MMP-9 和 NF-κB 在肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析.doc

mmp-9 和 nf-b 在肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析厚銀環(huán) 1萬毅新 21 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，甘肅蘭州（730000）2 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，甘肅蘭州（730000）e-mail:huan 摘要目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9， mmp-9）和核轉(zhuǎn)錄因 子（nuclear factor of kappa b ，nf-b）在肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性。方法 應(yīng)用免 疫組織化學(xué)法，檢測(cè) 79 例肺癌組織及 40 例非腫瘤性肺組織標(biāo)本中 mmp-9、nf-b 的 表 達(dá) ， 并與臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 mmp-9、nf-b 在肺癌組織中高表達(dá)，陽性率分 別為 69.62%和 65.82%，顯著高于非腫瘤性肺組織中的陽性表達(dá) 12.50%和 17.50%，( p 0.05) 。mmp-9、nf-b 的表達(dá)與腫瘤類型、 tnm 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化有關(guān) ( p 0.05)。mmp-9 表達(dá)與 nf-b 呈 正 相 關(guān)（r=0.513，p0.01）。結(jié)論 在肺癌組織中存在 mmp-9、nf- b 的高表達(dá)，mmp-9、nf-b 的高表達(dá)與肺癌的惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。nf-b 可能 通過上調(diào) mmp-9 的表達(dá)及活性促進(jìn)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。二者表達(dá)的檢測(cè)有助于肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的 判斷。關(guān)鍵詞肺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；核因子b (p65)；免疫組織化學(xué) 中圖分類號(hào)r734.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 a肺癌是當(dāng)今世界各地最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在男性居惡性腫瘤的第 一位，女性居第二位。雖然近年來其診療技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但肺癌患者的生存率并未 得到明顯提高，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，腫瘤組織及其間質(zhì)的基 底膜是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)擴(kuò)散過程中的一道天然屏障。正?；啄な怯蒳v型膠原等成分構(gòu)成，為 一致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，固有細(xì)胞不能正常通過。mmp-9是降解iv型膠原最主要的酶。nf-b( p65是nf-b活性形式中具有轉(zhuǎn)錄激活作用的主要成分)是一類重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子, 參 與多種細(xì)胞增殖, 凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在許多惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重 要作用。huang 等1研究顯示，nf - b 的抑制信號(hào)能有效的抑制高轉(zhuǎn)移性前列腺癌pc23 細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf) 、il - 8 和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶9 (mmp - 9) 3 種主要 前血管生成分子的表達(dá)，減少腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，同時(shí)還可通過上調(diào) 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（mmp - 9）的表達(dá)活性影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué) 法檢測(cè)nf-b和mmp-9在肺癌組織中的表達(dá)，以期更全面地了解它們?cè)诜伟┙M織中的生物學(xué) 作用、及其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及二者的相關(guān)性。1 資料與方法1.1 資料：標(biāo)本取自2004年6月-2007年5月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院、甘肅省腫瘤醫(yī)院胸外科住院 手術(shù)切除及氣管鏡活檢的標(biāo)本，經(jīng)病理確診為原發(fā)性支氣管肺癌79例，男54例，女25例；年 齡27-73歲，中位年齡57歲。本實(shí)驗(yàn)的組織標(biāo)本中小細(xì)胞肺癌（sclc）21例（男14例，女7 例），均為未分化，鱗癌34例（男31例，女3例），高8例，中14例，低12例，腺癌20例（男59例，女11例），高分化5例，中10例，低5例，大細(xì)胞癌4例（男3例，女1例），未分化。臨床分期:依據(jù)2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(uicc) tnm分期標(biāo)準(zhǔn)，i期16例（ia 4例，ib 12例），ii 期21例（iia4例，iib17例），iii期41例（iiia33例，iiib8例），iv期 1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移組49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療和其它治療。以非腫瘤 性肺組織標(biāo)本（肺炎18例，肺結(jié)核12例，炎性假瘤10例）40例作為對(duì)照組，男28例，女12 例，年齡26-68歲，中位年齡46歲。1.2 方法：所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成厚4m的切片，采用sp法進(jìn)行nf- b、mmp - 9免疫組化染色。兔抗人nf-b多克隆抗體、鼠抗人mmp - 9單克隆抗體、sp試 劑盒、dab顯色劑均為福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。免疫組織化學(xué)染色按sp試劑盒操作 說明進(jìn)行，切片常規(guī)脫蠟水化后，以檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行高壓加熱法行抗原修復(fù)，用pbs代 替一抗做陰性對(duì)照，陽性對(duì)照采用已知實(shí)驗(yàn)中證實(shí)對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用抗體呈陽性染色反應(yīng)的肺癌 陽性切片。1.3 結(jié)果判斷：細(xì)胞漿或細(xì)胞核中見清晰棕黃色顆粒者為nf-b和mmp-9陽性表達(dá)細(xì)胞。根 據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞顯色深淺及陽性細(xì)胞比率計(jì)分，顯色深淺：不顯色為0分；淺黃色1 分；棕黃色2分；深褐色3分。陽性細(xì)胞百分率：無陽性細(xì)胞顯色0分；陽性細(xì)胞顯色25% 為1分；25%-50%為2分；陽性細(xì)胞顯色50%為3分。二者得分相加：0分為陰性（-）；1-2 分為弱陽性（+）；3-4分為陽性（+）；5-6分為強(qiáng)陽性（+）。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用spss 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，mmp-9和nf-b各組中陽性率的比較采用行列表2 檢驗(yàn)，二者之間的相關(guān)性用spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) = 0.05。2 結(jié)果2.1 nf-b和mmp-9免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：腫瘤組織中nf -b 和mmp-9蛋白陽性表達(dá)呈 棕黃色顆粒狀，前者主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核。后者彌漫分布于細(xì)胞漿，部分位于 細(xì)胞核。在正常肺組織中僅見細(xì)胞漿中散在分布，細(xì)胞核中則無表達(dá)。2.1 nf -b和mmp-9在肺癌組織和正常組織中的表達(dá)：nf -b和mmp-9在肺癌組織中高表 達(dá)，陽性率分別為65.82%和69.62%，正常肺組織中表達(dá)較低，陽性率分別為17.50%和12.50%， 二者相比差異顯著。（見表1）表1nf -b和mmp-9在肺癌組織和正常組織中的表達(dá)組別例數(shù)mmp-9nf -b-+陽性率%-+陽性率%肺癌79249291769.62275252265.82正常403550012.503370017.502.2 nf -b、mmp-9表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系：nf -b和mmp-9的表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)（p0.05），而與腫瘤的組織類型、臨床分期、分化程度及是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在肺癌組織中nf -b、mmp-9表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、iii-iv期及低分化癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、i-ii期及高分化組的表達(dá)，（p0.05）。（見 表2）表2nf -b、mmp-9表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系臨床病理因素例數(shù)nf -bmmp-9陽性例數(shù)陽性率%p陽性例數(shù)陽性率%p 60493265.30.9023469.40.954 年齡 60302066.72170.0男543564.80.7813972.20.460 性別女251768.01664.0鱗癌342264.72367.6組織學(xué)腺癌201050.00.0371155.00.031 類型小細(xì)胞癌211781.01885.7大細(xì)胞癌4375.0375.0高13538.50.001646.20.007 組織分化中241041.71354.2低423788.13685.7i+ii392051.30.0072256.40.012tnm 分期iii+iv403280.03382.5有493979.60.0014081.60.003淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無301343.31550.02.3 nf -b與mmp-9的關(guān)系：在肺癌組中，nf -b與mmp-9二者均陽性表達(dá)46例，二者均陰 性表達(dá)16例，二者呈正相關(guān)關(guān)系( p0.01， r=0.513)。表3nf-kb與mmp-9的關(guān)系名稱 mmp-9nf -b+-陽性率%相關(guān)系數(shù)p+46590.20.5130.01-121642.93 討論肺癌是當(dāng)今發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。ginsberg等2報(bào)道，經(jīng)過正規(guī)積極治療的 患者，其五年生存率僅為13%，絕大部分的患者最終死于局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。從分子水平 了解肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并進(jìn)一步探索防止肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的辦法，是肺癌治療能否取得 突破性進(jìn)展的希望所在。mmp是與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的重要的物質(zhì)之一，它能降解細(xì)胞外 基質(zhì)的各種蛋白成分。細(xì)胞外基質(zhì)包括基底膜和間質(zhì)。正常基底膜是一種均一、連續(xù)的細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)，它的主要成分是iv型膠原，iv型膠原酶能特異性地降解基底膜。iv型膠原酶又稱明 膠酶，屬于mmp中的明膠酶類，其中最重要的是分子量為92kd的mmp-9。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡 性腫瘤中存在著mmp-9的高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法測(cè)定79例肺癌患者腫瘤組織中mmp-9 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的mmp-9的陽性率明顯高于正常組織和良性肺病組織，且其陽性表達(dá) 率隨著腫瘤病理類型、臨床分期的增高以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而增加，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。與farias 等3和thomas 等4結(jié)論一致，提示mmp-9的表達(dá)上調(diào)與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移呈正 相關(guān)，可作為肺癌惡性程度及判斷預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。核轉(zhuǎn)錄因子nf -b 是1986 年由bltimore 和rwiansen在成熟b細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，這種蛋 白能與免疫球蛋白輕鏈內(nèi)含增強(qiáng)子的特異性序列結(jié)合，所以命名為b5。對(duì)nf -b 的 研究已成為當(dāng)前一個(gè)非常引人關(guān)注的熱點(diǎn)。近來研究表明, nf - b調(diào)節(jié)許多粘附、侵襲轉(zhuǎn) 移相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄而參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移6 。正常細(xì)胞內(nèi)nf -b 活化時(shí)間很短。 shishodia等7通過研究發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞在給予煙霧刺激后，細(xì)胞內(nèi)的nf -b活化時(shí)間延長(zhǎng)， 可持續(xù)24 h以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常細(xì)胞內(nèi)nf -b活化時(shí)間，且活化強(qiáng)度與煙霧的接觸劑量和 時(shí)間明顯相關(guān)。anto等8在用煙霧的冷凝集物刺激肺細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)受刺激細(xì)胞內(nèi)ib 激酶活 化 ， nf-b-ib 復(fù)合體中ib被降解，nf -b活化增強(qiáng)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。研究還發(fā)現(xiàn) 9,10， 活化的nf-b 可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子如基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp) 、纖溶酶原激活物尿激 酶( u-pa)等的表達(dá)。silva等 7 發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中伴隨有nf-b持續(xù)活化的u-pa高 表 達(dá) 。 nf-b 作為mmp的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其在與mmp啟動(dòng)子上- 615、- 600位點(diǎn)的b序列結(jié)合后使 mmp的分泌明顯上調(diào)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，在肺癌組織中nf -b的表達(dá)顯著高于正常肺組織。nf - b 在多種腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織中持續(xù)活化，多種因子通過nf-b持續(xù)活化參與腫瘤的進(jìn) 展11。 在腫瘤發(fā)生的實(shí)驗(yàn)性研究中，nf -b的組成性激活與致瘤性轉(zhuǎn)化有關(guān)12 。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：人肺癌組織細(xì)胞胞質(zhì)與胞核中nf-b 的蛋白表達(dá)為陽性，而正常 肺組織弱表達(dá)，并且癌組織蛋白表達(dá)較正常組織明顯增高探其原因可能是細(xì)胞受多種因素刺 激，誘導(dǎo)了nf -b 的活化，nf-b 進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)特定的dna片斷結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn) 錄。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，nf -b的表達(dá)與腫瘤患者的發(fā)病年齡、性別無關(guān)，與腫瘤的大體類型也 無關(guān)，但與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞肺癌這兩類惡性度比較高的腫瘤中 nf -b的表達(dá)較腺癌和鱗狀細(xì)胞癌增高；nf -b在腫瘤的不同時(shí)期表達(dá)也不一致，中晚期 較早期明顯增高，這說明nf -b的活化也許是腫瘤的晚期事件，它被活化后進(jìn)一步促進(jìn)了 腫瘤的惡性進(jìn)展；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織增高，這說明nf-b參與了腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。nf -b (p65) 造成肺癌侵襲能力增強(qiáng)的作用機(jī)制可能是通過nf -b (p65) 的激活，活化許多與浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要因子： 包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑(u-pa ) 和細(xì)胞黏附分子( icam -1) 等。可以說nf -b 的活化是腫瘤發(fā)生發(fā)展、獲得浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移惡性表型的關(guān)鍵。 目前以nf -b作為腫瘤治療新標(biāo)靶的研究正在進(jìn)行，在體外實(shí)驗(yàn)中取得了一定成效，所以 對(duì)nf -b的深入研究將會(huì)對(duì)肺癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供新的思路。本研究結(jié)果表明，mmp-9 與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且nf -b與mmp-9表達(dá)呈正相 關(guān)關(guān)系， 提示在肺癌中mmp-9 的高表達(dá)可能與nf-b有關(guān)，推測(cè)當(dāng)nf -b 激活后，發(fā)揮 基因調(diào)控作用，增強(qiáng)了mmp-9基因的轉(zhuǎn)錄活性，使mmp-9 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 nf -b和mmp9 表達(dá)的檢測(cè)有助于肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的判斷。參考文獻(xiàn) 1 oshiro mm,watts gs ,wozn iak rj ,et al .mutant p53 and aberrant cytosine methylat ion cooperate to silence gene expressionj . oncoqene , 2003 ;22 (23) :3624 - 3634 2 左玉如, 汪家敏mm p-9 和u-pa 在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究j .chin jhemorh.2003, 13 (4) : 352-3541 3 farias e , ranuncolo s , cresta c , et al. plasma metalloproteinase activ ity is enhanced in the euglobu lin fraction of breast and lung cancer patients. int j cancer ,2000 ,89 (4) 389-394 4 thomas p , khokha r , shepherd fa , et al. differential expression of matrixmetalloproteinases and their inh ibitors in non2small cell lung cancer. j pathol ,2000 ,190 (2) 150-156. 5 sen r ,balt imore d. mult iple nuclear factors interact w it h t he immunoglobu lin enhancer sequences j . cell , 1986 , 46 ( 5 ) : 705 - 716 6 nagai s, washiyama k, kw rimoto m, et al. aberrant nuclear factor -kappa b activ ity and its participat ion in the grow th of human malignant astrocytoma. j neurosurg, 2002, 96 (5) : 909 -917. 7 shishodia s, potdar p, gairola cg, et al. cureumin ( dif eruloylmethane) dow n regulates cigarette smoke induced nf-kappa b activat ion through inh ibition of i kappa b alpha kinase in human lung epithelial cells: correlat ion w ith supp ression of cox-2,mmp-9 and cyclin d1 j . carcinogenesis, 2003, 24 (7) : 1269 - 1279. 8 anto rj, mukhopadhyay a, shishodia s, et al. cigarette smoke condensate activates nuclear transcript ion factor-kappa b through phosphorylat ion and degradation of i kappa b( alpha) : correlat ion w ith induction of cyclooxygenase-2 j . carcinogenesis, 2002, 23 (9) : 1511- 1518. 9 stavrides jc. lung carcinogenesis: pivotal role of metals in tobacco smoke j . freeradical bio log y, 2006, 41: 1017 - 1030. 10 zhang t,lu h, shang x, et al. nicotine prevents the apoptosis induced bymenadione inhuman lung cancer cells j . biochem bioph ys res commun, 2006, 342 (3) : 928 - 934. 11 sasaki n, morisaki t, hash izume k, et al. nuclear factor - kappa bp65 (rela) transcrip tion factor is constitutively activated in human gastric carcinomatissue. clin cancer res, 2001, 7 (12) : 4136 - 4142. 12 mann ap,verma a, sethi g, et al. over expression of tissue transglutam inase leads to constitutive activat ion of nuclear factor- kappab in cancer cells: delineation of a novel pathw ay j . cancer res, 2006, 66 (17) : 8788 - 8795.expressions and relationsh ip of matrix metalloprote inase 9and nuclear factor of kappa b in human lung cancerhou yin-huan, wan yi-xin .department of respiratory med icine , the second hospit al of lan zhou un iversity , gansu 730000, chinaabstractobjective to investigate the expression, clinical significance and relationship of matrix metalloproteinase- 9(mmp-9) and nuclear factor of kappa b (nf- b) in human lung cancer tissues methods the expression of mmp-9, nf- b in 79 cases of lung cancer and 40 cases of no-cancerous lung disease were assessed by immunohistochemistry, and their correlations with cliniopathological factors were statistically analyzedresultsthe positive rate of mmp-9,nf- b was 69.62% ，65.82% in lung cancer and