化學(xué)毒物的一般毒性作用.ppt

第6章 一般毒性作用及評價(jià),2,一般毒性：基礎(chǔ)毒性，實(shí)驗(yàn)動物單次、多次或長期染毒所產(chǎn)生的總體毒性綜合效應(yīng)； 特殊毒性：三致作用和生殖毒性。,化學(xué)毒物的一般毒性作用研究是毒理學(xué)工作中非常重要的內(nèi)容。毒物的一般毒性作用觀察是毒理學(xué)的經(jīng)常性工作，對防治外源化學(xué)物所致急慢性中毒，對毒理學(xué)安全性評價(jià)和危險(xiǎn)度評定，制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以及管理毒理學(xué)的決策方面均具有十分重要的意義。,根據(jù)接觸毒物的時(shí)間長短，一般毒性的實(shí)驗(yàn)方法分為： 急性毒性 短期重復(fù)劑量 亞慢性毒性 慢性毒性,第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn),In 1984, 5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due to exposure to methyl isocyanate（異氰酸甲酯，MIC） from an industrial accident in India Many people die each year from inhaling carbon monoxide （CO）from faulty heaters,機(jī)體（實(shí)驗(yàn)動物或人）一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,實(shí)驗(yàn)動物接觸化學(xué)物的方式或途徑不同， “一次”的含義也有所不同 經(jīng)口和注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化學(xué)物輸入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi) 經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次” 是指在一個(gè)特定的期間內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物持續(xù)地接觸受試化學(xué)物的過程 所以“一次”含有時(shí)間因素,化學(xué)物使實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生中毒效應(yīng)的快慢和劇烈的程度，可因所接觸的化學(xué)物的質(zhì)與量不同而異 有的化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動物接觸致死劑量的幾分鐘之內(nèi)，就可發(fā)生中毒癥狀，甚至死亡 而有的化學(xué)物則在幾天后才顯現(xiàn)中毒癥狀和死亡，即遲發(fā)死亡,急性毒性的概念,需要注意,急性接觸的次數(shù)：一次，24h多次 中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間 不僅以接觸毒物后毒性癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，主要以接觸毒物的時(shí)間，觀察時(shí)間：714天 強(qiáng)度：一次性大劑量，中毒癥狀明顯，常發(fā)生死亡,二、急性毒性試驗(yàn)的目的,求出致死劑量及其他急性毒性參數(shù) 觀察中毒表現(xiàn)、毒作用強(qiáng)度和死亡情況，初步評價(jià)毒物的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性 為其他毒理試驗(yàn)提供接觸劑量和選擇觀察指標(biāo)的依據(jù) 為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索,總體原則,三、急性毒性試驗(yàn)方法的要點(diǎn),實(shí)驗(yàn)動物 染毒途徑 染毒劑量 觀察周期 觀察指標(biāo)的選擇、計(jì)算方法和評價(jià),急性毒性反應(yīng)與人近似 易于飼養(yǎng)、操作方便 繁殖力較強(qiáng)，數(shù)量較大 價(jià)格較低，易于獲得,（一）實(shí)驗(yàn)動物的選擇和要求,主要原則,實(shí)驗(yàn)動物的物種和品系,嚙齒類（rodent species）,非嚙齒類（nonrodent species）,小鼠：昆明種、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar,犬或猴,實(shí)驗(yàn)動物的物種和品系,首先選擇哺乳動物，其中以大小鼠為最常用。 急性皮膚毒性實(shí)驗(yàn)：成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。 急性吸入毒性實(shí)驗(yàn)和經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)：優(yōu)先考慮大鼠。,根據(jù)接觸途徑選擇實(shí)驗(yàn)動物,大鼠：180-240g 小鼠：18-25g 家兔：2-2.5kg,實(shí)驗(yàn)動物的年齡和體重,剛成年、健康、未曾交配和受孕的動物 小動物根據(jù)體重 同一次試驗(yàn)同一批實(shí)驗(yàn)動物體重變異范圍不應(yīng)超過平均體重的20%,實(shí)驗(yàn)動物的性別,雌雄各半 如雌、雄動物毒效應(yīng)有明顯差異，應(yīng)分別并求出雌性和雄性動物的LD50值 特殊的試驗(yàn)研究可僅作單一性別的急性毒性試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)動物分組與數(shù)量,根據(jù)組數(shù)和每組數(shù)量來決定數(shù)量 LD50，一般為4-6組 大、小鼠每組10只，犬類6只 嚴(yán)格遵循隨機(jī)化的原則,實(shí)驗(yàn)動物的預(yù)檢,給藥前檢疫觀察 大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴23周 適應(yīng)新環(huán)境，減少環(huán)境和生理?xiàng)l件變化可能對試驗(yàn)結(jié)果的影響 篩檢健康狀況不符合試驗(yàn)要求的動物,實(shí)驗(yàn)動物的給藥前禁食處理,經(jīng)口途徑染毒，實(shí)驗(yàn)動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學(xué)毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供飼料 經(jīng)口多次染毒可不禁食,（二）受試物及處理,受試物的接受、分樣、保管、稱量、配制以及在此過程中的嚴(yán)格的質(zhì)量保證是急性毒性試驗(yàn)成功與否的重要環(huán)節(jié)。,（二）受試物及處理,常用劑型：水溶液、混懸液、油溶液 所用的溶劑和助溶劑應(yīng)該是基本無毒的，與受試物不起反應(yīng) 水溶性受試物，蒸餾水、去離子水、生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致 水不溶性受試物，溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中 受試物一般應(yīng)臨用前新配,（二）受試物及處理,急性毒性試驗(yàn)受試物給予動物染毒的量有規(guī)定。常用實(shí)驗(yàn)動物和染毒途徑的適宜容積（最大容積）分別為：大鼠灌胃1.0（3.0）ml/100g體重（BW）；小鼠灌胃0.1（0.4）ml/10g（BW）。,適宜容積染毒,毒性較大的受試物給藥量較小 毒性較低的受試物常需較大量的染毒 給藥容積根據(jù)染毒途徑和實(shí)驗(yàn)動物 經(jīng)口：20ml/kg(空腹動物) 經(jīng)皮：2ml/kg 靜脈：1ml/kg(5min以上),受試物及處理,(三) 染毒方法,應(yīng)考慮人在生產(chǎn)和生活環(huán)境中接觸該化學(xué)毒物的情況，通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒒瘜W(xué)毒物的性質(zhì)和用途、人類實(shí)際接觸途徑和方式來選擇染毒途徑。,(三) 染毒方法,模擬實(shí)際接觸的途徑和方式 有利于不同化學(xué)物之間結(jié)果的比較 受試物的性質(zhì)和用途 受試物毒性評價(jià)程序的要求,工業(yè)毒物：經(jīng)呼吸道、皮膚 農(nóng)用化學(xué)物：經(jīng)口、皮膚、呼吸道 藥品：經(jīng)口、注射、皮膚 食品：經(jīng)口 環(huán)境污染物：經(jīng)口、呼吸道、皮膚,染毒途徑,消化道、呼吸道、皮膚、注射,染毒途徑影響受試物急性毒性,不同途徑的吸收量和吸收速率,吸收速率：靜脈注射呼吸道腹腔注射肌內(nèi)注射皮下注射消化道皮內(nèi)注射經(jīng)皮 同一受試物不同染毒途徑LD50的大小通常符合上述規(guī)律,經(jīng)口（胃腸道）染毒,LD50值來比較不同化學(xué)物急性毒性大小,灌胃：溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)，等容量灌胃法 吞咽膠囊：將受試物裝入膠囊中，放至舌后部，迫使動物咽下。犬、猴 喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實(shí)驗(yàn)動物自行攝入,灌胃法,急性實(shí)驗(yàn)多采用灌胃法。小鼠的灌胃針長約45cm，直徑為1mm，大鼠的灌胃針長約68cm，直徑約1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小圓金屬球，金屬球?yàn)橹锌盏摹：附饘偾虻哪康氖欠乐贯橆^刺入氣管或損傷消化道。針頭金屬球端彎曲成20左右的角度，以適應(yīng)口腔、食道的生理彎曲度走向。,用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部，使口腔與食道成一直線,將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力,此時(shí)可略改變一下灌胃針方向，以刺激引起吞咽動作，順勢將藥液注入。一般灌胃針插入小鼠深度為34cm，大鼠或豚鼠為46cm。常用灌胃量小鼠為0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml,鼠類的灌胃法,經(jīng)呼吸道染毒,經(jīng)呼吸道染毒（inhalation）： 研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在的化學(xué)毒物和評價(jià)環(huán)境空氣污染物。,靜式吸入染毒 動式吸入染毒,經(jīng)呼吸道染毒,氣管內(nèi)注入,吸入染毒,靜式吸入染毒,將一定量的易揮發(fā)的靜態(tài)化學(xué)毒物或一定體積的氣態(tài)化學(xué)毒物加入到具有一定體積的密閉容器內(nèi)，使實(shí)驗(yàn)動物吸入染毒。,靜式吸入染毒,方法：一定體積的密閉容器，加入易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)受試物 染毒柜體積、動物數(shù)、時(shí)間，依據(jù)實(shí)驗(yàn)動物最低需氣量計(jì)算 優(yōu)點(diǎn)：簡單、方便、受試物消耗少，適合于小鼠 缺點(diǎn)：氧氣減少，濃度不穩(wěn)定，經(jīng)皮吸收，不適合稍大動物，揮發(fā)性,動式吸入染毒,將實(shí)驗(yàn)動物處于有空氣流動的染毒柜中，新鮮空氣不斷流入，污染空氣不斷流出。溫度、濕度、氧及二氧化碳分壓相對恒定，并有隨時(shí)補(bǔ)充受試物，維持濃度穩(wěn)定?？刹蓸颖O(jiān)測受試物濃度，可持續(xù)接觸受試物，無時(shí)間限制。,動式吸入染毒裝置的組成,染毒柜 機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng) 配氣系統(tǒng),38,動式吸入染毒設(shè)備,動式吸入染毒方式分類,動式吸入接觸（動式染毒） 面罩接觸（面罩吸入染毒）,動式吸入染毒優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：受試物濃度和氧分壓較穩(wěn)定 缺點(diǎn)：設(shè)備要求高，消耗受試物量很大，操作比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)工,氣管注入法,經(jīng)喉插入法、氣管穿刺法、暴露氣管穿刺法 優(yōu)點(diǎn)：染毒劑量較準(zhǔn)確，用毒物量少；形成中毒模型速度快。 缺點(diǎn)：操作易造成損傷，引起動物死亡；不能發(fā)揮上呼吸道的防衛(wèi)作用，與自然吸入有差異。,經(jīng)皮膚染毒,液態(tài)、氣態(tài)甚至粉塵狀態(tài)的化學(xué)毒物 多選擇家兔和豚鼠，采用動物脊柱兩側(cè)皮膚脫毛（剪毛法、剃毛法、拔毛法、化學(xué)脫毛法） ，局部涂敷受試化學(xué)毒物并以玻璃鐘罩、油紙或塑料薄膜覆蓋固定一定的時(shí)間。,經(jīng)皮膚染毒,農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)毒物、環(huán)境污染物、外用藥物 常用大鼠 染毒方式：,脫毛：化學(xué)或機(jī)械法脫毛（體表面積的10%） 染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,經(jīng)注射途徑染毒（ingestion）,進(jìn)行化學(xué)毒物的毒作用機(jī)制研究、比較毒性研究、了解化學(xué)毒物代謝與毒物動力學(xué)參數(shù)或?qū)本人幬镞M(jìn)行篩選研究。 腹腔注射、靜脈注射（大、小鼠尾靜脈、兔耳靜脈）、肌內(nèi)注射、皮下注射等。,45,經(jīng)注射途徑染毒,（四） 劑量選擇,參考新化學(xué)物的理化性質(zhì) 參考相關(guān)資料 先用少量動物，以較大的劑量間隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死劑量范圍，然后設(shè)計(jì)正式實(shí)驗(yàn)的劑量和分組 根據(jù)試驗(yàn)所選的LD50計(jì)算方法確定劑量組數(shù),了解化學(xué)毒物的理化特性，純度，雜質(zhì)成分與含量等,有相關(guān)毒性資料可供參考者,沒有毒性資料可供查閱者,預(yù)試驗(yàn),找出大致致死范圍(即死亡率從0-10%至90-100%),設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組,近似化學(xué)物的LD50(LC50)值作預(yù)期毒性中間劑量，上下各設(shè)計(jì)12個(gè)劑量組,最大耐受量試驗(yàn),各組劑量的計(jì)算,i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1）,i為組距，n為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)。以最低劑量值（LD0或LD10）的對數(shù)劑量加上一個(gè)i值，即是第二個(gè)劑量組的對數(shù)劑量，依次類推直至最高劑量組,49,霍恩法（Horn）：平均移動內(nèi)插法（moving average interpolation） 改進(jìn)寇氏法 Bliss法：最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計(jì)算方法,LD50的幾種計(jì)算方法,50,霍恩法,設(shè)4個(gè)劑量組 每組動物數(shù)相等，一般為4只或5只 各劑量公比為10。結(jié)果可查表求出LD50及其95%可信限。 由于動物數(shù)量較少，其95%可信限范圍大，適用于預(yù)試驗(yàn)較好。,51,改進(jìn)寇氏法,各組實(shí)驗(yàn)動物數(shù)相等，一般為10只 各劑量組劑量呈等比級數(shù)排列，至少有5個(gè)劑量組 死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率小于20%，最高劑量組死亡率高于80%，所選劑量對數(shù)差值相等。,化學(xué)物L(fēng)D50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大 我國藥品的毒理研究指導(dǎo)原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡,不必計(jì)算LD50,化學(xué)毒物的LD50（LC50）的測定一般要求計(jì)算實(shí)驗(yàn)動物接觸受試物后14天內(nèi)的總死亡數(shù)。,試驗(yàn)周期,全面觀察動物的各種反應(yīng)和變化，仔細(xì)分析實(shí)驗(yàn)動物在染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)、劑量效應(yīng)、時(shí)間分布。觀察記錄的內(nèi)容：,（五） 毒性作用觀察,中毒體征及發(fā)生過程 死亡情況和時(shí)間分布 體重 病理形態(tài)學(xué)變化,（五） 毒性作用觀察,中毒體征及發(fā)生過程,詳細(xì)觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征 發(fā)生時(shí)間 體征發(fā)展的經(jīng)過 各個(gè)系統(tǒng)的特征 初步確定急性毒性靶器官 不同表現(xiàn)提供毒性機(jī)制的信息,57,58,續(xù)表6-1 嚙齒類動物急性中毒表現(xiàn),死亡情況和時(shí)間分布,實(shí)驗(yàn)動物的死亡數(shù)對LD50值產(chǎn)生明顯影響 分析中毒死亡時(shí)間的分布規(guī)律可以提供重要信息：原形，代謝,60,久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)染毒劑量增加，死亡時(shí)間縮短，呈直線負(fù)相關(guān)，這提示實(shí)驗(yàn)動物致死原因是化學(xué)物原形所致； 過氧化二磷酸二環(huán)己酯給大鼠腹腔注射后呈現(xiàn)明顯的染毒劑量對數(shù)值與死亡時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但給小鼠腹腔注射后，染毒劑量與死亡時(shí)間無明顯相關(guān)。這提示可能與該化學(xué)物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關(guān)。,體重,體重可反映動物中毒后的整體變化。對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物，應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。,體重,反映動物中毒后綜合性整體變化，比較客觀簡便的量化指標(biāo) 應(yīng)定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次 對體重指標(biāo)的變化要仔細(xì)觀察和分析,體重變化的原因,影響食欲或消化系統(tǒng)的功能 影響食物的吸收和利用 影響水的攝取 腎功能急性損傷,病理檢查,死亡動物：大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變 存活動物：觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)進(jìn)行解剖檢查，必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查,（六） 觀察時(shí)間和周期,染毒以后應(yīng)即刻開始觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡情況 給藥當(dāng)天應(yīng)連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直至試驗(yàn)周期結(jié)束,觀察周期一般為14天 LD50(LC50)計(jì)算時(shí)以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù) 不同化學(xué)物質(zhì)引起動物中毒體征出現(xiàn)的時(shí)間不同，而且引起死亡的時(shí)間存在個(gè)體差異 速殺型化學(xué)毒物僅計(jì)算24h的死亡率,（六） 觀察時(shí)間和周期,急性毒性試驗(yàn)求出LD50(LC50)值，通過LD50值進(jìn)行急性毒性分級(acute toxicity classification)，評價(jià)毒物的急性毒性強(qiáng)弱，比較毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分級和評價(jià), 不論我國或國際上的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)均還存在不少缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎饕歉鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)確定，客觀性還不足 目前還沒有全世界公認(rèn)、統(tǒng)一的毒性分級標(biāo)準(zhǔn),急性毒性分級,69,70,按照急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)毒性大小是相對粗略的分級 報(bào)告：LD50、急性毒性級別；中毒體征、出現(xiàn)體征時(shí)間、死亡前征兆、死亡時(shí)間和劑量組間分布、存活動物的體重變化和恢復(fù)情況、死亡動物的病理變化,急性毒性分級,舉 例,文獻(xiàn)：曹靜祥, 治洪, 余淑懿, 等. 硼硒聯(lián)合對大鼠的急性毒性和亞慢性毒性研究. 衛(wèi)生研究, 2002,31(4):297-299. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生與衛(wèi)生工程研究所,前言 單獨(dú)的硒、單獨(dú)的硼均有抗氟作用，有研究表明硼硒聯(lián)合作用使氟中毒大鼠的康復(fù)效果較好。因此，我們在硼硒抗氟藥效實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，為了解硼硒聯(lián)合毒性作用，為現(xiàn)場人群應(yīng)用硼硒聯(lián)合防治氟中毒提供試驗(yàn)依據(jù)，我們就硼硒聯(lián)合對大鼠的急性毒性及亞慢性毒性進(jìn)行試驗(yàn)研究,舉 例,主要試劑：四硼酸鈉、亞硒酸鈉 急性毒性試驗(yàn)：參照霍恩氏（Horn）法，選用80只成年大鼠，雌、雄各半，平均體重220g，隨機(jī)分為8組。受試物用蒸餾水溶解，動物禁食16小時(shí)，經(jīng)口灌胃一次染毒，觀察兩周內(nèi)動物的死亡數(shù)，查表計(jì)算LD50,舉 例,材料與方法,四硼酸鈉與亞硒酸鈉聯(lián)合對大鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)亞硒酸鈉和四硼酸鈉的半數(shù)致死量，將受試物按比例混合并用蒸餾水溶解，40只，隨機(jī)分為4組。應(yīng)用預(yù)測與實(shí)測LD50的對比法評價(jià)兩種毒物之間的聯(lián)合作用性質(zhì),舉 例,材料與方法,急性毒性試驗(yàn)：急性硒中毒動物在服藥5min后出現(xiàn)急性硒中毒癥狀，最初表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，然后呼吸困難，四肢痙攣，直至死亡。急性硼中毒動物在服藥60min后出現(xiàn)急性中毒癥狀，表現(xiàn)為不好動、腹瀉、口鼻出血，甚至驚厥死亡,舉 例,結(jié) 果,舉 例,結(jié) 果,聯(lián)合作用評價(jià)結(jié)果,結(jié) 果,LD50：四硼酸鈉對雌、雄性大鼠1470mg/kg。亞硒酸鈉對雄性大鼠14.70mg/kg，對雌性大鼠6.81mg/kg。聯(lián)合對大鼠的急性毒性，雄性大鼠為1727.10mg/kg，雌性大鼠1717.94mg/kg,討 論,我國工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)：本實(shí)驗(yàn)四硼酸鈉與亞硒酸鈉混合毒物屬于低毒類物質(zhì)。該毒物的值可為亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)提供染毒劑量水平的設(shè)計(jì)依據(jù),討 論,第二節(jié) 蓄積毒性作用,蓄積作用(accumulation): 當(dāng)化學(xué)毒物反復(fù)多次給動物染毒、化學(xué)毒物進(jìn)入機(jī)體的速度(或總量)超過代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時(shí)，化學(xué)毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留?；瘜W(xué)毒物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫(depot)。機(jī)體常見的儲存庫有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。, 蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ) 一種外源化學(xué)物有無蓄積作用是評定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)安全系數(shù)的一種依據(jù),物質(zhì)蓄積( material accumulation ) ：實(shí)驗(yàn)動物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠測得機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物 功能( 損傷 )蓄積( functional accumulation)：有的化學(xué)物在長期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用,功能蓄積可能是 由于貯存體內(nèi)的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢出物質(zhì)的蓄積 或者是由于每次機(jī)體接觸化學(xué)物之后 所引起的損害累積所致,蓄積系數(shù)(accumulation coefficient) 是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量ED50(n)與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量ED50(1)的比值，即： ED50(n) LD50(n) K= 或 K= ED50(1) LD50(1),87,第三節(jié) 短期、亞慢性、慢性毒性作用,88,一、短期重復(fù)劑量毒性,短期重復(fù)劑量毒性：實(shí)驗(yàn)動物或人連續(xù)暴露外源化學(xué)物1430天所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。 短期重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)具有預(yù)備和篩選的性質(zhì)，尤其是28天短期毒性試驗(yàn)，基本成為一種初步估計(jì)長期暴露可能引起毒效應(yīng)的經(jīng)濟(jì)實(shí)用的短期重復(fù)毒性試驗(yàn)。,89,二、亞慢性毒性作用,90,亞慢性毒性(subchronic toxicity) 是指人或?qū)嶒?yàn)動物連續(xù)接觸較長時(shí)間、較大劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。 接觸時(shí)間通常指介于單次染毒和10%動物壽命的范圍，通常為16個(gè)月 。 較大劑量是相對低劑量而言，沒有明確的劑量范圍下限，上限一般小于急性LD50。,（一 ）基本概念,91,1. 研究受試物亞慢性毒性劑量反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和其觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL），提出安全限量參考值。,（二）亞慢性毒性試驗(yàn)的目的,92,2.觀察受試物亞慢性毒性效應(yīng)譜、毒作 用特點(diǎn)和毒作用靶器官。 3.觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性。 4.為慢性毒理試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)。,（二）亞慢性毒性試驗(yàn)的目的,93,5. 為在其他試驗(yàn)（急性、亞急性、其他動物種屬的亞慢性試驗(yàn)等）中發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，比較不同動物物種毒效應(yīng)的差異，為受試物毒性機(jī)制研究和將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。,（二）亞慢性毒性試驗(yàn)的目的,94,（三）亞慢性毒性試驗(yàn)方法的要點(diǎn),1. 實(shí)驗(yàn)動物的選擇,（1）種屬和品系 （2）性別、年齡和動物數(shù) （3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境,95,嚙齒類和非嚙齒類：大鼠、犬和猴 經(jīng)皮毒性試驗(yàn)，可用兔或豚鼠。 大鼠常用Wistar和Sprague Dawley。 犬多選用Beagle犬。,（1）種屬和品系,96,雌雄各半。 選擇離乳不久的動物，大鼠6-8周齡（體重80-100g） 同組動物體重相差不應(yīng)超過平均體重 的10%，組間平均體重不超過5% 大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴 每組不少于6只,（2）性別、年齡和動物數(shù),97,亞慢性毒性試驗(yàn)周期較長，觀察指標(biāo)較多，實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量、喂飼條件和試驗(yàn)環(huán)境明顯影響受試物的毒性反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)動物分四級：普通級、清潔級、無特定病原體級（SPF級）、無菌級。,（3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境,98,使用清潔級及以上等級大小鼠，飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。 保持符合規(guī)范的溫度、日溫差、濕度、換氣次數(shù)、氣流速度、壓強(qiáng)梯度、落下菌數(shù)、空氣潔凈度、氨濃度、噪聲和照度。,（3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境,99,環(huán)境嚴(yán)格控制人員、物品和環(huán)境空氣的進(jìn)出。 合理營養(yǎng)的飼料，潔凈的飲水，清潔無污染的墊料和籠具。 不同項(xiàng)目的試驗(yàn)應(yīng)分室進(jìn)行。 人工控制晝夜交替。,（3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境,100,2. 染毒方式,盡量選擇和人類接觸途徑相似的方式； 與預(yù)期進(jìn)行的慢性毒作用研究的接觸途 徑相一致。 以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮染毒為多。 染毒頻率通常每日一次，連續(xù)給予，如 試驗(yàn)期為3個(gè)月以上，可每周6次。,101,（1）經(jīng)口染毒途徑：灌胃法、喂飼法、膠囊法。建議灌胃法，特別是要求染毒量準(zhǔn)確性高。犬采用膠囊法或灌胃法。長期灌胃給藥需熟練的技術(shù)和非常認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度，出現(xiàn)失誤，均應(yīng)如實(shí)記錄，以利試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確評價(jià)。,102,（2）經(jīng)呼吸道染毒的時(shí)間2-6h/d，設(shè)計(jì)需要可縮短或延長。工業(yè)毒物可縮短至1h，環(huán)境污染物可延長至8h （3）一些特殊染毒途徑的亞慢性毒性試驗(yàn)，受目前技術(shù)條件的限制較難進(jìn)行，常不能確保給藥量的準(zhǔn)確。如長期反復(fù)的直腸用藥、眼睛用藥等，期待研制出完善的專用裝置。,103,（4）隨著注射劑型的新藥增多，需經(jīng)常進(jìn)行注射染毒長期毒性試驗(yàn)。犬靜脈注射比較易行、常用。大鼠連續(xù)反復(fù)長期的靜脈注射十分困難，有熟練的技術(shù)人員，也難以進(jìn)行的。可用其他注射途徑代替，如腹腔注射。盡管大鼠有較強(qiáng)的抗感染能力，但長期反復(fù)腹腔注射仍應(yīng)注意無菌操作。,104,（5）在進(jìn)行亞慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，最好應(yīng)結(jié)合進(jìn)行毒代動力學(xué)血藥濃度的監(jiān)測。為了維持實(shí)驗(yàn)動物體液中有一個(gè)準(zhǔn)確的血藥濃度水平，保持受試物生物學(xué)效應(yīng)每日相似性，亞慢性毒性試驗(yàn)每日染毒的時(shí)間應(yīng)保持一致。在每日上午進(jìn)行，給藥后喂食。,105,3. 劑量選擇和分組,設(shè)3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性（溶劑）對照組。 高劑量組應(yīng)能引起明顯的毒性或少量動物的死亡（少于10%）。 低劑量組應(yīng)無中毒反應(yīng)，相當(dāng)于未觀察到有害作用劑量（NOAEL）。,106,3. 劑量選擇和分組,高低劑量組間設(shè)置1個(gè)中劑量組，比較理想的中劑量組約相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）。 高、中、低劑量組距以3-10倍為宜，不少于2倍。 對于藥物，大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍。,107,3. 劑量選擇和分組,在實(shí)際工作中，由于受試物多樣性和試驗(yàn)中多種因素的變化，亞慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和確定是很不容易的，需要具有豐富的毒理學(xué)經(jīng)驗(yàn)。,108,4. 觀察指標(biāo),對經(jīng)外源化學(xué)物染毒后的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行全面、系統(tǒng)、深入的觀察檢測是亞慢性毒性試驗(yàn)必做的工作，檢查的時(shí)間包括染毒前、試驗(yàn)過程中、染毒結(jié)束時(shí)和染毒結(jié)束后的恢復(fù)期做檢查。檢查的項(xiàng)目包括一般性指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、系統(tǒng)尸解和病理組織學(xué)檢查、其他特殊指標(biāo)檢查。,亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)檢測各種毒性終點(diǎn)的流程圖,亞慢性、慢性,毒性試驗(yàn),過程中,外觀,生長和發(fā)育,行為功能,毒性體征,生物體液,最終體重,臟器濕重,臟,/,體比,活殺解剖,器官/組織,大體尸解,固定/染色,顯微鏡檢查,血液學(xué),血清-化學(xué)-生化學(xué),尿分析,生物學(xué)標(biāo)志,酶,內(nèi)源性成分,膽汁,尿,110,指外觀體征和行為活動，糞便性狀、食量及體重變化等，能綜合反映毒物對機(jī)體的毒作用，是敏感的綜合毒效應(yīng)指標(biāo)。在試驗(yàn)過程中，應(yīng)詳細(xì)記錄，仔細(xì)分析，可以從中發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)毒物的毒性特征。,（1）一般性指標(biāo),111,觀察實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)的外觀體征和行為改變，記錄各癥狀出現(xiàn)的時(shí)間和先后次序，包括食欲、活動、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等，尤其要留意動物被毛的光潔度與色澤、眼分泌物、呼吸、神態(tài)、行為等。有助于分析化學(xué)毒物損害機(jī)體的部位及程度。,外觀體征、行為活動,112,是一個(gè)敏感、客觀的指標(biāo)，反映了受試物對實(shí)驗(yàn)動物的生長發(fā)育及一般狀態(tài)的影響。 如果受試組動物體重增長比對照組低10%，提示是由受試物引起的毒效應(yīng) 如果各劑量組體重增長改變有劑量-反應(yīng)關(guān)系，肯定是一種毒性效應(yīng)。 每周稱重一次，3個(gè)月后每2周稱重一次。,動物體重,113,每月觀察并記錄動物的飼料消耗量，計(jì)算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)（g體重/100g飼料）。比較各染毒組與對照組動物的食物利用率，有助于了解化學(xué)物的毒性效應(yīng)，尤其將體重指標(biāo)和食物利用率結(jié)合起來分析。,食物利用率,114,食物利用率,如果受試物影響食欲，則每日進(jìn)食量減少，體重增長會受影響，但食物利用率不一定改變；如果受試物干擾了食物的吸收或代謝，雖然不一定影響食欲，但體重增長卻減慢，因而食物利用率也會有所改變。,115,通常包括血、尿常規(guī)和血液生化指標(biāo)檢測。 目的是發(fā)現(xiàn)受試物所致器官損傷和功能紊亂，體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化和排泄的重要器官肝和胃的功能是檢查重點(diǎn)，血液是另一個(gè)重要的靶器官。,（2）實(shí)驗(yàn)室檢查,116,血液學(xué)檢查：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間等。 尿液檢查:外觀、pH值、蛋白、糖、潛血和沉淀物鏡檢等，可提供與毒物有關(guān)的靶器官毒性和中間代謝產(chǎn)物的信息。,117,血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN0、總量白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽紅素(T-BIL)、肌酐(Crea)、總膽固醇(T-CHO)等。,血液生化檢查：,118,大鼠作試驗(yàn)，不需在給藥前作實(shí)驗(yàn)室檢查。 大動物犬等試驗(yàn)，染毒前檢測12次。 恢復(fù)期試驗(yàn)，在結(jié)束時(shí)作實(shí)驗(yàn)室檢查，對判斷受試物作用的可逆性、延遲性有重要意義。,119,不影響實(shí)驗(yàn)動物生理功能的最大取血量為其總血量的10%。 總血量約為50ml/kg，0.3kg的大鼠約有15ml血液，一次取血量不應(yīng)超過1.5ml。,120,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)活殺實(shí)驗(yàn)動物，作系統(tǒng)解剖，進(jìn)行詳細(xì)的肉眼檢查，測定臟器重量并作組織病理學(xué)檢查。在試驗(yàn)中間死亡或處于瀕死狀態(tài)的動物，亦應(yīng)作及時(shí)的系統(tǒng)尸解和病理學(xué)檢查。,（3）系統(tǒng)尸解和病理組織學(xué)檢查,121,臟器系數(shù)或稱臟體比，指某個(gè)臟器的濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占的質(zhì)量，表示為臟器質(zhì)量（g）/體重（100g）。適用于實(shí)質(zhì)性臟器，若某臟器的臟器系數(shù)增大或減小，反映該臟器的腫大或縮小，如增生、充血、水腫、萎縮等變化。,臟器重量和臟器系數(shù),122,目的 是確定化學(xué)毒物對機(jī)體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度，從病理學(xué)角度尋找化學(xué)毒物與病理改變的劑量效應(yīng)關(guān)系，為了解化學(xué)毒物的毒效應(yīng)及其機(jī)制提供依據(jù)。,病理學(xué)檢查,123,檢查內(nèi)容： 大體檢查、常規(guī)病理組織學(xué)檢查、酶組織化學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查等，分別從大體、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至分子水平等多個(gè)方面發(fā)現(xiàn)化學(xué)毒物的毒效應(yīng)。,病理學(xué)檢查,124,根據(jù)受試物毒性資料、試驗(yàn)中的觀察和受試物的結(jié)構(gòu)等線索增加一些檢查項(xiàng)目。 推測受試物可能對心血管系統(tǒng)有毒性，進(jìn)行心電圖、血壓、眼底檢測； 對神經(jīng)系統(tǒng)有影響，進(jìn)行神經(jīng)行為、神經(jīng)反射等檢查；,（4）其他指標(biāo)的檢查,125,對電解質(zhì)、微量元素代謝有毒作用，則檢測血鈣、血磷等含量； 增加眼科、骨髓象檢查等。 增加酶組織化學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查等。,（4）其他指標(biāo)的檢查,126,為充分了解受試物的中毒特征，獲得盡可能多的揭示毒性靶器官和中毒機(jī)理的線索，亞慢性毒性試驗(yàn)應(yīng)認(rèn)真仔細(xì)的選擇觀察指標(biāo)，如能有特異性指標(biāo)更好。,（4）其他指標(biāo)的檢查,127,特異性指標(biāo)（生物學(xué)標(biāo)志）是指能反映毒物對機(jī)體毒作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)，常與其毒作用機(jī)制有關(guān)。確定特異性指標(biāo)的難度較大。,（4）其他指標(biāo)的檢查,128,在仔細(xì)分析化學(xué)毒物的急性、亞急性毒性試驗(yàn)過程中動物中毒表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和了解其特殊的化學(xué)基團(tuán)找出線索，然后設(shè)計(jì)測試項(xiàng)目和方案。,129,三、 慢性毒性作用,慢性毒性(chronic toxicity)：指人和試驗(yàn)動物長期(甚至終生)反復(fù)接觸低劑量化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。 “長期”，一般是指2年。大鼠相當(dāng)于終生染毒，兔相當(dāng)于生命期的36%，犬為20%，猴為13%。,130,1. 研究慢性毒性劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。確定長期接觸造成有害作用的最低劑量(LOAEL)或閾劑量和造成有害作用的劑量(NOAEL)，為制定人類接觸時(shí)的安全限量標(biāo)準(zhǔn)，如最高容許濃度(MAC)和每日容許攝入量(ADI)以及危險(xiǎn)度評價(jià)提供毒理學(xué)依據(jù)。,慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康?131,2. 觀察慢性毒性效應(yīng)譜、毒作用特 點(diǎn)和毒作用靶器官。 3. 觀察慢性毒性作用的可逆性。 4. 為毒性機(jī)制研究和將毒性結(jié)果外 推到人提供依據(jù)。,慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康?132,慢性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn),與亞慢性相同。最好用純系動物并將同窩動物均勻分配到各組。 嚙齒類首選大鼠，非嚙齒類為犬或猴。 每個(gè)劑量組的動物數(shù)應(yīng)滿足試驗(yàn)結(jié)束時(shí)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的要求，如每組大鼠4060只，狗810只，雌雄各半。,（一）實(shí)驗(yàn)動物的選擇,133,應(yīng)選擇年齡較小的動物，一般選初斷奶的大鼠或小鼠，即小鼠出生后3周（體重約1015g），大鼠出生34周（體重約5070g），狗46月齡。 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)劑量組每性別的嚙齒類動物數(shù)不少于10只，非嚙齒類不少于4只。,（一）實(shí)驗(yàn)動物的選擇,134,工業(yè)毒物染毒6個(gè)月或更長時(shí)間，環(huán)境毒物與食品則要求1年以上或2年。 多采用經(jīng)口染毒。染毒5-6d/w。 根據(jù)需要可經(jīng)皮膚染毒和經(jīng)