìn)行比較。 結(jié)果評(píng)價(jià)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，試驗(yàn)結(jié)果含微核細(xì)胞率有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，即可確犌犅 認(rèn)為有陽性結(jié)果。若統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果能重復(fù)可確定為陽性。試驗(yàn)報(bào)告 試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報(bào)告編號(hào)。 試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。 試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。 試驗(yàn)摘要。 受試物：名稱、批號(hào)、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識(shí)） 、數(shù)量、前處理方法、陽性對(duì)照物的相關(guān)信息。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：物種、品系、級(jí)別、數(shù)量、周齡、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)） 、動(dòng)物檢疫、適應(yīng)情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對(duì)濕度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)） ，飼料來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證號(hào)） 。 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)分組、每組動(dòng)物數(shù)、劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、采樣時(shí)間點(diǎn)、標(biāo)本制備方法、每只動(dòng)物觀察的細(xì)胞數(shù)、統(tǒng)計(jì)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。 試驗(yàn)結(jié)果：記錄每只動(dòng)物觀察的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)和含有微核的細(xì)胞數(shù)，以列表方式報(bào)告不同性別每組動(dòng)物的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)、含微核細(xì)胞率和嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中的比例、劑量反應(yīng)關(guān)系、陰性對(duì)照的歷史資料和范圍，并寫明結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方法。 試驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)受試物是否能引起哺乳動(dòng)物嗜多染紅細(xì)胞含微核細(xì)胞率增加做