kras和egfr檢測(cè)與臨床應(yīng)用.ppt

,匯報(bào)內(nèi)容,KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義 ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn) 等位特異性引物設(shè)計(jì) KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介,KRAS和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義,KRAS背景,KRAS是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控； EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)； KRAS是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。,KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效,KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；,KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者,Karapetis CS, 2008, N Eng J Med,結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南,歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。 美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療； 美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效； 美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。 中國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版） 。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤 K-ras 基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。,KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效,KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；,KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）,Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol,非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南,美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。,KRAS主要突變位點(diǎn),在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (5%)；在肺癌中，約97%的KRAS突變發(fā)生于codon12、13，其余位于codon61和146。,EGFR突變背景,EGFR基因位于染色體7p11.2，大小約200kb，是上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。 非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10%左右，而在東亞為30-50%。其中在亞洲、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR突變率最高，達(dá)70-80%。,EGFR突變背景,研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼、厄洛替尼的療效密切有關(guān)。其中EGFR突變的患者對(duì)吉非替尼、厄洛替尼治療敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。 吉非替尼、厄洛替尼作為一線藥物治療非小細(xì)胞肺癌，相比傳統(tǒng)的化療可以取得更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS），且副作用相對(duì)較小，患者容易耐受，但總體生存期（OS）并未延長(zhǎng)。 EGFR-TKI目前主要用于非小細(xì)胞肺癌一線、二線和維持治療。我國(guó)大部分醫(yī)生將其用于二線（69.4%）治療，41.7%的醫(yī)生將其用于一線治療，27.8%的醫(yī)生將其作為維持治療藥物。,EGFR突變影響肺癌藥物療效,研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。,Mok T.S. 2009, N Eng J Med Maemondo M. 2010, N Eng J Med,EGFR突變檢測(cè)相關(guān)指南,美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011版的癌癥治療指南中明確指出： EGFR突變，尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變，與腫瘤對(duì)TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系。而部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥，與EGFR外顯子20突變密切相關(guān)。 美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）在JCO上發(fā)表報(bào)告：EGFR-TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物，有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。 歐洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）僅對(duì)攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效，平均無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)3.5月。 美國(guó)FDA（2013）批準(zhǔn)對(duì)擬采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的試劑盒（therascreen EGFR RGQ PCR Kit和 cobas EGFR Mutation Test）； 我國(guó)非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南中也明確指出EGFR突變，尤其是19號(hào)外顯子缺失突變與腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的敏感度有重要關(guān)系；對(duì)腺癌、大細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類(lèi)型，EGFR檢測(cè)為一類(lèi)推薦。,EGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測(cè)29個(gè)）,EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系,ADx EGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè),ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn),ARMS-PCR原理,ARMS是Amplification Refractory Mutation System (擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫(xiě)。 根據(jù) PCR過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè), 當(dāng)引物 3 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí), 產(chǎn)物將不能延伸。 因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其3末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。,ARMS-PCR原理,Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,PCR產(chǎn)物檢測(cè)-Real time PCR,每個(gè)PCR循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)，不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號(hào) 相比凝膠電泳：更快，可定量，無(wú)PCR產(chǎn)物污染 信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環(huán)探針(廈門(mén)艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-pro,Figure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.,Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer,應(yīng)用于Real time-PCR的ARMS-PCR,ARMS技術(shù)特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高（0.1-1%） 操作簡(jiǎn)便 周期短 不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染 適用樣本類(lèi)型多（如FFPE） 精確突變類(lèi)型,缺點(diǎn)： 方法建立需時(shí)較長(zhǎng) 僅能檢測(cè)已知突變,測(cè)序法與ARMS法相比較,操作流程及數(shù)據(jù)解讀,檢測(cè)流程與質(zhì)量控制,標(biāo)本準(zhǔn)備,DNA抽提,突變檢測(cè),分析報(bào)告,標(biāo)本種類(lèi) 標(biāo)本量,SOP OD 260/280 （新鮮組織） qPCR （FFPE）,SOP 陽(yáng)性及陰性對(duì)照 問(wèn)題及解決,SOP 報(bào)告標(biāo)準(zhǔn) 判讀形式及檢查,使用ARMS的KRAS突變檢測(cè)試劑盒,使用ARMS的EGFR突變檢測(cè)試劑盒,等位特異性引物設(shè)計(jì),KRAS基因序列和常見(jiàn)突變,KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 常見(jiàn)突變：,三引物設(shè)計(jì)原理,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,三引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 野生型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51 突變型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 19nt，49 下游引物（R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 25nt，54,三引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 選擇序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3 互補(bǔ)鏈： 3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5 下游引物： 5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3,3端增加錯(cuò)配,如果3端是弱錯(cuò)配（C/A或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或C/T）才可阻斷3端的擴(kuò)增； 如果3端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3端的擴(kuò)增； 當(dāng)3端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G 或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配。 野生型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3 下游引物（R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3,四引物設(shè)計(jì),四引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 內(nèi)引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內(nèi)引物（R） 5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3 外引物（F） 5-ATGACTGAATATAAACT-3 外引物（R） 5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3,KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介,KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì),KRAS序列： ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT 3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT 4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT 5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT 6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT 7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC 8. 參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-3 9. 下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3 鎖核酸阻滯探針(野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA