N-乙酰半胱氨酸治療 D-氨基半乳糖誘導(dǎo)豬急性肝衰.doc

精品論文大集合n-乙酰半胱氨酸治療 d-氨基半乳糖誘導(dǎo)豬急性肝衰竭對(duì)血氨、內(nèi)毒素和細(xì)胞炎癥因子的影響研究1任鋒 1，2，丁美 1，趙軍 1，張晶 1，陳煜 1，武志明 2，段鐘平 11 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝治療和培訓(xùn)中心，北京（100069）2 北京市衛(wèi)生局肝炎研究所，北京（100069）email：摘要：目的探討 n-乙酰半胱氨酸治療 d-氨基半乳糖誘導(dǎo)豬急性肝衰竭對(duì)肝臟功能和炎癥因子的影響； 方法 隨機(jī)將 14 只雌性中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬分為急性肝衰竭組（6 只）和藥物 治療組（8 只）；急性肝衰竭組和藥物治療組分別應(yīng)用 d-氨基半乳糖（1.2g/kg）靜脈滴注制 備藥物性急性肝衰竭動(dòng)物模型；藥物治療組給予 n-乙酰半胱氨酸治療，急性肝衰竭組同期 給予相同劑量的生理鹽水；分別采用測(cè)定動(dòng)物血氨、血漿內(nèi)毒素以及血清中腫瘤壞死因子-、 白介素-1 含量。結(jié)果藥物治療組和急性肝衰竭組相比，血氨和炎癥細(xì)胞因子 tnf-、il-1 水平在 24 和 48 時(shí)間有明顯改善， 在 12 和 60 小時(shí)沒(méi)有顯著性差異；內(nèi)毒素水平在 12 小時(shí) 有明顯改善，但 12 小時(shí)后沒(méi)有顯著性差別。結(jié)論 nac 可改善 d-氨基半乳糖誘導(dǎo)的豬急性 肝衰竭肝臟功能，使血氨血癥和內(nèi)毒素血癥得到一定改善，可抑制炎癥反應(yīng)的快速發(fā)展，穩(wěn) 定機(jī)體的內(nèi)環(huán)境。關(guān)鍵詞：n-乙酰半胱氨酸；肝衰竭；血氨；內(nèi)毒素；細(xì)胞炎癥因子肝臟功能衰竭（liver failure，lf）是臨床上十分常見(jiàn)的由各種原因（病毒、酒精、藥物 及許多代謝性疾?。┧碌呐R床綜合征，歐美國(guó)家以藥物（如對(duì)乙酰氨基酚）為主，我國(guó)則 以病毒（主要是乙型肝炎病毒）為主。n-乙酰半胱氨酸（n-acetylcysteine, nac）是細(xì)胞內(nèi) 還原型谷胱甘肽（gsh）的前體，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。目前在我國(guó)不同原因引起的急性 肝功能衰竭均可見(jiàn)到，因此根據(jù)乙酰半胱氨酸在抗氧化、解毒、改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)等方 面的作用，我們采取與人類各項(xiàng)生理、生化指標(biāo)比較接近的大型動(dòng)物豬為研究對(duì)象，應(yīng)用 nac 治療以 d-氨基半乳糖誘導(dǎo)建立的急性肝衰竭動(dòng)物模型1，以觀察 nac 治療非對(duì)乙酰氨 基酚引起的急性肝衰竭的效果以及藥物作用機(jī)制。本文在前期研究結(jié)果2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步談 討 n-乙酰半胱氨酸治療豬藥物性肝衰竭對(duì)血氨、內(nèi)毒素和細(xì)胞炎癥因子的影響。1. 材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬（五指山小型豬系近交系）14 只，雌性，78 月齡，體重在 1825 公斤之間，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境 中。nac 由杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。1.2急性肝衰竭動(dòng)物模型的建立動(dòng)物采用鹽酸氯胺酮 10mg/kg，安定 10mg 肌肉注射實(shí)施基礎(chǔ)麻醉并以 10%丙泊酚緩慢 靜點(diǎn)維持麻醉狀態(tài)，經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插入大口徑雙腔中心靜脈導(dǎo)管。靜脈注射 d-氨基半乳 糖（給藥劑量為 1.2g/kg），于 10 分鐘內(nèi)快速輸入動(dòng)物體內(nèi)。1 本課題得到北京市教育委員會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(km200610025030)的資助。- 3 -1.3動(dòng)物分組和治療給藥方法中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬 14 只動(dòng)物隨機(jī)分為 2 組：急性肝衰竭組（6 只）和藥物治療組（8 只）； 藥物治療組于靜脈導(dǎo)管滴注 d-氨基半乳糖后 6 小時(shí)，24 小時(shí)，48 小時(shí)分別給予 nac 150 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg 進(jìn)行治療；急性肝衰竭組同期給予相同劑量的生理鹽水；1.4觀察指標(biāo)1.4.1肝臟功能指標(biāo) alt、ast、tbil 的檢測(cè)以 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時(shí)、給藥后 12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、60 小時(shí)，采血5ml 進(jìn)行生化常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)的肝功指標(biāo)主要有谷草轉(zhuǎn)氨酶（alt）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ast）、 總膽紅素（tbil）。1.4.2血氨和內(nèi)毒素的檢測(cè)兩組研究對(duì)象于 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時(shí)、給藥后 12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、60 小時(shí)，分別留取 2 ml 靜脈血進(jìn)行血氨和內(nèi)毒素的檢測(cè)。將全血置于專用瓶?jī)?nèi)搖勻后測(cè)定 其血氨濃度，具體操作按照試劑說(shuō)明步驟進(jìn)行；血氨分析試劑盒名稱為 ammonia test kit ，儀器及試劑盒購(gòu)自日本 arkray factory inc。血漿中的內(nèi)毒素測(cè)定應(yīng)用內(nèi)毒素鱟試 驗(yàn)試劑盒，采用鱟試劑的合成基質(zhì)偶氮顯色法原理，操作過(guò)程中使用的試劑和器材和操作步 驟嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。1.4.3細(xì)胞因子 tnf-、il-1 的檢測(cè)以 d-氨基半乳糖給藥前為 0 小時(shí)、給藥后 12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、60 小時(shí)，留取 靜脈血標(biāo)本 2000 轉(zhuǎn)/min 離心 10 分鐘后，提取血清用于檢測(cè)細(xì)胞因子 tnf-、il-1。應(yīng)用 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法（elisa）進(jìn)行檢測(cè)，酶聯(lián)板包被的分別為豬的特異性 tnf-、il-1 單克隆抗體。elisa 方法具體步驟按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 spss11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理， 兩組之間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療前后的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，p 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。2. 結(jié) 果2.1nac 治療對(duì) alt，ast 和 tbil 的影響急性肝衰竭組和藥物治療組動(dòng)物給予 d-氨基半乳糖后肝功能損傷均呈現(xiàn)進(jìn)行性加重， 但治療組與對(duì)照組相比，治療組動(dòng)物在給予 nac 治療后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶、 總膽紅素下降，在 12，24 和 48 小時(shí)大部分時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但 60 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)則 很少有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如表 1 所示）。表 1 急性肝衰竭組和藥物治療組不同時(shí)間點(diǎn) alt, ast 和 tbil 測(cè)定值組別時(shí)間谷丙轉(zhuǎn)氨酶（u/l）谷草轉(zhuǎn)氨酶（u/l）總膽紅素（umol/l）急性 肝衰竭組藥物 治療組12 小時(shí)89.523.5247.337.913.12.524 小時(shí)242.630.5900.748 小時(shí)1217.368.42061.9101.586.210.560 小時(shí)1826101.22573.0120.8197.823.412 小時(shí)77.218.5*304.3*24 小時(shí)211.134.4*1349.6120.3*32.55.948 小時(shí)1069.148.71517.354.8*79.710.7*60 小時(shí)168154.11754.149.1*172.535.1注：* 治療組與對(duì)照組治療前后各時(shí)間點(diǎn)比較具有顯著性差別（p0.05）；2.2nac 治療對(duì)血氨和內(nèi)毒素的影響研究結(jié)果表明，急性肝衰竭組和藥物治療組給予 d-氨基半乳糖后血氨和內(nèi)毒素水平明 顯升高；藥物治療組給予 nac 治療后與急性肝衰竭組相比能有效降低血氨和內(nèi)毒素水平： 血氨在 24 小時(shí)和 48 小時(shí)有顯著性差異（p0.05），內(nèi)毒素在 12 小時(shí)和 24 小時(shí)有顯著性差 異（p0.05），如圖 1 所示。圖 1 急性肝衰竭組和藥物治療組學(xué)血氨和血漿內(nèi)毒素水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)；a 血氨水平動(dòng)態(tài)變化；b 血漿 內(nèi)毒素水平動(dòng)態(tài)變化2.3nac 治療對(duì) tnf-, il-1 影響給予 d-氨基半乳糖后，急性肝衰竭組和藥物治療組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞因子 tnf-， il-1 均呈升高趨勢(shì)。藥物治療組 tnf- 水平在 12，24，48 時(shí)間觀察點(diǎn)與急性肝衰竭組相 比均有下降， 并且差異均有顯著性意義（p0.05）；藥物治療組 il-1 水平在 12，24，48，60 時(shí)間觀察點(diǎn)與急性肝衰竭相比均有下降， 12 小時(shí)和 24 小時(shí) il-1 水平差異具有顯著性 意義（p0.05）（如圖 2 所示）。圖 2 急性肝衰竭組和藥物治療組學(xué)血清腫瘤壞死因子-和白介素-1 水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)；a 血清 tnf-水平動(dòng)態(tài)變化；b 血清 il-1 水平動(dòng)態(tài)變化；3. 討 論乙酰半胱氨酸( acetylcysteine，nac)是一種巰醇化合物，其化學(xué)式為 c5h9no3s，分子 量為 163.2。nac 是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（gsh）的前體，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)：nac 可 提高機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽（gsh）含量，半胱氨酸上的巰基是谷胱甘肽活性基團(tuán)，gsh 具有解 毒、抗氧化等多種重要功能。nac 作為小分子物質(zhì)，易于進(jìn)入細(xì)胞，脫乙?；蟪蔀?gsh 合成的前體，促進(jìn) gsh 的合成，提高組織內(nèi) gsh 含量，增強(qiáng)組織的抗自由基及抗藥物、毒 物損傷的能力；nac 的抗生物氧化作用 nac 分子中含有活性巰基（sh），可對(duì)抗不同 原因所致的組織氧化損傷。對(duì)體內(nèi)氧自由基（超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等）具有明 顯的拮抗作用；由于 nac 易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)能透過(guò)細(xì)胞膜與多種細(xì)胞成分（如蛋白質(zhì)、dna、 氨基酸等）反應(yīng)、導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死的氧自由基（(h202、-oh）具有抑制、清除作用。 nac 在體內(nèi)能作為一氧化氮分子載體并增加 no 的生物利用度，發(fā)揮 no 生理效應(yīng)，促進(jìn) 收縮的微循環(huán)血管擴(kuò)張，有效增加血液對(duì)組織氧輸送和釋放，糾正組織缺氧，防止細(xì)胞進(jìn)一 步壞死，降低多器官功能衰竭的發(fā)生率，從而提高器官衰竭的存活率。除此以外，nac 具 有預(yù)防 dna 損傷、調(diào)整基因的表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，還具有抗細(xì)胞凋亡、抗血管生成、 抑制惡性腫瘤發(fā)展等作用35。由于我國(guó)重型肝炎最常見(jiàn)的病因是由肝炎病毒引起，其中 80以上是由 hbv 感染引起， 而在慢性肝炎或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生慢性重型肝炎相當(dāng)常見(jiàn)。關(guān)于 nac 在慢性重型肝炎中的 應(yīng)用國(guó)內(nèi)外已有初步研究，結(jié)果顯示該藥物對(duì)重型肝炎的治療有一定的療效68。國(guó)外臨 床研究證明靜脈應(yīng)用乙酰半胱氨酸不僅是治療醋氨酚過(guò)量引起的肝衰竭，對(duì)其他病因引起的 肝衰竭也顯示良好療效。因此根據(jù)乙酰半胱氨酸的解毒、抗氧化、改善微循環(huán)等作用，研究 其對(duì)非醋氨酚引起肝衰竭的治療作用。本次研究結(jié)果表明，急性肝衰竭組動(dòng)物血清 alt、 ast 和 tbil 水平明顯升高, 病理學(xué)也同時(shí)證實(shí)有嚴(yán)重肝損傷表現(xiàn)2。研究結(jié)果顯示 nac 對(duì) 衰竭的肝臟功能恢復(fù)起到一定的作用：藥物治療組在給予 nac 后，與急性肝衰竭組相比， 肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素在 12，24，48 小時(shí)明顯下降。在急性肝衰竭的致病機(jī)理中，細(xì)胞因子發(fā)揮著重要的作用。tnf- 是一種具有廣譜生 理和病理效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要由單核和巨噬細(xì)胞分泌；低水平的 tnf- 是肝細(xì)胞生長(zhǎng)分- 3 -化與再生所必需的調(diào)節(jié)因子，高水平的 tnf- 可以與細(xì)胞膜上 tnf 受體結(jié)合，激活caspase-3，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝組織壞死，是肝衰竭的重要病理機(jī)制； 因此 tnf- 是造成肝細(xì)胞損傷的主要因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)和一系列病理生理過(guò)程的重要 介質(zhì)，與肝細(xì)胞炎癥、壞死及病情發(fā)展密切相關(guān)9,10。il-1 是一種來(lái)源廣泛的多功能細(xì)胞 因子, 參與多種炎癥反應(yīng), 促進(jìn)組織損傷；il-1 能誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附 分子等的合成，是局部和全身炎癥反應(yīng)中起重要作用的促炎因子之一；除直接作用外，il-1 還可通過(guò)與其他促炎癥因子的共同作用，導(dǎo)致所謂“炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)”的產(chǎn)生11,12。研究結(jié)果表 明，急性肝衰竭動(dòng)物的血清 tnf-、il-1 水平顯著升高。藥物治療組經(jīng) nac 治療后 tnf-、 il-1 水平在每個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比均有下降，治療前后細(xì)胞因子水平差異顯著， 但在整個(gè)觀察時(shí)間內(nèi)，無(wú)論是對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和治療實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞因子都是逐漸升高。該結(jié)果說(shuō) 明 nac 治療可以減少體內(nèi) tnf-、il-1 炎癥細(xì)胞因子的生成，抑制炎癥反應(yīng)的快速發(fā)展， 穩(wěn)定機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，減輕肝臟損傷，為肝細(xì)胞的再生、修復(fù)提供條件。在這里需要指出的是，從急性肝衰竭組和藥物治療組之間的肝功能指標(biāo)、血氨、內(nèi)毒 素以及炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，在 24 小時(shí)和 48 小時(shí)觀察點(diǎn)時(shí)治療組和對(duì)照組的差別 一般具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種現(xiàn)象提示 48 小時(shí)以后，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的肝臟功能隨著肝衰竭 的進(jìn)展發(fā)生了急劇的變化，這也提示我們?cè)谥委熍R床急性肝衰竭患者時(shí)，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，早治療， 以保證達(dá)到良好的治療效果。綜上所述，nac 作為細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的前體，一種含有巰基的抗氧化劑，對(duì)非醋氨酚 引起的急性肝功衰竭同樣具有一定的療效：改善肝臟的一般狀況和機(jī)能，并且可以抑制炎癥 細(xì)胞因子的生成，抑制炎癥反應(yīng)的快速發(fā)展，在一定程度上為肝臟功能的恢復(fù)提供有益的幫 助。參考文獻(xiàn)1李亞明,張晶,趙軍等. 急性肝功能衰竭動(dòng)物模型的建立. 肝臟,2006,11(3):175-177.2喬玲,任鋒,張培豪等. n- 乙酰半胱氨酸治療豬急性肝衰竭的作用. 傳染病信息,2007,20(3): 155-157.3demols a,van laethem j l,quertinmont e,et al. n-acetylcysteine decreases severity of acute pancreatitis in mice. pancreas, 2000, 20 (2): 161-169.4zhang h, spapen h, nguyen dn, benlabed m, buurman wa, vincent jl: protective effects ofn-acetyl-l-cysteine in endotoxemia. am j physiol, 1994, 266(8): 1746-1754.5aruoma o,halliwell b,hoey b m,et a1.the antioxidant action of n-acetylcysteine:its reaction with hydrogenperoxide,hydroxylradical,superoxide,andhypochlorousacid.freeradicbiol med,1989,6(6):593-597.6harrison p, wendon j, williams r. evidence of increased guanylate cyclase activation by acetylcysteine in fulminant hepatic failure. hepatology, 1996, 23 (5):1067 - 1071.7何鍵軍,黃日方. 靜脈注射乙酰半胱氨酸治療慢性重型病毒性肝炎的臨床觀察. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2000,4:327 - 329.8潘紅英,婁國(guó)強(qiáng),童永喜等. n-乙酰半胱氨酸對(duì)重型肝炎患者白細(xì)胞介素-18 的影響. 中華肝臟病雜 志,2003,11(6):656-658.9volkd-johnson c, entingh aj, world wsm, et al. activation of intracellular proteases is an early event intnf induced apoptosis. j immunol, 1995,154 (4):1707-1716.10 galun e, axelrod jh. the role of cytokines in liver failure and regeneration: potential new molecular therapies. biochim biophys acta , 2002 ,1592(3):345- 358.11 bout h, lefeuvre ra, horai r, et al. role of il-1 and il-1 in ischemic brain damage. j neurosci, 2001,1(5):5528- 5534.12 yoshihiro k, makoto k, takao s, et al. interleukin-1 stimulates cytokines, prostaglandin e2 and matrix metalloproteinase-1 production via activation of mapk/ ap-1 and nf-b in human gingival fibroblasts. cytokine, 2005, 29(4):159-168.the changes of blood ammonia, endotoxin and inflammatory cell factor of n-acetylcysteine ond-galactosamine-induced acute hepatic failure in pigsren feng1, 2, ding mei1, zhao jun1, zhang jing1, chen yu1, wu zhiming2, duanzhongping11.beijing artificial liver treatment and training center, beijing you an hospital, beijing(100069)2. hepatitis institute beijing municipal health bureau, beijing (100069.)abstractobjective to study changes of serum ammonia, endotoxin and inflammatory factor of n-acetylcysteine on d-galactosamine-induced acute hepatic failure in pigs. methodssixteen minipigs were dividedinto two