生物化學技術2沉淀法.ppt

第二章 沉 淀 法,沉淀法是分離純化生命大分子物質常用的一種經(jīng)典方法；其特點是：操作簡單，成本低廉 常見的方法有鹽析、有機溶劑沉淀、蛋白質沉淀、PEG沉淀、選擇性沉淀、結晶沉淀等,掌握沉淀法的基本原理及影響因素 掌握沉淀類型及其在制備蛋白質、核酸中作用原理 熟悉沉淀法在制備蛋白質和核酸過程中的實際運用,目 的,第一節(jié) 基本原理與沉淀類型,一、基本原理,根據(jù)同一溶劑中有效成分與雜質溶解度差異。選用某種溶液系統(tǒng)，使所需有效成分出現(xiàn)最大溶解度，而雜質出現(xiàn)最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式析出，達到有效成分與雜質分離的目的,根據(jù)蛋白質和核酸在組成、結構及性質等方面的明顯差異，所以從生物材料中提取制備這兩類物質，一般選用的試劑和操作方法也不完全相同,二、制備蛋白質,（一）鹽析法,1.原理,蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶）；但當鹽濃度增加到一定數(shù)值時，其溶解度有隨鹽濃度逐漸下降，直至蛋白質析出（鹽析）,鹽析的內因是當鹽濃度達到一定程度時，水的活度降低，導致蛋白質分子表面電荷中和，水化膜相繼破壞，蛋白質分子聚集而析出沉淀,2.基本步驟,選擇一定濃度的鹽溶液，使部分雜質“鹽析”，有效成分“鹽溶”（025%的（NH4）2SO4） 離心分離上清 再調一定濃度鹽（2560%飽和鹽溶液），使有效成分“鹽析” 離心收集沉淀物，即為初步純化的有效成分,（1）鹽分級沉淀,鹽的選擇：在蛋白質鹽析時，常選用的鹽是（NH4）2SO4,（NH4）2SO4的優(yōu)點：溶解度大；對溫度不敏感；分離效果好（如有時一次可除去75%的雜蛋白）； （NH4）2SO4本身有穩(wěn)定蛋白質結構的作用；價格低廉；廢液還可作肥料 缺點：與其他鹽一樣，若需進一步純化，需脫鹽處理, （NH4）2SO4鹽析,固體法,在大體積的粗提液中逐漸加入固體（NH4）2SO4，邊加邊攪拌，緩緩加入。在此過程中，溶液（NH4）2SO4的濃度不斷升高，水分子不斷與（NH4）2SO4結合，當加入的（NH4）2SO4達到鹽析點時，蛋白質就會沉淀出來,例：在尿素酶抽提液中加入（NH4）2SO4，當飽和度達為35%時，尿素酶基本留在溶液中；但當飽和度達到55%時，尿素酶幾乎全部沉淀 至于蛋白質溶液中加多少（NH4）2SO4使其飽和度符合蛋白質鹽析，可查表2-2，或用下列公式計算：,（20）,（25 ）,表示一升溶液中需加入的（NH4）2SO4的克數(shù),硫 酸 銨 對 尿 素 酶 的 沉 淀 作 用,調 整 硫 酸 銨 溶 液 飽 和 度 計 算 表,飽和溶液法,在pro溶液中加入預先調好的飽和（NH4）2SO4溶液，不同的飽和度所需的（NH4）2SO4的量用下式計算：,表示需加入（NH4）2SO4溶液的體積（ml）,表示原來溶液的體積,表示始、終鹽的飽和度,表示需加入（NH4）2SO4溶液的飽和度,此法較固體法溫和，但不宜用于大體積樣品；否則引起樣品液體積增加，計算不準確。不能達到預期的目的,透吸法,將裝有pro溶液的透吸袋放入一定濃度大體積鹽溶液中，利用半透膜透吸改變pro溶液中的鹽濃度 由于此法的鹽濃度是以連續(xù)狀態(tài)變化的，可避免局部鹽濃度過高而產生的不良影響；所以分離效果好 但透吸袋體積有限，鹽析速度緩慢，（NH4）2SO4消耗多等原因，致使此法僅用于要求較精確、樣品體積小的試驗過程中，難于放大,（2）制作鹽析曲線,用鹽析法沉淀分離pro樣品是，（NH4）2SO4的“鹽析”濃度很關鍵，所需的濃度范圍要通過具體試驗確定： 取一定體積已測含量的pro或酶的待分離溶液，調pH至穩(wěn)定范圍 分610次加入不同量的（NH4）2SO4至出現(xiàn)渾濁時，分離上清；如此反復610次，分別收集每次的沉淀 根據(jù)每次沉淀的pro或酶的量和相應的（NH4）2SO4濃度之間作圖，即得鹽析曲線（如圖2-1） 參照表2-3的分級試驗方法，再根據(jù)所用生物材料來源的難易程度，以及對有效成分純度和得率的要求，先找出有利于提高純化倍數(shù)或得率的大致框架，然后經(jīng)過反復試驗就能確定最佳鹽析范圍（即（NH4）2SO4 的濃度范圍） 但若生物材料來源容易，主要考慮提高純化倍數(shù)，得率高低可視為次要因數(shù)，若材料來源困難，則主要考慮得率,典 型 鹽 析 曲 線,由表可知，若生物材料來源容易，主要是考慮提高純化倍數(shù)時，選擇48%65%鹽飽和分級范圍，酶的純化倍數(shù)可達3.0，而得率僅為75%；若生物材料來源較困難，主要是考慮提高收得率時，則選擇45%70%甚至45%75%鹽飽和分級范圍，酶的收得率可達80%以上，而純化倍數(shù)將2.4,（3）影響鹽析的因素,鹽析常數(shù)（Ks）,每種pro在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度之間存在如下關系 S表示有效成分在水中的溶解度; M表示摩爾濃度; Ks表示有效成分在特定條件下的恒定值,Ks值越大,則意味著有效成分溶解度降低的速度隨著鹽濃度的增加而快速降低;因此,對一種有效成分而言, Ks值越大，分級范圍就越窄，鹽析效果就越好。 Ks還受pro本身的性質、溶液的pH、溫度及鹽的種類等因素的影響,在pH7.0溶液中幾種蛋白質的和KS常數(shù) （溶解度S以mg/ml表示）,鹽分級范圍的差異性,在pro分離過程中，若每一種pro的Ks都很大，分離效果不一定好。因為鹽析效果還與鹽析范圍的差異性有關 各pro的Ks大 + 鹽析范圍差異明顯，則分離效果好； 如圖2-2中AC 各pro的Ks大 + 鹽析范圍差異較小，則分離效果不好；如圖2-2中AB, pH和鹽濃度,有效成分的溶解度會受到pH和鹽濃度的顯著影響 例：兔肌磷酸甘油醛脫氫酶（ pI約8.5）可溶于pH6.0，3.2mmol/L的（NH4）SO4溶液中，但若調節(jié)pH.，則立即產生沉淀這說明選擇適當pH的鹽溶液可提高鹽析的效果,一般來說，在分級鹽析過程中，第一次鹽析時（除去雜質），pH應偏離有效成分的pI值，而接近雜質的pI值；而在第二次鹽析時（沉淀有效成分），pH應調節(jié)至接近有效成分的pI值,蛋白質的純度和濃度,蛋白質存在的形式（均一的還是混合的）和濃度不同，鹽析范圍和溶解度也不一樣。在混合的pro溶液中，不同分子間的相互作用會發(fā)生共沉淀作用。 Pro濃度越高，這種現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差；因此，一般控制樣品液Pro濃度在0.22%之間為宜,其他,在進行鹽析沉淀時，有時需在溶液中加1mmol/L的EDTA-Na2鹽，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。另外，加（NH4）2SO4沉淀的時間要控制好，過長或過短都不宜，一般控制在2h左右,（4）脫鹽,常用方法：凝膠過濾法和透析法,透析操作的注意事項： 透析袋處理：市售透析袋要D.W洗凈，檢查無漏洞時再用。若用來去除某些易被金屬離子或水解酶破壞的樣品中的鹽時，透析袋應用含EDTA-Na2的NaHCO3溶液中煮沸10min；并經(jīng)D.W煮沸、漂洗后再用 透析液的選擇：透析液一般為低離子強度的中性緩沖液。對含有輔基的酶透析時，宜在透析液中加入適量的輔基或保護輔基的試劑。為防止微生物的生長，透析應在4進行或在透析液中添加0.02%的NaN3,(二)有機溶劑沉淀法,1.原理,與鹽溶液一樣具有脫水作用，使Pro表面的水化膜破壞 降低溶劑系統(tǒng)的介電常數(shù)，即降低極性（而蛋白質為水溶性物質）,2.常用有機溶劑：MeOH、EtOH、Me2CO等 3.有機溶劑的使用量：,V表示加入有機溶劑的體積； V0表示蛋白溶液的原始體積 S1表示蛋白溶液中有機溶劑的濃度(體積百分濃度) S2表示蛋白溶液中欲達到的有機溶劑濃度(體積百分濃度) C表示有機溶劑的濃度（如無水EtOH ，則C=100，95% EtOH ，則C=95）,4.注意事項：,中性鹽作用。即在有機溶劑沉淀時，加入適量中性鹽，一方面可增加Pro在有機溶劑中的溶解度，另一方面可防止Pro變性（0.05）；提高分級效果 低溫下操作。因為有機溶劑加入水溶劑中會放熱，若不注意降溫，容易導致Pro變性 多價陽離子作用。有些Pro能和多價陽離子（如Zn+、Cu+等）結合形成復合物，致使Pro在有機溶劑中溶解度降低，這對在高濃度溶劑中才能沉淀的Pro特別有益。如在某些Pro溶液中加入0.0050.02mmol/L的Zn+，就可節(jié)省大量有機溶劑， 使Pro有效得沉淀出來,（三）蛋白質沉淀法,1.堿性蛋白質（多價陽離子的堿性蛋白質）,如：魚精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀Pro 應用：魚精蛋白加入到部分純化的酵母PFK溶液時，溶液中的酶蛋白便會吸附到魚精蛋白核酸沉淀物上；將沉淀物用0.1mol/L磷酸緩沖液洗脫，收集的PFK純度提高了9倍 從深紅螺菌中分離PEP羥基激酶時，加魚精蛋白處理，可除去其中3/4的雜蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中 缺點：多價陽離子的堿性蛋白質不可再利用，且其水溶液pH23，要小心調中性后才能應用,2.凝集素,目前研究得比較清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一種特殊的蛋白質，主要對糖蛋白糖鏈末端序列有特異、明顯的凝集力 例：伴刀豆蛋白對含有G、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異凝集沉淀作用，通過離心可把糖蛋白與一般蛋白質分離開，獲得的凝集素-糖蛋白復合物用單糖作抑制劑即可解離 優(yōu)點：條件溫和，專一性強,3.重金屬,重金屬（Pb2+、Hg2+）也能與蛋白質沉淀，純化Pro。但由于重金屬易使Pro變性，故應用時要控制在較溫和的條件下進行，并及時除去重金屬,(四)PEG沉淀法,此法應用較廣,屬于非離子型聚合物引起的Pro沉淀作用;沉淀條件溫和，不易引起Pro變性，且沉淀較完全 如用20%PEG-6000或57%PEG-400可使-葡萄糖苷酶80%發(fā)生沉淀,（五）選擇性沉淀,利用目的Pro與雜Pro在不同物理化學環(huán)境下的穩(wěn)定性不同（如溫度、酸堿度、有機溶劑等），用選擇性沉淀法，使雜Pro變性沉淀，而目的Pro存在于溶液中或發(fā)生可逆性沉淀，從而使目的Pro得到純化,例：酵母干粉抽提液升溫至55，20min后迅速冷卻，離心除去熱變性的Pro，上清液中為對熱穩(wěn)定的醇脫氫酶 假單胞菌培養(yǎng)液中加 HCl 調pH至4.0，得到堿性脂酶的沉淀,（六）結晶沉淀法,操作：,將欲結晶的物質溶解于適當溶劑中，加入適量的鹽（如2040% （NH4）2SO4 ）或有機溶劑（如EtOH、MeOH等），使其溶解度降低至接近飽和的臨界濃度或剛剛開始出現(xiàn)沉淀 調節(jié)pH至等電點附近，控制溫度4左右，使溶解度進一步降低 放置一段時間（陳化），即可得到結晶沉淀,對于難結晶的物質，有時采用加入少量“晶種”引子，或進行適當攪拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速結晶,三、制備核酸,從生物材料（如動物組織、線粒體、葉綠體，以及微生物中的真菌、細菌和病毒等）中分離出的DNA或RNA，往往是以DNA- Pro（DNP）或RNA- Pro（RNP）復合物的形式存在的，所以制備核酸樣品時，首先需使復合物解聚，釋放出核酸，除去Pro，然后用沉淀法得到核酸,（一）DNP/RNP復合物的解聚,在破細胞溶液中，加入適量的陰離子去污劑SDS或十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉DOC、聚氧乙基十六烷基酚醚、TWeen等，使DNP/RNP解聚釋放出核酸 加入適量醋酸鉀溶液沉淀SDS-pro和SDS-K+等，然后離心除去沉淀 分離上清，即為初步純化的核酸制品,1.加去污劑,2.加有機溶劑,用有機溶劑反復處理抽提液，直至處理液經(jīng)離心后，水相-有機相界面交接出無變性的pro為止 注意有機溶劑的祛除一般用乙醚提取，再在低溫蒸餾除凈乙醚,3.蛋白酶處理,用蛋白水解酶除去復合物中的pro組分，此法條件溫和，一般不會造成對核酸的破壞 常用的pro水解酶有：溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E等,（二）消除多糖等雜質,1.多糖,抽提前用“饑餓法”可減少生物材料中貯存多糖（如淀粉、糖原等）的含量 混雜于核酸提取液中的多糖類雜質，一般用異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，適用于酸性多糖）等選擇性沉淀劑除去；此外，也可用等體積2.5mol/L磷酸緩沖液和等體積乙二醇甲醚處理，經(jīng)離心，多糖位于中部，核酸位于上層乙二醇甲醚中,2.DNA與RNA的分離,鹽析法 DNA：易溶于12mol/LNaCl溶液，難溶于0.14 mol/LNaCl溶液 原理 RNA：易溶于0.14 mol/LNaCl溶液，難溶于12mol/LNaCl溶液 例：從小牛胸腺提取DNA：用0.14 mol/LNaCl溶液反復洗滌、絞碎、離心；結果RNA存在于溶液，DNA存在于沉淀中 酶水解法 在提取DNA時，用RNase水解RNA， RNase中混有的DNase用100熱 處理15min 在提取RNA時，用DNase水解DNA， DNase中混有的RNase，在Ca2+存在條件下，加蛋白酶K作用或加碘乙酸鈉處理，使RNase破壞,（三）核酸沉淀,在核酸溶液中加入某些有機溶劑或非離子型聚合物試劑時，核酸會被有效地沉淀,1.有機溶劑沉淀法,乙醇鹽溶液 操作：在核酸溶液（0.1l/ml）中加入0.1mol/L NaCl 和2倍量體積（DNA）或2.5倍體積（RNA）的冷無水乙醇，就可將核酸沉淀出來 注意：沉淀時間與溫度、核酸分子大小、濃度有關,DNA1kb時，室溫數(shù)分鐘，高速離心即可（16000rpm15min） DNA1k