《CR與DNA測(cè)序》PPT課件.ppt

知識(shí)體系,PCR技術(shù),簡(jiǎn)史,原理,反應(yīng)體系,技術(shù)特點(diǎn),結(jié)果檢測(cè),測(cè)序技術(shù) 原理,衍生技術(shù),A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母鏈DNA,復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉,子代DNA,參與DNA復(fù)制的物質(zhì),底物(substrate): dNTP 加入 聚合酶(polymerase): DNA聚合酶 分離 模板(template) : DNA母鏈 提取 引物(primer): 人工合成 其他的酶和蛋白質(zhì)因子 Mg2+, PCR儀,Part I 聚合酶鏈反應(yīng) （Polymerase chain reaction, PCR）,一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 PCR的實(shí)現(xiàn) 1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系，以及DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。,第一節(jié) 常規(guī)PCR技術(shù),提高效率的思路,雙鏈,單鏈,循環(huán),DNA聚合酶,儀器改進(jìn),高溫,低溫,PCR的改進(jìn)與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是： Klenow酶不耐高溫， 90會(huì)變性失活，每次循環(huán)都需 要重新添加。 引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物 之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的 DNA片段不均一。,這種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致聚合酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等從一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)：,耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%， 在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng) 2h后其殘留活性是原來的40%。 在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。 大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度 (2.0Kb)。,由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。,二、PCR技術(shù)的基本原理,類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,1、基本原理,退火（annealing）（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，將溫度降至引物的Tm值左右或以下（55左右），引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，形成雜交鏈。,變性（denature）：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。,延伸(extension)：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。,以上三步為一個(gè)循環(huán)，約需24分鐘，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，大約23小時(shí)后，新生DNA片段理論上可達(dá)到2n-1個(gè)分子拷貝。,PCR反應(yīng)的基本原理示意圖,3 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,變性（950C，30s）,3TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5,5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,退火（450C550C，30s 1min）,5ataagcccgaaaggt3,3 aacggctaggcattt5,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,延伸（720C，1 幾分鐘）,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt,循環(huán) 25 30,5,3,5,3,目的DNA擴(kuò)增106-7倍,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,目的片段？,1、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 （50100ul）,三、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件,10緩沖液 1/10體積 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各1u mol/L 模板DNA 1 02 1 05 拷貝 Taq DNA聚合酶 1 5u Mg2+ 1.5mmol/L 雙蒸水 至50100ul,2、PCR引物設(shè)計(jì),PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴(kuò)增片段3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,5,3,5,3,基準(zhǔn),引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 端的互補(bǔ)重疊。,引物設(shè)計(jì)的基本原則：,引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。 引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。,幾種常見引物設(shè)計(jì)缺陷,引物設(shè)計(jì)軟件,Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）* Oligo6 （引物評(píng)價(jià)） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在線服務(wù)）,3、模板的制備,PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。,標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。,4、PCR反應(yīng)條件的控制,PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L,反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 變性溫度和時(shí)間 95，30s 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸溫度和時(shí)間 72，1min/kb（10kb內(nèi)） Tm值=4(G+C) 2(A+T),循環(huán)次數(shù) 一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。,四、PCR反應(yīng)特點(diǎn),PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；（關(guān)鍵） 堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異性與保守性。,1、特異性強(qiáng),2、靈敏度高,PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)級(jí)增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。,3、簡(jiǎn)便、快速,不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。,4、對(duì)標(biāo)本的純度要求低,五、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析,1、凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳: 通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。,紫外線/燈下觀察結(jié)果,594bp,600bp,2652bp,800bp,50bp,350bp,M 1 2 3,HCMV PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果,PCR擴(kuò)增結(jié)果,9 8 7 6 5 4 3 2 1,467bp,205bp,2、酶切分析 3、分子雜交 4、核酸序列分析,酶切結(jié)果,酶切結(jié)果,第二節(jié) 常用的PCR衍生技術(shù),（1）逆轉(zhuǎn)錄 所謂逆轉(zhuǎn)錄，是指以RNA為模板，利用宿主細(xì)胞中4種dNTP為原料在引物的3端以5 3方向合成與RNA互補(bǔ)的DNA鏈的過程，此過程與中心法則相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）。在逆轉(zhuǎn)錄過程中以RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptnase）。實(shí)際上，逆轉(zhuǎn)錄并非轉(zhuǎn)錄，而是一種復(fù)制形式，必須有引物存在才能完成。,1. 逆轉(zhuǎn)錄PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR）,（2）逆轉(zhuǎn)錄酶,1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，以后發(fā)現(xiàn)所有RNA腫瘤病毒中都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA編碼的，是多功能酶： 具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一樣，沿5 3方向合成DNA，并需要引物提供3-OH ；,具有RNA酶H（RNaseH）活性，能特異性水解RNA-DNA雜交體上的RNA； 具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，以逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA為模板合成互補(bǔ)DNA鏈。 逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)DNA沒有3 5外切酶活性，因此它沒有校對(duì)功能，錯(cuò)誤率相對(duì)較高。,細(xì)胞總RNA的檢測(cè),1. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-CMV-E6/E7 2. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-K14-E6/E7,3. RT-PCR的反應(yīng)體系,逆轉(zhuǎn)錄體系,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在420C進(jìn)行1h 后，加熱至950C5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。取2 l反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。, HPV-16 E6/E7在轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果,1. Marker ：100bp DNA Marker ; 2. RT-PCR 產(chǎn)物：E6/E7基因; 3. 陰性對(duì)照 RT-PCR鑒定pAd-CMV-E6/E7 轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中E6/E7的表達(dá),2 . 巢式PCR 先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴(kuò)增獲取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特異性。適于模板含量較低的樣本。,目的片段,第一輪PCR,第二輪PCR,3. 多重PCR 在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，由于每一對(duì)引物與模板DNA的不同片段相結(jié)合，因而擴(kuò)增片段長(zhǎng)短不同。由此可檢測(cè)是否存在某些基因片段的缺失或突變。,片段1,片段2,DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)。它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的27。,4. 甲基化特異性PCR,基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對(duì)特異性的引物對(duì)所測(cè)基因的同一核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。,針對(duì)擴(kuò)增的DNA甲基化區(qū)域，一般需要設(shè)計(jì)三條引物：正常序列引物、甲基化對(duì)應(yīng)引物以及DNA序列修飾引物。通過三組PCR，判斷DNA序列中甲基化的存在與否。,5. 原位PCR,在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列。, 固定組織或細(xì)胞,蛋白酶K消化處理,PCR擴(kuò)增：原位PCR儀,雜交,顯微鏡觀察結(jié)果,6. 定量PCR,廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測(cè)，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。 狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測(cè)PCR過程（監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對(duì)照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。, 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種： 熒光探針和熒光染料,TaqMan熒光探針： PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。,在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板雜交。進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中， Taq酶的53外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。 從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。,SYBR熒光染料： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。,擴(kuò)增曲線：4個(gè)階段, Ct值（循環(huán)閾值，Cycle threshold）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),熒光域值（threshold）：PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：熒光信號(hào)開始由本底信號(hào)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。,熒光閾值,循環(huán)次數(shù), Ct值與起始模板的關(guān)系,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。,Part II DNA測(cè)序技術(shù),DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，有助于探索基因結(jié)構(gòu)與功能、基因與疾病關(guān)系，進(jìn)而推動(dòng)生命科學(xué)研究獲得質(zhì)的飛躍。測(cè)定基因組的全部核苷酸序列、閱讀和分析全部遺傳信息，正是人類基因組計(jì)劃（human genome project, HGP)的最主要目標(biāo)之一。,將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序。 DNA 序列測(cè)定方法： 1. Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個(gè)反應(yīng)。 2.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)。 3.自動(dòng)測(cè)序法。,DNA 測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger 法、酶促法）和化學(xué)裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者均依賴于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。不管是酶促法還是化學(xué)法，都是分為4個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，寡核苷酸鏈分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。4種反應(yīng)體系的寡核苷酸鏈產(chǎn)物，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，讀出待測(cè)DNA的連續(xù)序列。,一、 Sanger 雙脫氧鏈終止法,（一）原理(單鏈) DNA鏈中的核苷酸是以3，5-磷酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2-脫氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 雙脫氧鏈終止法中被摻入了2，3-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí), 由于它沒有3- OH，,不能再與其它的脫氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，則新生鏈的末端為T、C或G，根據(jù)這個(gè)原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。,Sanger,雙脫氧核苷三磷酸,互補(bǔ)鏈合成過程,以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：以DNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則逐個(gè)將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3-OH末端，形成正確的模板DNA互補(bǔ)鏈；能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物，將其摻入寡核苷酸鏈的3 末端而終止新生互補(bǔ)鏈的延伸。,如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一種少量的2,3 ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。 在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機(jī)）終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。,在測(cè)序反應(yīng)中通常設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時(shí)加入一種DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5 3外切核酸酶活性）、其中一管中分別加入1種 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP）以及4種dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP ），引物末端用放射性核素標(biāo)記， ddTTP的比例很?。?:10），因此摻入的位點(diǎn)是隨機(jī)的，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臈l件下溫育，將會(huì)有不同長(zhǎng)度的DNA片段合成。它們都具有相同的5末端，3末端都因摻入了ddTTP而以T結(jié)尾。在其它三管中同理加入相應(yīng)的ddNTP。,Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖,+G,+ddG,GATTCG,GATTC ddG,GATTCGAG,GATTCGA ddG,GG G,引物,電泳,雙脫氧法測(cè)序原理示意圖,幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時(shí)，Maxam和Gilbert于1977年建立了一種以化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的DNA序列分析法，稱為Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法。,二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法,（一） Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法原理,基本原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混和物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據(jù)X線片底板上顯示相應(yīng)帶譜，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序。,化學(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在進(jìn)行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)前，首先對(duì)待測(cè)DNA片段作末端標(biāo)記，使其末端(5端或者是3端)帶上放射標(biāo)記。如果待測(cè)DNA是雙鏈，必須使其形成末端標(biāo)記的單鏈。,對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行： 第一步是在4個(gè)反應(yīng)管中分別以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸對(duì)特定的堿基進(jìn)行化學(xué)修飾； 第二步是以六氫吡啶取代被修飾的堿基并將DNA鏈斷裂。,DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系 反應(yīng)體系 堿基修飾試劑 堿基修飾反應(yīng) 主鏈斷裂試劑 斷裂點(diǎn) G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C和T C 肼