組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化.ppt

酶組織化學(xué)（Enzyme Histochemistry）是利用組織細(xì)胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來檢測酶活性。一般是用凍結(jié)或固定的切片，再一定條件下（具有酶的底物等）全酶進(jìn)行催化作用，產(chǎn)生一種可見產(chǎn)物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對(duì)酶的活性進(jìn)行定位或定量研究。,第二章 酶組織化學(xué),Inruduction,2019/7/10,1, 特點(diǎn)： 在原位檢測 檢測酶的活性而不是酶分子本身 酶的分類：按生物化學(xué)分類六大類 氧化還原酶 轉(zhuǎn)移酶 水解酶 裂解酶 異構(gòu)酶 連接酶 常用檢測方法 1沉淀法 金屬沉淀法：Ca+Co+法；Pb法 偶聯(lián)法：重氮鹽法 靛原法 四唑鹽法,2,2后偶聯(lián)法Post-coupling（ACP） 3合成法 4底物膜法 設(shè)計(jì)半透膜 切片/ 孵育法 影響酶組化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素 酶活性的保存 a）固定：酶組化的固定劑有教嚴(yán)格的限制，不 同的酶適用不同的固定劑 抑制酶活性和細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金 屬鹽Hg、Cr、Pb等不能用做固定劑。 慎用醛,3,b）取材：快捷，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備充分。冰結(jié)切片應(yīng)先備液氮防止酶活性喪失。橫冷箱切片稍固定（丙酮氯仿=11）4，510分鐘，但脂溶性蛋白脫落。 底物濃度 A）量要足夠120 V/ V B）孵育法只能用一次，配制 時(shí)要適量（節(jié)儉） PH和滲透壓 應(yīng)以緩沖液調(diào)節(jié) 溫度控制與時(shí)間：室溫37（40min） 4（510min）,4, 捕獲劑 亦要求一定濃度，要以反應(yīng)原位瞬 時(shí)沉淀。 激活劑與抑制劑（對(duì)照） a）兩者的選擇都應(yīng)具有特異性。 b）要有適當(dāng)?shù)臐舛确秶?時(shí)間：通過實(shí)驗(yàn)自行摸索。任何配方都是一 個(gè)很大的范圍（指時(shí)間），受多種因 素的影響，因藥品的質(zhì)量、環(huán)境因素 的變化而變化。故不可輕信之。 擴(kuò)散：控制反應(yīng)速度，避免擴(kuò)散（冰凍 切片孵育尤應(yīng)注意）,5, 對(duì)照：必須設(shè)立對(duì)照，以防非特異反應(yīng)。 這對(duì)結(jié)果的解釋非常重要。 對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)考慮如下幾個(gè)問題： 經(jīng)過凍結(jié)或固定后組織細(xì)胞破壞，酶究竟 能保留多少？ 酶是否在原位？ 反應(yīng)中多少酶起了作用？ 酶的活性是否代表細(xì)胞生活時(shí)的活性？ 沉淀的產(chǎn)物是否代表酶蛋白分子，時(shí)間延 長，會(huì)不會(huì)改變？ 是否有擴(kuò)散移位,6,一、鈣鈷法顯示堿性磷酸酶 Alkaline Phosphatase （ALP）,原理以天然存在的甘油磷酸鈉為底物，經(jīng)酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為 磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色的硫化鈷沉淀。反應(yīng)式如下：,7,方法 標(biāo)本：大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片（載片） 厚6微米。 固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25 切片標(biāo)本入下列孵育液中，37，5分鐘 孵育液： 3甘油磷酸鈉 6ml 底物 保 2巴比妥鈉 6ml 調(diào)PH 證 2氯化鈣（無水） 9ml 沉淀劑 新 2硫酸鎂 6ml 激活劑 鮮 蒸餾水 3ml 30ml 將孵育液混勻，若渾濁可過濾，調(diào)PH至9.4。, 流水流水洗2分鐘后入蒸餾水 入2硝酸鈷，5分鐘（小腸可3分鐘） 置換 流水洗5分鐘，入蒸餾水。 入0.5硫化胺，2分鐘。 置換 流水洗10分鐘，入蒸餾水。 入Mayer氏蘇木精染液(復(fù)染核)1分鐘 流水洗5分鐘蒸餾水。 甘油明膠或Apathy糖膠封固。,結(jié)果：腎小體（近端小管）刷狀緣、小腸絨毛 紋狀緣和 血管內(nèi)皮出現(xiàn)黑色的硫化鈷沉 淀，顯示ALP活性強(qiáng) 。 ALP為一種膜酶，廣泛存在于腎小管、小腸 絨毛、膀胱、腎上腺、包曼氏囊、肝、脾、 乳腺及 卵巢等細(xì)胞膜，與細(xì)胞的吸收有關(guān)。 對(duì)照 無底物孵育，以蒸餾水代替孵育液中的3 甘油磷酸鈉，其余各步進(jìn)行同上。, 加熱滅活酶活性。 加抑制劑，左旋咪唑0.11.0mmol/L 注意事項(xiàng) Ca2+要足量 硫化鈉（NH4）S 配置成淡黃色，可提供 S2-滴23滴 用水將鈷離子洗凈，以防止出現(xiàn)假陽性。 有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色 素）出現(xiàn)，可影響結(jié)果。 本法可用顯示：5核苷酸酶、肌蛋白 ATPase、ALP,二、鉛法顯示酸性磷酸酶 （Gomori，1950 Lojda，1979）,原理 以甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH下，被ACP水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被S2-置換，最終生成硫酸鉛棕色沉淀。反應(yīng)式如下： 酸性磷酸酶Acid Phosphatas（ACP）, ACP的特性 PH 4.55.5適宜 激活劑：Mn2+ 抑制劑：NaF，有些ACP為Cu2+、酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。 ACP定位 溶酶體（顆粒狀）內(nèi)； 溶酶體外ACP存在于ER和胞液。 該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、 腎上腺。,方法 標(biāo)本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚6 微米。 固定：冰凍片或橫冷箱切片。凍融，有時(shí)也可 用甲醛，但影響活性。 本實(shí)驗(yàn)不固定或固定于丙酮氯仿（11） 混合液，4，25min 步驟： 將標(biāo)本放于下列孵育液中 37， 1015 孵育液：0.1M醋酸緩沖液，PH5.2 15ml 0.24硝酸鉛 15ml,3甘油磷酸鈉 3ml 33ml 混勻，置37水浴中1530分鐘后，過濾。 于37蒸餾水中洗2次，每次1分鐘。（溫 蒸餾水洗） 入5硫化胺，12分鐘。 流水沖洗35分鐘后，換蒸餾水。 （可用Mayer蘇木素復(fù)染核） 用甘油明膠或Apathy氏糖膠封固。,結(jié)果酶活性部位棕黑色硫化鉛沉淀。 分布于腎近曲小管細(xì)胞核周圍，肝細(xì) 胞毛細(xì)膽管周圍均有棕黑色顆粒。 對(duì)照孵育液內(nèi)加0.01M NaF（13.9mg / 33ml）（） 注意事項(xiàng) 鉛離子的濃度 關(guān)鍵問題，沒有底物，有 些組織吸附鉛離子（+），因此必須用NaF 抑制酶活性排除假陽性反應(yīng)。 孵育時(shí)間不可過長，否則染色擴(kuò)散或核染色。,應(yīng)用范圍 “鉛法”適用于：ACP，5-核苷酸酶G6P酶; 膜ATPase MitoATPase TTPase（硫胺素焦磷酸酶） 三、偶氮偶聯(lián)法顯示ACP 原理 以奈酚的衍生物磷酸脂Naphthol ASBL Phosphate為底物，在酸性PH（5.2）下，經(jīng)酸性磷酸酶水解釋放出Naphol ASBI，立即與六氮化對(duì)品紅偶聯(lián)，生成紅色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。,方法 標(biāo)本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚 6 微米。 不固定或固定于丙酮氯仿（11）混 合液內(nèi)，4 ，25min 標(biāo)本入下列孵育液，37，3060分鐘。 孵育液：磷酸奈酚ASBI 15 mg 溶于二甲基亞砜 0.6 ml 六氮化對(duì)品紅 緩沖液 30 ml 30.6 ml,充分混勻并過濾 蒸餾水洗 入Mayer蘇木精內(nèi)染1分鐘。 流水沖5分鐘后入蒸餾水。 用Apathy糖膠或甘油明膠封固。 結(jié)果 酶的活性部位呈紅色，核蘭色。 分布于腎近端小管核周，肝毛細(xì) 膽管周圍。 ACP是溶酶體的標(biāo)志酶。 六氮化對(duì)品紅液的配制（30ml）, 4對(duì)品紅鹽酸溶液 堿性品紅 400mg 濃鹽酸 2 ml 蒸餾水 8ml 4NaNO3配好后于冰箱保存用時(shí)取1ml。 + 等量混勻（各取1ml），蓋嚴(yán)并置室 溫靜止一分鐘，待混合液變?yōu)榈S色 倒入28ml 2.72醋酸鈉溶液，用1N NaOH調(diào)PH至5 5.5即成。,四、四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶,對(duì)照用抑制劑NaF濃度為10mmol/L Ca2+ 濃度為10mmol/L 注意事項(xiàng) 六氮鹽濃度不能太高 背景會(huì)略帶黃色 應(yīng)用范圍 本法用于ALP、ACP、非特 異性脂酶。,原理利用 利用H受體的H2，使四唑還 原成甲 月替 ：反應(yīng)式如下：,本實(shí)驗(yàn)：以琥珀酸（鈉鹽）為底物，在酶的作 用下脫氫，人工合成的硝基藍(lán)四唑（nitro BT）為受H體，其接受H后被還原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)志酶之一。 抑制物：丙二酸鹽（競爭抑制），磷酸 鹽，氯化物，蘇拉明草酰乙酸 （競爭抑制）凡與-SH基化合的 作用劑皆抑制其活性。 方法,標(biāo)本：大白鼠肝、腎或心肌。橫冷箱切片，后 6微米不固定。 步驟： 將標(biāo)本放入下列孵育液中，37，約5 分鐘。 孵育液：nitro BT 10mg 0.1MPBS，PH7.8 10ml PMS（吩嗪硫酸甲酯） 1mg 徐徐加溫，使其溶解，冷卻過濾。 再加入琥珀酸鈉 80mg 蒸餾水洗凈, Apathy氏液糖膠封固 結(jié)果 酶活性部位成藍(lán)紫色沉淀。此標(biāo)本內(nèi) 所見藍(lán)紫色顆粒即線粒體。 對(duì)照 孵育液去底物，加入等量蒸餾水，同 時(shí)孵育（） 注意 甲月替易溶于脂，反應(yīng)擴(kuò)散時(shí)組織內(nèi)脂滴被染。 加入PMS（中間遞氫體）定位更加準(zhǔn)確。 如果聚乙烯醇PVA，可以保護(hù)線粒體膜，使 反應(yīng)局限在線粒體內(nèi)。 應(yīng)用范圍 適用于：甲胺氧化酶、乳酸脫氫 酶、琥珀酸脫氫酶。,五 、DAB法 顯示過氧化物酶,原理 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2A（供氫體的氧化物）+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知，有稱為復(fù)合物 、的酶底物（受氫體）復(fù)合體生成，在復(fù)合體最后分解為酶和水時(shí)，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。,光鏡顯示方法 （1）孵育液的配置： 預(yù)孵育液： DAB 4HCL 10mg 溶于蒸餾水 5ml 0.2M磷酸緩沖液（PH6.5） 5ml Fahimi孵育液: DAB 4HCL 10ml 溶于蒸餾水 5ml 0.2M磷酸緩沖液（PH6.57.0） 5ml,0.3H2O2 0.1ml GrahamK孵育液： DAB 4HCL 5mg 0.05M TH緩沖液（PH7.6） 10ml 1H2O2 10ml Lojda 孵育液： 0.1N苯基對(duì)次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml 0.3H2O2（新配） 1ml,方法 固定：溫度4，30分鐘（3戊二醛固 定液：20戊二醛15ml，或25 戊二 醛12ml 0.2 M磷酸緩沖 液50 ml，蒸 餾水加至100ml止）； 洗滌：洗滌三次以上，每次15分鐘，或 過濾。 切片：Cryostat制成切片（510m） 染色步驟 切片入下列孵育液中,a預(yù)孵液：室溫下1030分鐘 b后孵液： Fahimi孵育液，室溫560分鐘 Gropam-Karnovsky液，室溫，310分鐘 洗滌：蒸餾水漂洗 染核：亞甲藍(lán)染核 封固