雜交瘤技術的實驗原理.pptVIP

雜交瘤技術制備單克隆抗體的實驗原理,接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡短命細胞,一、雜交瘤技術產生的3個技術關鍵,1. B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性：,B淋巴細胞(B lymphocytes)：,骨髓瘤細胞 (myeloma cells):,惡性增殖的轉化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活長命細胞。 經篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞株沒有抗體分泌物。,2. 細胞融合技術：,長命 不分泌抗體,分泌抗體 短命,分泌抗體 長命,Khler和Milstein, 1975,1984年Nobel醫(yī)學獎,3. 雜交瘤細胞的篩選 ：,HAT培養(yǎng)基篩選,H, 次黃嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶,A,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase),B淋巴細胞： HGPRT+， TK+,骨髓瘤細胞： HGPRT-， TK-,存活,死亡,外源性途徑(旁路途徑),二、雜交瘤技術的操作流程,1. 動物免疫：,目的： 在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞.,特定目標抗原,動物,免疫,脾臟中B淋巴細胞,B淋巴細胞大量增殖,刺激,能分泌針對于該抗原的特異性抗體,常規(guī)免疫法 脾內一次性免疫法 短程免疫法 體外免疫法,常用免疫方法：,“穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆”,“省時；省抗原”,“省時”,“操作繁瑣”,常規(guī)免疫法：,第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑,(皮下注射或靜脈注射),(皮下注射),(皮下注射),(靜脈注射),二、細胞融合及HAT篩選,病毒介導的細胞融合 PEG介導細胞融合 電激融合,1、細胞融合方法：,細胞懸液的制備與融合,(1) 脾細胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備,(2) 骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數生長期制備,(3) 細胞融合：50%PEG(10004000), pH8.0, 38oC, 1min,2、HAT培養(yǎng)基的篩選,三、抗體的檢測,要求： 簡便、快速、敏感; 在短時間內能檢測大量樣品,常用方法：,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 雙相擴散法,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液,技術原理：,四、克隆化,常用克隆化方法：,有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法,80個細胞/96孔 飼養(yǎng)細胞(feeder cells),ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。,由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的抗體，只針對于一個抗原決定簇單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb