GB 9695.16-1988 肉與肉制品 四環(huán)素族抗生素殘留量檢驗(yàn).pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)肉與肉制品四環(huán)素族U D C6 8 7 . 5 1 ; . 5 2材 8 . 0 6抗生素殘留量檢 驗(yàn)GB 9 69 5. 16 一 a sMe a t a n d m e a t p r o d u c t s -Me t h o d f o rt h e e x a mi n a t i o n o f t h e r e s i d u e s o f t e t r a c y c l i n e s1 主皿內(nèi)容與適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肉和肉制品中四 環(huán)素族抗生素殘留量的檢驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉和肉制品中四 環(huán)紊族抗生素殘留量的檢驗(yàn)。2 引 用標(biāo)準(zhǔn) G B 9 6 9 5 . 1 9 肉與肉制品 取樣方法3 原理 四 環(huán)素族 ( 四環(huán)素、土霉素、 金霉素)抗生素具有很強(qiáng)的 抑菌作用。在接有特定微生物的平 板培養(yǎng)基上放人牛津 杯， 在牛津杯內(nèi)加滿試樣溶液，培養(yǎng)后測(cè)最抑菌圈的大小。4 . 1試劑 與培養(yǎng)基 試劑:4 . 1 . 1 磷酸鹽緩沖液 ( p H 4 . 5 ) 精確稱取碑酸二氫鉀 ( G B 1 2 7 4 ， 分析純)1 3 . 6 8 , 溶解于蒸餾水中，定容到l 0 0 0 m L , 高壓滅菌1 1 5 C , 3 0 m i n ，冷卻 后置4 冰 箱內(nèi)保 存。4 . 1 . 2 生理鹽水稱 取氮化鈉 ( G B 1 2 6 6 ) 8 . 5 9 溶解于1 0 0 0 m L 蒸 餾水中，高壓滅菌1 1 5 0C , 3 0 m i n ,4 . 1 . 8 鹽酸 ( GB 6 2 2 ) : O . I m o l / L 溶液。4 . 1 . 4 標(biāo)準(zhǔn)四環(huán)素原液:精確稱取四環(huán)素5 0 m g ， 用。 . l m o l / L 鹽酸 1 m L 溶解， 用水定容到1 0 0 0 m L ， 在4 冰箱中可保存一周。4 . 2 培養(yǎng)基:4 . 2 . 1 菌種培養(yǎng)基: 胰蛋白 陳l 0 . O g 牛肉 膏5 . 0 g 抓化鈉 ( G B 1 2 6 6 ) 2 . 5 g 瓊脂1 4 . 0 一1 6 . 0 g 燕 餾水l 0 0 0 m L 將以 上成分加熱 溶解，高壓滅 菌1 2 1 0C 1 5 m i n ， 最終p H 6 . 5 1 0 . 1 ,4 . 2 . 2 檢定用培養(yǎng)基: 胰蛋白 陳6 . 0 g 牛肉膏1 . 5 9 酵母 膏3 . 0 g 瓊脂1 4 . 0 - 1 6 . 0 g中華人民共和國(guó)商業(yè)部1 9 . 一0 2 一 2 5 批準(zhǔn)1 9 8 9 一 0 3 一 0 1 實(shí)施Gs 9 6 9 5， i 6 一 I 7蒸餾水1 0 0 0 m L 將以上成分加 熱 溶解，高 壓滅菌1 2 1 C 1 5 m i n ,最 終p H 5 . 8 士 。 . 1 ,5 儀器和設(shè)備5 . 1 培養(yǎng)皿:內(nèi)徑9 0 m m ，底部平整光 滑，具陶質(zhì)蓋。5 . 2 牛津杯:內(nèi)徑6 1 O . I m m ，外徑7 . 8 1 0 . 1 - m ,高 度1 0 1 0 . 1 m m .5 . 3 游標(biāo)卡尺:測(cè)量抑菌圈直徑用。與 . 4 均質(zhì)器。石 . 6 離， L . 、 機(jī)。5 . 恒溫水浴。5 . 了 恒溫培養(yǎng)箱。5 二 電 熱于 烤箱1 7 0 1 0 . 1 0C ,6 試樣6 . 16 . 2按G B 9 6 9 5 . 1 9 取 樣。至少取有代表性試樣2 0 0 g ，用絞肉機(jī)絞 2 次混勻， 放在封閉容器中于冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?，試樣要盡快分析。7 分析步驟7 . 1 檢樣液的制備 稱取試樣1 0 . 0 g ， 加入。 . I m o l / L 磷酸緩沖液2 0 m L 小心攪勻放置6 0 m i n , 然 后于均質(zhì)器中均質(zhì)( 3 0 0 0一6 0 0 0 r / m i n ) 1 m i n , 經(jīng)4 O O O r / m i n 離心I O m i n ， 其上清液為檢樣液。7 . 2 菌液和檢定用平 板的制備7 . 2 . 1 菌液的制備 菌種: 蠟樣芽抱桿菌 ( B a c c e r e u s A T C C 1 1 7 7 8 )由衛(wèi)生部藥品生物制品檢 定所提供。 將菌種移種于盛 有3 0 0 m L 菌 種培養(yǎng)基的克氏 瓶中， 于3 0 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)7 天。 鏡檢 芽抱 數(shù)達(dá) 到8 5 0/ o以上，用生理鹽水2 5 m L 洗下菌谷，置6 5 C 恒溫水浴中加 熱3 0 m i n ， 離心( 2 0 0 0 r / m i n ) 2 0 m i n ， 棄去上清液，如此重復(fù)洗滌芽抱懸液三次。 再置于6 5 0C 恒溫水浴加 熱3 0 m i n ， 然 后取生理鹽水5 0 m L 制成芽抱懸液。置4 冰箱中 可保存一個(gè)月。7 . 2 . 2 蠟樣芽抱桿菌懸液用量的測(cè)定 在實(shí)際檢 定前先試幾個(gè)平 板， 即把 不同濃度的芽抱懸液加人檢 定用培養(yǎng)基中， 使0.051+g/-L濃 度的標(biāo)準(zhǔn)四環(huán)素 溶液可產(chǎn)生1 2 m m 以上的清晰、 完整的 抑菌圈作為最適芽抱用量。 一般用最為每1 0 0 m L 檢定用培養(yǎng)基內(nèi)加芽袍懸液0 . 5 一1 . O m L , 1 . O m L菌懸液中含芽抱數(shù)約為l o c o7 . 2 . 8 檢定用平板的制備 將適量芽抱懸液加人溶化后冷卻至5 5 一6 0 的檢定用培養(yǎng)基中 混勻。 每個(gè)平皿內(nèi)加人培養(yǎng)基6 m L ,前后搖動(dòng)平皿， 使含有芽抱的檢定培養(yǎng) 基均勻彼蓋 于平皿表面， 置水平位置上蓋 上陶質(zhì)蓋 ， 待凝固 后，于 每 個(gè)平 板的培養(yǎng) 表 面放 置6 個(gè)牛 津 杯， 使牛津 杯在半 徑 為2 . 8 c m 的 圓面 上 成6 0 度角 的間 距。 所用 平板須當(dāng)天制備。了 . 3 檢定7 . 8 . 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 四環(huán)素稀釋液: 取原液用0 . 1 m o l / L 磷酸鹽緩沖溶液稀釋成0 . 0 2 5 , 0 . 0 5 0 , 。 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 , 0 . 4 0 0 ,0 . 8 0 0 R g / m L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ( 當(dāng)天用當(dāng)天稀釋) 。 取檢定用平板1 8 個(gè)，分成6 組，每組3 個(gè)平 板作為平 行試驗(yàn)。第一組于每個(gè)平板的6 個(gè)牛津 杯中分別加滿。 . 0 2 5 p g / m L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照組。第二 到第 六組于每個(gè)平板上的6 個(gè)牛津 杯中，間隔加GB 9 6 9 5. 1 6 一 8 8滿0 . 2 ( 0 11 9 m L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參考。各組余一 F 的牛津杯， 根據(jù)組別順序依次加滿0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 ,0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 W g i - L 的 標(biāo)準(zhǔn)溶液， 經(jīng)培養(yǎng)后，以 各組 抑菌 圈直 徑的校正平均值 繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 抑菌 圈直 徑校正值 ( m m )等于2 一6 組 ( 0 . 2 0 0 1 1 9 / - L ) 抑菌圈直徑的平均值減去各組抑菌圈直徑平均值。用此校正值校正0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 P g / m L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的抑菌圈直徑平均值。 校正 后的值，包 括0 . 2 0 0 W g i m L 濃度的平 均值在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖， 以 抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)( 算術(shù)級(jí)) ，以濃度為縱坐標(biāo) ( 對(duì)數(shù)級(jí)) ，通過(guò)下列公式繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線二 ( 3 a + 2 b +c 一e ) 1 5= ( 3e +2d +c一a) ， 5LH式i l l : L -標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度的抑菌圈直徑;a , b , e 相應(yīng)濃度是0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 A 0 0 1 g / m L , H-標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度的抑菌圈直徑;a , d , e 相應(yīng)濃度是。 . 0 5 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 1 g / m L o c參考濃度 ( 0 . 2 0 0 1t g / m L )的4 5 個(gè)抑菌圈直徑的平均值。7 . 3 . 2 試樣中四環(huán)素族抗生素殘留量的檢定 每份試樣取3 個(gè)檢定用平 板，在每個(gè)檢定用板上， 間隔的3 個(gè)牛津 杯內(nèi)加滿四 環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)參 考濃度溶液。另外3 個(gè)牛津 杯加滿被檢試樣液， 將陶質(zhì)蓋重新蓋好，置3 0 士1 培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)1 7 士1 h 。 除去牛津 杯翻 轉(zhuǎn)平 板，精確的測(cè)量產(chǎn)生的抑菌翔直徑 ( 精確到0 . 1 m m ) 。 分別求出3 個(gè)