GB4789.7-2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準 GB 4789.72013 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗 2013-11-29 發(fā)布 2014-06-01 實施 GB 4789.72013 I 前 言 本標準代替GB/T 4789.7-2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗。 本標準與GB/T 4789.7-2008相比，主要變化如下： 修改了標準的中文名稱； 修改了范圍； 修改了設(shè)備和材料； 修改了培養(yǎng)基和試劑； 修改了樣品制備過程； 修改了檢驗程序。 GB 4789.72013 1 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗 1 范圍 本標準規(guī)定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的檢驗方法。 本標準適用于食品中副溶血性弧菌的檢驗。 2 設(shè)備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： a) 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 ； b) 冰箱：2 5 、7 10 ； c) 恒溫水浴箱：36 1 ； d) 均質(zhì)器或無菌乳缽； e) 天平：感量 0.1 g； f) 無菌試管：18 mm 180 mm、15 mm 100 mm； g) 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭； h) 無菌錐形瓶：容量 250 mL、500 mL、1000 mL； i) 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm； j) 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)； k) 無菌手術(shù)剪、鑷子。 3 培養(yǎng)基和試劑 3.1 3氯化鈉堿性蛋白胨水：見附錄 A 中 A.1。 3.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見附錄 A 中 A.2。 3.3 3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂：見附錄 A 中 A.3。 3.4 3氯化鈉三糖鐵瓊脂：見附錄 A 中 A.4。 3.5 嗜鹽性試驗培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.5。 3.6 3氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.6。 3.7 3氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.7。 3.8 3氯化鈉 MR-VP 培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.8。 3.9 3氯化鈉溶液：見附錄 A 中 A.9。 3.10 我妻氏血瓊脂：見附錄 A 中 A.10。 3.11 氧化酶試劑：見附錄 A 中 A.11。 3.12 革蘭氏染色液：見附錄 A 中 A.12。 3.13 ONPG 試劑：見附錄 A 中 A.13。 3.14 Voges-Proskauer（V-P）試劑：見附錄 A 中 A.14。 3.15 弧菌顯色培養(yǎng)基。 GB 4789.72013 2 3.16 生化鑒定試劑盒。 4 檢驗程序 副溶血性弧菌檢驗程序見圖1。 圖1 副溶血性弧菌檢驗程序 5 操作步驟 5.1 樣品制備 5.1.1 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 7 10 冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應(yīng)在 45 以下不超過 15 min 或在 2 5 不超過 18 h 解凍。 5.1.2 魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內(nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。 定量 定性 36 1 ，8 h18 h 36 1 ，18 h24 h 36 1 ，18 h24 h 36 1 ，8 h18 h 樣品 25 g（mL）+225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水 接種 3%氯化鈉堿性蛋白胨水 3 管，3 個適宜的連續(xù)稀釋度 挑取可疑菌落，接種于 3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 生化試驗或選用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng) 結(jié)果與報告 血清學試驗、神奈川試驗 （選做項目） TCBS 或弧菌顯色培養(yǎng)基 篩選試驗 氧化酶試驗，革蘭氏染色， 3氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗 GB 4789.72013 3 5.1.3 以無菌操作取樣品 25 g（mL），加入 3%氯化鈉堿性蛋白胨水 225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8 000 r/min 均質(zhì) 1 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊 2 min，制備成 1:10 的樣品勻液。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽，自 225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中取少量稀釋液加入無菌乳缽，樣品磨碎后放入 500 mL無菌錐形瓶，再用少量稀釋液沖洗乳缽中的殘留樣品 12 次，洗液放入錐形瓶，最后將剩余稀釋液全部放入錐形瓶，充分振蕩，制備 1:10 的樣品勻液。 5.2 增菌 5.2.1 定性檢測 將 5.1.3 制備的 1:10 樣品勻液于 36 1 培養(yǎng) 8 h18 h。 5.2.2 定量檢測 5.2.2.1 用無菌吸管吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，注入含有 9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備 1:100 的樣品勻液。 5.2.2.2 另取 1 mL 無菌吸管，按 5.2.2.1 操作程序，依次制備 10 倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支 1 mL 無菌吸管。 5.2.2.3 根據(jù)對檢樣污染情況的估計， 選擇 3 個適宜的連續(xù)稀釋度， 每個稀釋度接種 3 支含有 9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種 1 mL。置 36 1 恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 8 h18 h。 5.3 分離 5.3.1 對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下 1 cm 內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，于 TCBS 平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑 2 mm3 mm。從培養(yǎng)箱取出 TCBS 平板后，應(yīng)盡快（不超過 1 h）挑取菌落或標記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進行判定。 5.4 純培養(yǎng) 挑取 3 個或以上可疑菌落，劃線接種 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 5.5 初步鑒定 5.5.1 氧化酶試驗：挑選純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。 5.5.2 涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。 5.5.3 挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，轉(zhuǎn)種 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36 1 培養(yǎng) 24 h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。 5.5.4 嗜鹽性試驗：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種 0%、6%、8%和 10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36 1 培養(yǎng) 24 h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和 10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在 6%氯化鈉和 8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。 5.6 確定鑒定 GB 4789.72013 4 取純培養(yǎng)物分別接種含 3%氯化鈉的甘露醇試驗培養(yǎng)基、 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、 MR-VP 培養(yǎng)基，36 1 培養(yǎng) 24 h48 h 后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進行 ONPG 試驗。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。 6 血清學分型（選做項目） 6.1 制備 接種兩管 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂試管斜面，36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。用含 3%氯化鈉的 5%甘油溶液沖洗 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物，獲得濃厚的菌懸液。 6.2 K 抗原的鑒定 取一管 6.1 制備好的菌懸液，首先用多價 K 抗血清進行檢測，出現(xiàn)凝集反應(yīng)時再用單個的抗血清進行檢測。用蠟筆在一張玻片上劃出適當數(shù)量的間隔和一個對照間隔。在每個間隔內(nèi)各滴加一滴菌懸液，并對應(yīng)加入一滴 K 抗血清。在對照間隔內(nèi)加一滴 3%氯化鈉溶液。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動玻片 1 min。陽性凝集反應(yīng)可以立即觀察到。 6.3 O 抗原的鑒定 將另外一管的菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，121 滅菌 1 h。滅菌后 4 000 r/min 離心 15 min，棄去上層液體，沉淀用生理鹽水洗三次，每次 4 000 r/min 離心 15 min，最后一次離心后留少許上層液體，混勻制成菌懸液。用蠟筆將玻片劃分成相等的間隔。在每個間隔內(nèi)加入一滴菌懸液，將 O 群血清分別加一滴到間隔內(nèi)，最后一個間隔加一滴生理鹽水作為自凝對照。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動玻片1 min。陽性凝集反應(yīng)可以立即觀察到。如果未見到與 O 群血清的凝集反應(yīng)，將菌懸液 121 再次高壓 1 h 后，重新檢測。如果仍為陰性，則培養(yǎng)物的 O 抗原屬于未知。根據(jù)表 1 報告血清學分型結(jié)果。 表 1 副溶血性弧菌的抗原 O 群 K 型 1 1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，69 2 3，28 3 4，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，75 4 4，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，73 5 15，17，30，47，60，61，68 6 18，46 7 19 8 20，21，22，39，41，70，74 9 23，44 10 24，71 11 19，36，40，46，50，51，61 12 19，52，61，66 13 65 7 神奈川試驗（選做項目） 神奈川試驗是在我妻氏瓊脂上測試是否存在特定溶血素。神奈川試驗陽性結(jié)果與副溶血性弧菌分離GB 4789.72013 5 株的致病性顯著相關(guān)。 用接種環(huán)將測試菌株的 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 18 h 培養(yǎng)物點種于表面干燥的我妻氏血瓊脂平板。每個平板上可以環(huán)狀點種幾個菌。36 1 培養(yǎng)不超過 24 h，并立即觀察。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的 溶血。 8 結(jié)果與報告 根據(jù)檢出的可疑菌落生化性狀，報告 25 g（mL）樣品中檢出副溶血性弧菌。如果進行定量檢測，根據(jù)證實為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報告每 g（mL）副溶血性弧菌的MPN 值。副溶血性弧菌菌落生化性狀和與其他弧菌的鑒別情況分別見表 2 和表 3。 表 2 副溶血性弧菌的生化性狀 試驗項目 結(jié)果 革蘭氏染色鏡檢 陰性，無芽胞 氧化酶 動力 蔗糖 葡萄糖 甘露醇 分解葡萄糖產(chǎn)氣 乳糖 硫化氫 賴氨酸脫羧酶 V-P ONPG 注：表示陽性；表示陰性。 GB 4789.72013 6 表 3 副溶血性弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別 名稱 氧化酶 賴氨酸 精氨酸 鳥氨酸 明膠 脲酶 V P 42生長 蔗糖 D纖維二糖 乳糖 阿拉伯糖 D甘露糖 D甘露醇 ONPG 嗜鹽性試驗 氯化鈉含量 % 0 3 6 8 10 副溶血性弧菌 V. parahaemolyticus V V 創(chuàng)傷弧菌 V. vulnificus V 溶藻弧菌 V. alginolyticus 霍亂弧菌 V. cholerae V 擬態(tài)弧菌 V. mimicus 河弧菌 V. fluvialis V V 弗氏弧菌 V. furnissii 梅氏弧菌 V. metschnikovii V V 霍利斯弧菌 V. hollisae nd 注：表示陽性；表示陰性；nd 表示未試驗；V 表示可變。 GB 4789.72013 7 附錄A 培養(yǎng)基與試劑 A.1 3氯化鈉堿性蛋白胨水 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化鈉 30.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.1.2 制法 將 A.1.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.50.2，121 高壓滅菌 10 min。 A.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 酵母浸膏 5.0 g 檸檬酸鈉 （C6H5O7Na32H2O） 10.0 g 硫代硫酸鈉 （Na2S2O35H2O） 10.0 g 氯化鈉 10.0 g 牛膽汁粉 5.0 g 檸檬酸鐵 1.0 g 膽酸鈉 3.0 g 蔗糖 20.0 g 溴麝香草酚藍 0.04 g 麝香草酚藍 0.04 g 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.2.2 制法 將 A.2.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.60.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至 50 左右傾注平板備用。 A.3 3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 A.3.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 氯化鈉 30.0 g GB 4789.72013 8 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.3.2 制法 將 A.3.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.30.2，121 高壓滅菌 15 min。 A.4 3氯化鈉三糖鐵瓊脂 A.4.1 成分 蛋白胨 15.0 g 蛋白胨 5.0 g 牛肉膏 3.0 g 酵母浸膏 3.0 g 氯化鈉 30.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亞鐵（FeSO4） 0.2 g 苯酚紅 0.024 g 硫代硫酸鈉（Na2S2O3） 0.3 g 瓊脂 12.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.4.2 制法 將A.4.1中成分溶于蒸餾水中， 校正pH至7.40.2。 分裝到適當容量的試管中。 121 高壓滅菌15 min。制成高層斜面，斜面長4 cm5 cm，高層深度為2 cm3 cm。 A.5 嗜鹽性試驗培養(yǎng)基 A.5.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 氯化鈉 按不同量加入 蒸餾水 1 000.0 mL A.5.2 制法 將 A.5.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.20.2，共配制 5 瓶，每瓶 100 mL。每瓶分別加入不同量的氯化鈉： （1）不加； （2）3 g； （3）6 g； （4）8g； （5）10 g。分裝試管，121 高壓滅菌 15 min。 A.6 3氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基 A.6.1 成分 牛肉膏 5.0 g GB 4789.72013 9 蛋白胨 10.0 g 氯化鈉 30.0 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O） 2.0 g 甘露醇 5.0g 溴麝香草酚藍 0.024 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.6.2 制法 將 A.6.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.40.2，分裝小試管，121 高壓滅菌 10 min。 A.6.3 試驗方法 從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于 36 1 培養(yǎng)不少于 24 h，觀察結(jié)果。甘露醇陽性者培養(yǎng)物呈黃色，陰性者為綠色或藍色。 A.7 3氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基 A.7.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 溴甲酚紫 0.02 g L-賴氨酸 5.0 g 氯化鈉 30.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.7.2 制法 除賴氨酸以外的成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 6.80.2。再按 0.5的比例加入賴氨酸，對照培養(yǎng)基不加賴氨酸。分裝小試管，每管 0.5 mL，121 高壓滅菌 15 min。 A.7.3 試驗方法 從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于 36 1 培養(yǎng)不少于 24 h，觀察結(jié)果。賴氨酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿中和葡萄糖產(chǎn)酸，故培養(yǎng)基仍應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應(yīng)為黃色。 A.8 3氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基 A.8.1 成分 多胨 7.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 5.0 g 氯化鈉 30.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL GB 4789.72013 10 A.8.2 制法 將 A.8.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 6.90.2，分裝試管，121 高壓滅菌 15 min。 A.9 3氯化鈉溶液 A.9.1 成分 氯化鈉 30.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.9.2 制法 將氯化鈉溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.20.2，121 高壓滅菌 15 min。 A.10 我妻氏血瓊脂 A.10.1 成分 酵母浸膏 3.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化鈉 70.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 5.0 g 甘露醇 10.0 g 結(jié)晶紫 0.001 g 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.10.2 制法 將 A.10.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.00.2，加熱至 100 ，保持 30 min，冷至 45 50 ，與 50 mL 預(yù)先洗滌的新鮮人或兔紅細胞（含抗凝血劑）混合，傾注平板。干燥平板，盡快使用。 A.11 氧化酶試劑 A.11.1 成分 N,N,N,N-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 1.0 g 蒸餾水 100.0 mL A.11.2 制法 將N,N,N,N-四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中，2 5 冰箱內(nèi)避光保存，在7 d之內(nèi)使用。 A.11.3 試驗方法 用細玻璃棒或一次性接種針挑取新鮮（24 h）菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上。如果濾紙在10 s 之內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，即為氧化酶試驗陽性。不變色為氧化酶試驗陰性。 A.12 革蘭氏染色液 GB 4789.72013 11 A.12.1 結(jié)晶紫染色液 A.12.1.1 成分 結(jié)晶紫 1.0 g 95乙醇 20.0 mL 1草酸銨水溶液 80.0 mL A.12.1.2 制法 將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。 A.12.2 革蘭氏碘液 A.12.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化鉀 2.0 g 蒸餾水 300.0 mL A.12.2.2 制法 將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300 mL。 A.12.3 沙黃復染液 A.12.3.1 成分 沙黃 0.25 g 95乙醇 10.0 mL 蒸餾水 90.0 mL A.12.3.2 制法 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 A.12.4 染色法 A.12.4.1 將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1 min，水洗。 A.12.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.12.4.3 滴加 95%乙醇脫色，約 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。 A.12.4.4 滴加復染液，復染 1 min。水洗、待干、鏡檢。 A.13 ONPG試劑 A.13.1 緩沖液 A.13.1.1 成分 磷酸二氫鈉（NaH2PO4H2O） 6.9 g 蒸餾水加至 50.0 mL A.13.1.2 制法 GB 4789.72013 12 將磷酸二氫鈉溶于蒸餾水中，校正pH至7.0。緩沖液置2 5 冰箱保存。 A.13.2 ONPG溶液 A.13.2.1 成分 鄰硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG） 0.08 g 蒸餾水 15.0 mL 緩沖