亞硝酸還原酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研究.doc

亞硝酸還原酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研究2011年6月第6期(總第151期)廣西輕工業(yè)guangxijournaloflightindustry食品與生物亞硝酸還原酶產(chǎn)生茵的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研究杜嬋娟,白先放,謝慶武(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530004)【摘要】以nano為唯一氮源,從土壤篩選出6株產(chǎn)亞硝酸還原酶的真菌.從其中酶活力最高的n4菌株提取胞內(nèi)酶,對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究.結(jié)果表明,該酶受edta,ni.和co抑制,被ba激活;最適反應(yīng)溫度為35,最適反應(yīng)ph為7.4;在60cvx下,ph7.07.8時(shí)穩(wěn)定.【關(guān)鍵字】亞硝酸還原酶;篩選;真菌;酶學(xué)性質(zhì)【中圖分類(lèi)號(hào)】tq925【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】10032673(2011)060702亞硝酸鹽是一類(lèi)致癌性物質(zhì),廣泛存在于蔬菜,食品和煙葉中,可使人體血液中的血紅蛋白失去攜氧功能,并可誘發(fā)各種癌癥_ll.降解亞硝酸鹽的方法主要有化學(xué)法和生物法日.生物法是利用亞硝酸還原酶(nitritereductase,ec1.7.2.1)對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行分解,酶促反應(yīng)需要nad(p)h等作為輔酶31.生物法的關(guān)鍵是獲得產(chǎn)亞硝酸還原酶的高產(chǎn)菌株,因此我們進(jìn)行了相關(guān)的研究.1實(shí)驗(yàn)材料1.1土樣來(lái)源土壤樣品從南寧市郊區(qū)菜地和周邊縣城農(nóng)田采集.1.2培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基(%):葡萄糖3.0,nano20.3,kc10.05,k2hpo40.1,mgso40.05,feso40.001,瓊脂1.5,ph自然;發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖3.0,nano0.3,kc10.05,k2hpo40.1,mgso40.05,feso40.001,ph自然;產(chǎn)酶培養(yǎng)基(%):葡萄糖3.0,蛋白胨0.2,nhc10.1,nano20.2,kc10.05,k2hpo40.15,mgso40.075,feso40.003,ph8.0.2實(shí)驗(yàn)方法2.1菌株的分離與篩選取土樣1g,加9ml無(wú)菌水,混勻,濃度梯度稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基,30c下培養(yǎng)34d,將生長(zhǎng)旺盛的菌落轉(zhuǎn)接至nano濃度更高(110%)的平板培養(yǎng)基上,對(duì)生長(zhǎng)快的菌株進(jìn)行分離純化后,接人發(fā)酵培養(yǎng)基,30%,200r/m培養(yǎng)48h,選取酶活力最高的菌株進(jìn)行下一步研究.2-2粗酶液的提取將菌種接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,30c,200r/m培養(yǎng)48h,過(guò)濾收集菌體,用無(wú)菌水充分洗滌,加0.1mol/lph7.4的磷酸緩沖液,研磨破壁,離心所得上清液即為粗酶液.2.3酶活力測(cè)定將100110%葡萄糖和100l粗酶液混合,于30保溫12h,加入100150g/mlnano2,700l0.1mol/lph7.4磷酸緩沖液,40%水浴中反應(yīng)15min,加入100l4g/l對(duì)氨基苯磺酸,50l2g/l鹽酸萘乙二胺溶液,顯色穩(wěn)定后測(cè)od計(jì)算酶活力.酶活力單位定義:在上述反應(yīng)條件下,每分鐘分解0.1gnano:所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位(u).3結(jié)果3.1菌種的篩選從土壤篩選到6株產(chǎn)亞硝酸還原酶的菌株,其中n菌株的酶活力最高,達(dá)到5.41u/ml(表1).表1各菌株的亞硝酸還原酶活力比較nlnsnrn0n醐力(u/m1)5.414.983723.524254413i2酶學(xué)性質(zhì)的研究3.2.1edta和金屬離子對(duì)酶活力的影響將10mmol/l的edta或金屬離子溶液與酶液等體積混合,于40%下水浴保溫30min,測(cè)定酶活力.結(jié)果表明,edta,fe,co和ni對(duì)酶有抑制作用,ba,pb,na,ca,k,cu和mg對(duì)酶則有激活作用,其中ba:的激活作用最強(qiáng)(圖1).】e鞋】j赫1霰鎏80it督鞲4瞄2握r一一cd.圖1edta和金屬離子對(duì)酶活力的影響3.2.2溫度對(duì)酶活力的影響在不同溫度(2570%)下測(cè)定酶活力,結(jié)果表明,在3o40%范圍內(nèi)都具有較高的酶活力,最適酶促反應(yīng)溫度為35(圖2).【作者簡(jiǎn)介】杜嬋娟(1984一),女,廣西南寧人,碩士研究生,研究方向:微生物生物技術(shù).7i匿c圖2溫度對(duì)酶活力的影響3.23溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響將酶液分別在3090c下水浴保溫05h,測(cè)定剩余酶活力.結(jié)果表明,該酶在60以下時(shí)基本穩(wěn)定,在80c下保溫5h后.剩余的相對(duì)酶活力為50.48%,而在90下保溫4h后,仍有42.2%(圖3).圖3溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響3.2.4ph對(duì)酶活力的影響在ph5.88.0測(cè)定酶活力.結(jié)果表明,酶促反應(yīng)最適ph為7.4,在ph7.07.8內(nèi)相對(duì)酶活力都在65%1)j,jt_(圖4).口h圖4ph對(duì)酶活力的影響3.2,5ph對(duì)酶穩(wěn)定性的影響將酶液分別與o.1mot/l,ph5.88.0的磷酸緩沖液等量混合,40c恒溫5h后,將ph調(diào)至7.4,測(cè)定剩余酶活力.結(jié)果表明,該酶在ph7.07.8范圍內(nèi)穩(wěn)定,剩余酶活力都在98%以上(圖5).圖5ph對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響83.2.6糖濃度對(duì)酶活力的影響將03%(w/v)濃度的葡萄糖溶液與酶液等量混合,3012下保溫12h后,測(cè)定酶活力.結(jié)果表明,當(dāng)糖濃度為1%時(shí),酶活力最高(圖6).音|錄度圖6糖濃度對(duì)酶活力的影響4分析國(guó)內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行亞硝酸還原酶活力的測(cè)定時(shí),都需要價(jià)格昂貴的nadh或nadph等為電子供體.本研究制備的粗酶液中,除了含有亞硝酸還原酶以外,還有參與糖酵解反應(yīng)的酶系.用該酶系酵解葡萄糖所得的nadh來(lái)進(jìn)行亞硝酸還原酶活力的測(cè)定,可降低研究成本.目前對(duì)亞硝酸還原酶產(chǎn)生菌的研究,大部分都集中在以乳酸菌為代表的細(xì)菌,真菌類(lèi)的研究較少.細(xì)菌來(lái)源的亞硝酸還原酶對(duì)熱穩(wěn)定,可被edta激活.本研究所得的真菌亞硝酸還原酶的熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于細(xì)菌類(lèi)的,在90qc水浴下保溫4h仍有40%左右的酶活力.該酶edta抑制,可能是因?yàn)閑dta絡(luò)合了酶活性中心上的cu:等金屬離子.如果將該酶用于食品加工,水質(zhì)治理以及煙草處理等行業(yè)中,可將反應(yīng)溫度控制在60以上以防止微生物的生長(zhǎng),具有較好的應(yīng)用前景.參考文獻(xiàn)11-圣,朱法華,張景榮等.飲用水中亞硝酸鹽及微量元素對(duì)癌癥發(fā)病率的影響研究】l江蘇環(huán)境科技.2005,18(1):13.2】唐發(fā)書(shū),賈仁勇,彭順清等.葡萄糖和維生素c(vitc)對(duì)香腸中亞硝酸鹽殘留量的影響uj.四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院,2000,14(3):3638.【3pagegv,solbergm,carmangm.nitritereductas