GB5009.85-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B2的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9 .8 52 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B2的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.8 52 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T5 0 0 9.8 52 0 0 3 食品中核黃素的測定 、G B/T9 6 9 5.2 82 0 0 8 肉與肉制品 維生素B2含量測定 、G B/T7 6 2 92 0 0 8 谷物中維生素B2測定 和G B5 4 1 3.1 22 0 1 0 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T5 0 0 9.8 52 0 0 3相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B2的測定” ; 增加了高效液相色譜法; 刪除了微生物法。G B5 0 0 9.8 52 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B2的測定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中維生素B2的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法為高效液相色譜法, 第二法為熒光分光光度法, 適用于各類食品中維生素B2的測定。第一法 高效液相色譜法2 原理試樣在稀鹽酸環(huán)境中恒溫水解, 調(diào)p H至6.06.5, 用木瓜蛋白酶和高峰淀粉酶酶解, 定容過濾后,濾液經(jīng)反相色譜柱分離, 高效液相色譜熒光檢測器檢測, 外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 鹽酸(HC l) 。3.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。3.1.3 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.4 三水乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。3.1.5 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.6 木瓜蛋白酶: 活力單位1 0U/m g。3.1.7 高峰淀粉酶: 活力單位1 0 0U/m g, 或性能相當(dāng)者。3.2 試劑配制3.2.1 鹽酸溶液(0.1m o l/L) : 吸取9m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。3.2.2 鹽酸溶液(1+1) : 量取1 0 0m L鹽酸, 緩慢倒入1 0 0m L水中, 混勻。3.2.3 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取4g氫氧化鈉, 加9 0m L水溶解, 冷卻后定容至1 0 0m L。3.2.4 乙酸鈉溶液(0.1 m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取1 3.6 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0 m L水溶解, 用水定容至10 0 0m L。3.2.5 乙酸鈉溶液(0.0 5m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取6.8 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0m L水溶解, 用冰乙酸調(diào)p H至4.05.0, 用水定容至10 0 0m L。3.2.6 混合酶溶液: 準(zhǔn)確稱取2.3 4 5g木瓜蛋白酶和1.1 7 5g高峰淀粉酶, 加水溶解后定容至5 0m L。臨用前配制。G B5 0 0 9.8 52 0 1 62 3.2.7 鹽酸溶液(0.0 1 2m o l/L) : 吸取1m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品維生素B2(C1 7H2 0N4O6,C A S號:8 3 - 8 8 - 5) : 純度9 8%。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 0 0g/m L) : 將維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品置于真空干燥器或裝有五氧化二磷的干燥器中干燥處理2 4h后, 準(zhǔn)確稱取1 0m g( 精確至0.1m g) 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品, 加入2m L鹽酸溶液(1+1) 超聲溶解后, 立即用水轉(zhuǎn)移并定容至1 0 0m L。混勻后轉(zhuǎn)移入棕色玻璃容器中, 在4冰箱中貯存, 保存期2個月。標(biāo)準(zhǔn)儲備液在使用前需要進(jìn)行濃度校正, 校正方法參見附錄A。3.4.2 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液(2.0 0g/m L) : 準(zhǔn)確吸取2.0 0m L維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。臨用前配制。3.4.3 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)系列工作液: 分別吸取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液0.2 5 m L、0.5 0 m L、1.0 0 m L、2.5 0m L、5.0 0m L, 用水定容至1 0m L, 該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.0 5g/m L、0.1 0g/m L、0.2 0g/m L、0.5 0g/m L、1.0 0g/m L。臨用前配制。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀: 帶熒光檢測器。4.2 天平: 感量為1m g和0.0 1m g。4.3 高壓滅菌鍋。4.4 p H計: 精度0.0 1。4.5 渦旋振蕩器。4.6 組織搗碎機。4.7 恒溫水浴鍋。4.8 干燥器。4.9 分光光度計。5 分析步驟5.1 試樣制備取樣品約5 0 0g, 用組織搗碎機充分打勻均質(zhì), 分裝入潔凈棕色磨口瓶中, 密封, 并做好標(biāo)記, 避光存放備用。稱取2g 1 0g( 精確至0.0 1g) 均質(zhì)后的試樣( 試樣中維生素B2的含量大于5g) 于1 0 0m L具塞錐形瓶中, 加入6 0m L的0.1m o l/L鹽酸溶液, 充分搖勻, 塞好瓶塞。將錐形瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi), 在1 2 1下保持3 0m i n, 冷卻至室溫后取出。用1m o l/L氫氧化鈉溶液調(diào)p H至6.06.5, 加入2m L混合酶溶液, 搖勻后, 置于3 7培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋中過夜酶解。將酶解液轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 用濾紙過濾或離心, 取濾液或上清液, 過0.4 5m水相濾膜作為待測液。注:操作過程應(yīng)避免強光照射。不加試樣, 按同一操作方法做空白試驗。5.2 儀器參考條件a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 填料粒徑5m, 或相當(dāng)者;G B5 0 0 9.8 52 0 1 63 b) 流動相: 乙酸鈉溶液(0.0 5m o l/L)-甲醇(6 53 5) ;c) 流速:1m L/m i n;d) 柱溫:3 0;e) 檢測波長: 激發(fā)波長4 6 2n m, 發(fā)射波長5 2 2n m;f) 進(jìn)樣體積:2 0L。5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中, 測定相應(yīng)的峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo), 以峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.4 試樣溶液的測定將試樣溶液注入高效液相色譜儀中, 得到相應(yīng)的峰面積, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中維生素B2的濃度。5.5 空白試驗要求空白試驗溶液色譜圖中應(yīng)不含待測組分峰或其他干擾峰。6 分析結(jié)果的表述試樣中維生素B2的含量按式(1) 計算:X=Vm1 0 010 0 0(1) 式中:X 試樣中維生素B2( 以核黃素計) 的含量, 單位為毫克每百克(m g/1 0 0g) ; 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試樣中維生素B2的濃度, 單位為微克每毫升(g/m L) ;V 試樣溶液的最終定容體積, 單位為毫升(m L) ;m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;1 0 0 換算為1 0 0克樣品中含量的換算系數(shù);10 0 0 將濃度單位g/m L換算為m g/m L的換算系數(shù)。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。8 其他當(dāng)取樣量為1 0.0 0g時, 方法檢出限為0.0 2m g/1 0 0g, 定量限為0.0 5m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.8 52 0 1 64 第二法 熒光分光光度法9 原理維生素B2在4 4 0n m5 0 0n m波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強度與維生素B2的濃度成正比。在波長5 2 5n m下測定其熒光強度。試液再加入連二亞硫酸鈉, 將維生素B2還原為無熒光的物質(zhì), 然后再測定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強度, 兩者之差即為試樣中維生素B2所產(chǎn)生的熒光強度。1 0 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 0.1 試劑1 0.1.1 鹽酸(HC l) 。1 0.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。1 0.1.3 氫氧化鈉(N a OH) 。1 0.1.4 三水乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。1 0.1.5 木瓜蛋白酶: 活力單位1 0U/m g。1 0.1.6 高峰淀粉酶: 活力單位1 0 0U/m g, 或性能相當(dāng)者。1 0.1.7 硅鎂吸附劑:5 0m1 5 0m。1 0.1.8 丙酮(CH3C O CH3) 。1 0.1.9 高錳酸鉀(KM n O4) 。1 0.1.1 0 過氧化氫(H2O2) :3 0%。1 0.1.1 1 連二亞硫酸鈉(N a2S2O4) 。1 0.2 試劑配制1 0.2.1 鹽酸溶液(0.1m o l/L) : 吸取9m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。1 0.2.2 鹽酸溶液(1+1) : 量取1 0 0m L鹽酸, 緩慢倒入1 0 0m L水中, 混勻。1 0.2.3 乙酸鈉溶液(0.1 m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取1 3.6 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0 m L水溶解, 用水定容至10 0 0m L。1 0.2.4 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取4g氫氧化鈉, 加9 0m L水溶解, 冷卻后定容至1 0 0m L。1 0.2.5 混合酶溶液: 準(zhǔn)確稱取2.3 4 5g木瓜蛋白酶和1.1 7 5g高峰淀粉酶, 加水溶解后定容至5 0m L。臨用前配制。1 0.2.6 洗脫液: 丙酮-冰乙酸-水(5+2+9, 體積比) 。1 0.2.7 高錳酸鉀溶液(3 0g/L) : 準(zhǔn)確稱取3g高錳酸鉀, 用水溶解后定容至1 0 0m L。1 0.2.8 過氧化氫溶液(3%) : 吸取1 0m L3 0%過氧化氫, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。1 0.2.9 連二亞硫酸鈉溶液(2 0 0g/L) : 準(zhǔn)確稱取2 0g連二亞硫酸鈉, 用水溶解后定容至1 0 0m L。此溶液用前配制, 保存在冰水浴中,4h內(nèi)有效。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品維生素B2(C1 7H2 0N4O6,C A S號:8 3 - 8 8 - 5) : 純度9 8%。G B5 0 0 9.8 52 0 1 65 1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 0 0g/m L) : 將維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品置于真空干燥器或裝有五氧化二磷的干燥器中干燥處理2 4h后, 準(zhǔn)確稱取1 0m g( 精確至0.1m g) 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品, 加入2m L鹽酸溶液(1+1) 超聲溶解后, 立即用水轉(zhuǎn)移并定容至1 0 0m L?；靹蚝筠D(zhuǎn)移入棕色玻璃容器中, 在4冰箱中貯存, 保存期2個月。標(biāo)準(zhǔn)儲備液在使用前需要進(jìn)行濃度校正, 校正方法參見附錄A。1 0.4.2 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 0g/m L) : 準(zhǔn)確吸取1 0m L維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。在4冰箱中避光貯存, 保存期1個月。1 0.4.3 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1g/m L) : 準(zhǔn)確吸取1 0m L維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液, 用水定容至1 0 0m L。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0 0g維生素B2。在4冰箱中避光貯存, 保存期1周。1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 熒光分光光度計。1 1.2 天平: 感量為1m g和0.0 1m g。1 1.3 高壓滅菌鍋。1 1.4 p H計: 精度0.0 1。1 1.5 渦旋振蕩器。1 1.6 組織搗碎機。1 1.7 恒溫水浴鍋。1 1.8 干燥器。1 1.9 維生素B2吸附柱。1 2 分析步驟1 2.1 試樣制備1 2.1.1 試樣的水解取樣品約5 0 0g, 用組織搗碎機充分打勻均質(zhì), 分裝入潔凈棕色磨口瓶中, 密封, 并做好標(biāo)記, 避光存放備用。稱取2g 1 0g( 精確至0.0 1g, 約含1 0g 2 0 0g維生素B2) 均質(zhì)后的試樣于1 0 0m L具塞錐形瓶中, 加入6 0m L0.1m o l/L的鹽酸溶液, 充分搖勻, 塞好瓶塞。將錐形瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi), 在1 2 1下保持3 0m i n, 冷卻至室溫后取出。用氫氧化鈉溶液調(diào)p H至6.06.5。1 2.1.2 試樣的酶解加入2m L混合酶溶液, 搖勻后, 置于3 7培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋中過夜酶解。1 2.1.3 過濾將上述酶解液轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 用干濾紙過濾備用。此提取液在4冰箱中可保存一周。注:操作過程應(yīng)避免強光照射。1 2.2 氧化去雜質(zhì)視試樣中核黃素的含量取一定體積的試樣提取液( 約含1g1 0g維生素B2) 及維生素B2標(biāo)準(zhǔn)G B5 0 0 9.8 52 0 1 66 使用溶液分別置于2 0m L的帶蓋刻度試管中, 加水至1 5m L。各管加0.5m L冰乙酸, 混勻。加0.5m L3 0g/L高錳酸鉀溶液, 搖勻, 放置2m i n, 使氧化去雜質(zhì)。滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴, 直至高錳酸鉀的顏色褪去。劇烈振搖試管, 使多余的氧氣逸出。1 2.3 維生素B2的吸附和洗脫1 2.3.1 維生素B2吸附柱硅鎂吸附劑約1g用濕法裝入柱, 占柱長1/22/3( 約5c m) 為宜( 吸附柱下端用一小團(tuán)脫脂棉墊上) , 勿使柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡, 調(diào)節(jié)流速約為6 0滴/m i n。注:可使用等效商品柱。1 2.3.2 過柱與洗脫將全部氧化后的樣液及標(biāo)準(zhǔn)液通過吸附柱后, 用約2 0m L熱水淋洗樣液中的雜質(zhì)。然后用5m L洗脫液將試樣中維生素B2洗脫至1 0m L容量瓶中, 再用3m L4m L水洗吸附柱, 洗出液合并至容量瓶中, 并用水定容至刻度, 混勻后待測定。1 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精確吸取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)使用液0.3m L、0.6m L、0.9m L、1.2 5m L、2.5m L、5.0m L、1 0.0m L、2 0.0m L( 相當(dāng)于0.3g、0.6g、0.9g、1.2 5g、2.5g、5.0g、1 0.0g、2 0.0g維生素B2) 或取與試樣含量相近的單點標(biāo)準(zhǔn)按1 2.2和1 2.3操作。1 2.5 試樣溶液的測定于激發(fā)光波長4 4 0n m, 發(fā)射光波長5 2 5n m, 測量試樣管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值。待試樣管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值測量后, 在各管的剩余液( 約5m L7m L) 中加0.1m L2 0%連二亞硫酸鈉溶液, 立即混勻, 在2 0s內(nèi)測出各管的熒光值, 作各自的空白值。1 3 分析結(jié)果的表述試樣中維生素B2的含量按式(2) 計算:X=(A-B)S(C-D)mf1 0 010 0 0(2) 式中:X 試樣中維生素B2( 以核黃素計) 的含量, 單位為毫克每百克(m g/1 0 0g) ;A 試樣管的熒光值;B 試樣管空白熒光值;S 標(biāo)準(zhǔn)管中維生素B2的質(zhì)量, 單位為微克(g) ;C 標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值;D 標(biāo)準(zhǔn)管空白熒光值;m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;f 稀釋倍數(shù);1 0 0 換算為1 0 0克樣品中含量的換算系數(shù);10 0 0 將濃度單位g/1 0 0g換算為m g/1 0 0g的換算系數(shù)。計算結(jié)果保留至小數(shù)點后兩位。G B5 0 0 9.8 52 0 1 67 1 4 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。1