HLADRB1基因對小兒急性腎小球腎炎的影響.doc

HLA-DRB 1 基因對小兒急性腎小球腎炎的影響 作者：焦立新 孫利煒 劉宇奇 【關鍵詞】 急性腎小球腎炎,HLA-DRB,1,基因,ssp/PCR【摘要】 目的 探討急性腎小球腎炎發(fā)生及發(fā)展與HLA-DRB 1 等位基因的關系，尋找該病的HLA-DRB 1 易感基因。方法 采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應方法對急性腎小球腎炎患兒和正常兒童的HLA-DRB 1 等位基因進行分析，并分析了HLA-DRB 1 15基因型在急性腎小球腎炎中所起的作用。結果 急性腎小球腎炎患兒HLA-DRB 1 15基因頻率為（16.25%），與正常對照組比較差異有非常顯著性（P<0.01）;HLA-DRB 1 15型急性腎小球腎炎患兒臨床癥狀表現(xiàn)重。結論 HLA-DRB 1 基因型對急性腎小球腎炎的發(fā)生、發(fā)展有一定的影響;探討急性腎小球腎炎的HLA-DRB 1 基因型對于病情預測有重要意義。關鍵詞 急性腎小球腎炎 HLA-DRB 1 基因 ssp/PCR The influence of HLA gene on acute glomerulonephritis【Abstract】 Objective To study the relation between acute glomerulonephritis occurence and development and HLA gene，then to find HLA predisposing gene of this disease.Methods Using ssp-PCR method to study acute glomerulonephritis patients HLA gene and assay different clinical situations of different HLA gene types.Results The gene frequency of acute glomerulonephritis patients is16.25%.It is significantly higher than normal control group（P<0.01）;Acute glomerulonephritis patients who was HLA-DRB 1 15were more severe.Conclusion The occurrence and the development of children acute glomerulonephritis have some relations with HLA-DRB 1 15.It is important to study HLA gene of children acute glomerulonephritis for judging prognosis. Key words acute glomerulonephritis HLA gene ssp/PCR 目前公認免疫機制是大多數腎小球疾病發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)。其直接證據如:病變腎臟沉著有免疫球蛋白和補體成分，同時腎小球疾病病程中血清有免疫成分的異常。腎小球疾病的免疫發(fā)病機制十分復雜，有多種因素參與。對于免疫發(fā)病機制的研究不僅有其理論意義，還可以指導疾病的防治，具有重要的臨床意義。HLA即人類白細胞抗原也稱人組織相容性抗原系統(tǒng)，是參與機體特異性免疫識別和免疫應答的主要成分 1 。我們對86例急性腎小球腎炎患者和82例健康兒童的HLA-DRB 1 基因進行了分型研究，以期發(fā)現(xiàn)免疫機制在急性腎小球腎炎的發(fā)病機制中所起的作用，現(xiàn)報告如下。1 對象與方法 1.1 對象 觀察組為86例急性腎小球腎炎患兒，男42例，女44例，年齡316歲，診斷標準參照諸福棠第七版實用兒科學有關章節(jié)。對照組82例，男43例，女39例，年齡416歲，排除腎臟疾病，體格檢查及化驗均未見異常。觀察組與對照組均為無血緣關系的漢族兒童。1.2 方法 1.2.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs均為上海復生生物工程公司產品，瓊脂糖為上海東海制藥廠產品。DNA片段長度標準174/HacMarkers為北京鼎國生物工程公司產品。 1.2.2 擴增引物設計與合成 引物按參考文獻 2 所示，見表1，由北京賽百盛生物工程公司合成。 1.2.3 內對照引物 參照參考文獻 2 在DRB1第3內含子內設計，由賽百盛生物工程公司合成，這個引物無位點序列特異性，可以作為內對照，序列如下:5-TGC CAA GTG GAG CAC CCA AA，3-GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT;產生796bp的產物。 1.2.4 陽性細胞DNA 由北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院基因配型室饋贈。 1.2.5 人基因組DNA提取 抽取靜脈血1.0ml，2%EDTA抗凝。分離白細胞采用常規(guī)酚-氯仿方法提取DNA，然后用紫外分光光度計測其濃度。 1.2.6 DRB 1 位點的特異性PCR抗增 通過SSP/PCR進行，一個標本需完成19個PCR反應，方能完成DRB 1 位點的分型。反應混合物包括24個位點或組特異PCR引物，內對照引物濃度很低，約為特異引物濃度的1/3，MgCl 2 10mm Trist-Cl、pH8.3，0.001%明膠，200mm dNTPs，1m位點組特異引物，0.3m內對照引物，2UTaq酶。PCR擴增在TC-1（美國PE公司）擴增儀上完成，循環(huán)條件:先94預變性5min，然后每個循環(huán)包括941min，571min，721min，共35個循環(huán)，然后72保溫5min。 1.2.7 通過瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析 PCR產物的存在及缺失通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行，加2l的6x上樣緩沖液，10l PCR產物，電壓40V，電泳40min，溴化乙啶（0.5g/ml）染色。在紫外分光光度計下觀察結果，拍照。1.2.8 統(tǒng)計學方法 用SAS軟件包進行處理。表1 引物序列、長度及區(qū)分位點略2 結果 2.1 分型結果 DR位點基因共分19個型，其中3與17、18，18與14有交叉，52、53可作為陽性對照，因52可與11、12、13、13、14、14、17、18同時出現(xiàn)陽性帶，53可與4、7、9同時出現(xiàn)陽性帶，分型結果見圖1、2。 圖1 略圖2 略 2.2 腎小球疾病患兒DRB 1 基因型及基因頻率 86例腎小球疾病患者與82例正常人HLA-DRB 1 19個位點基因型及基因頻率見表2，腎小球疾病組HLA-DRB 1 15基因頻率為16.25，與正常對照組（基因頻率4.7）比較 2 =7.028，P<0.01，HLA-DRB 1 15基因陽性發(fā)生急性腎小球腎炎的相對危險性OR為3.494，其他位點兩組間差異無顯著性，見表2。表2 HLA-DRB 1 基因頻率基因型 正常對照組略2.3 腎小球腎炎患兒臨床表現(xiàn) 86例急性腎小球腎炎有11例HLA-DRB 1 15型，其臨床表現(xiàn)浮腫、血尿較非HLA-DRB 1 15型重，基因型與臨床癥狀的關系見表3。 3 討論HLA已經被證實與自身免疫疾病相關聯(lián)，是參與機體特異性免疫識別和免疫應答的主要成份，已知HLA是機體的正常生理識別和免疫應答的主要成分。所以HLA與機體正常的生理功能和病理變化有密切關系，是參與機體特異性免疫識別和免疫應答的主要成分，參與免疫調節(jié)，約束免疫細胞間的相互作用;參與抗原的處理;參與免疫細胞分化;疾病易感基因學說認為在HLA區(qū)域中尤其是HLA-D區(qū)域附近可能存在一些疾病易感基因，這些基因的存在可導致某些疾病，但具體是一位點與一種疾病相關，還是多個位點與一種疾病相關，還不能肯定。 我們這一研究旨在探討小兒急性腎小球腎炎與HLA的相關性。因為經典的HLA-類基因指的是HLA-DR、-DQ、-DP，其中以DR基因位點最多，且迄今所建立的HLA的DNA分型技術也以對HLA-DRB 1 多態(tài)性的分析最為成熟，故我們將研究重點放在HLA-DRB 1 上。表3 急性腎小球腎炎組HLA-DRB 1 15型與臨床表現(xiàn)的關系 （略）對于腎小球疾病，我國兒科應用的分類包括腎小球腎炎、腎病綜合征、單純性血尿或蛋白尿、家族性腎炎等。我們主要研究了急性腎小球腎炎86例。國內尚未見有關報道漢族人群小兒腎小球疾病與HLA-DR位點關聯(lián)的報道。本文對86例急性腎小球腎炎患兒和82例正常人HLA-DR位點基因的多態(tài)性進行調查，結果表明急性腎小球腎炎組HLA-DRB 1 15基因頻率增高，（ 2 =7.028，P<0.05），86例腎小球腎炎有11例HLA-DRB 1 15型，其臨床表現(xiàn)浮腫、血尿較非HLA-DRB 1 15型重，上述結果證實，吉林省漢族小兒腎小球疾病的發(fā)生與HLA-DRB 1 15關聯(lián)。 關于腎小球疾病與HLA關系，最初有人報道小兒原發(fā)性腎病綜合征與一些HLA-B抗原存在弱相關;1976年國外學者Thomson、1980年Alfiler、1990年Clara分別報道腎病綜合征患兒HLA-B12、HLA-DR7較正常對照高。1999年國內肖露露研究認為成人慢性腎小球腎炎與HLA系統(tǒng)免疫機制強相關 3 ，HLA-B 55 、DR 10 、DQ 7 可能是廣東人群易感慢性腎小球腎炎的風險因子。1999年許鈴娣等實驗結果DQB 1 0302等位基因可能與上海漢族IgA腎病的發(fā)病有一定關聯(lián) 4 。我們的研究有所不同，HLA-DRB 1 15可能 是吉林省小兒人群腎小球疾病的易感基因，其原因可能在于我們研究的人群和病種有所不同。通過對患者與正常人的HLA-DR位點的多態(tài)性分析，我們對小兒腎小球疾病有了進一步的認識，各個基因型之間的堿基差異雖然不是很大，但可以導致表達的氨基酸不同，最終引起免疫應答的差異等一系列的變化;隨著對疾病認識的深入，將為我們治療疾病提供科學依據。 參考文獻 1 曹孟德，秦東春，孫含笑.HLA分子生物學及臨床應用.鄭州:河南醫(yī)科大學出版社，1998，148. 2 Olle Olerup，henrik Zetterquist.HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers（PCR-SSP）in2hours:An alternative to serological DR typing in clinical pr