生物化學(xué)酶的催化機(jī)制PPT課件.ppt

酶的催化機(jī)制,酶催化機(jī)理研究的主要方法,（1）找出保守性的氨基酸殘基 得到不同生物來源的同一種酶的一級結(jié)構(gòu)以后，將 它們進(jìn)行對比，找出高度保守的氨基酸，可以獲得一 些可能與催化有關(guān)的氨基酸殘基的信息。在酶的進(jìn)化 中，保守性越高的氨基酸殘基對酶的三維結(jié)構(gòu)和功能 貢獻(xiàn)越大，這些氨基酸殘基很可能直接與酶的催化機(jī) 制有關(guān)。例各種絲氨酸蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)對比，His （組氨酸）57、Asp（天冬氨酸）102、Ser195不變， 事實(shí)證明，這三種氨基酸殘基直接參與肽鍵的水解。,（2）三維結(jié)構(gòu)的研究 酶的三維結(jié)構(gòu)決定了酶的功能，如果得到酶的三維 結(jié)構(gòu)信息，對酶的催化機(jī)制的研究提供最直接的線索 。獲得酶三維結(jié)構(gòu)的方法有X射線衍射和NMR。 （3）定點(diǎn)突變 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使對蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變變的很 容易，所以只要得到一個(gè)酶的基因，就可以對其氨基 酸序列進(jìn)行任意的突變。如果對一個(gè)酶氨基酸殘基進(jìn) 行有的放矢的突變，會(huì)對酶的作用機(jī)制研究提供有價(jià) 值的信息。把胰蛋白酶活性中心裂縫底部的Asp189突 變成不帶電荷或帶正電荷的氨基酸殘基，胰蛋白酶活 性完全喪失。胰蛋白酶只水解堿性氨基酸殘基與其他 氨基酸氨基形成肽鍵，所以Asp189通過側(cè)鏈的負(fù)電荷 與底物上的堿性氨基酸殘基帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合。,（4）動(dòng)力學(xué)分析 動(dòng)力學(xué)分析可以為研究酶的作用機(jī)制提供有用的數(shù) 據(jù)。 （5）化學(xué)修飾 用雙功能試劑對酶的修飾有助于確定在三維結(jié)構(gòu)上 相鄰的基團(tuán)。借助底物或競爭性抑制劑的保護(hù)，可以 通過化學(xué)修飾確定活性中心的氨基酸殘基的性質(zhì)。 例：假定一個(gè)酶分子上有6個(gè)Csy殘基，但又無法確 定它的活性中心是否有或者有幾個(gè)Csy殘基，可以分 別在有或無過量底物存在下，用碘代乙酸修飾酶，然 后進(jìn)行對比，在底物保護(hù)的情況下，不能被修飾的 Csy殘基就在活性中心。,過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說,根據(jù)過渡態(tài)理論，在任何一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，反應(yīng)物需要到達(dá)一個(gè)特定的高能狀態(tài)以后才能發(fā)生反應(yīng)。這種不穩(wěn)定的高能狀態(tài)被稱為過渡態(tài)。達(dá)到過渡態(tài)要求反應(yīng)物必須含有足夠的能量以克服活化能，然而，一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中各反應(yīng)物分子具有不同的能量，只有某些反應(yīng)物才含有足夠的能量去進(jìn)行反應(yīng)。 一個(gè)雙分子HA-HB和單原子HC之間形成一個(gè)新的HB-HC和HA ，反應(yīng)發(fā)生需要形成不穩(wěn)定的過渡態(tài)HA-HB-HC,HA-HB + HCHA-HB-HC（過渡態(tài)）HB-HC + HA,G活為反應(yīng)活化能HA-HB-HC為過渡態(tài)中間物。過渡態(tài)中間物既不是產(chǎn)物，也不是底物，而是介于舊化學(xué)鍵減弱，新化學(xué)鍵開始形成的一種不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)狀態(tài)?；罨芤膊皇欠磻?yīng)的總自由能變，自由能變與反應(yīng)平衡時(shí)底物濃度和產(chǎn)物濃度有關(guān)，而活化能與反應(yīng)速度有關(guān)。活化能越低含有足夠能量的反應(yīng)物分子越多，反應(yīng)發(fā)生的越快。提高溫度或其他因素的作用可以促進(jìn)更多的反應(yīng)物達(dá)到過渡態(tài)，提高反應(yīng)速度。所有的催化劑都是通過降低活化能加快反應(yīng)速率。,過渡態(tài)中間物,化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)及其前后的自由能變化,酶與過渡態(tài)的親和力要比對基態(tài)（底物）的親和力高得多，酶的催化源于其對過渡態(tài)的穩(wěn)定作用。 酶把反應(yīng)分成幾步，因?yàn)槊概c過渡態(tài)的中間物結(jié)合比和基態(tài)（底物）的結(jié)合更牢、更好而穩(wěn)定反應(yīng)的過渡態(tài)，從而降低活化能，加快反應(yīng)速度。 單底物反應(yīng)SP：如果沒有酶，S要克服能障變?yōu)檫^渡態(tài)后再反應(yīng)生成P。如果有酶催化，通過分子碰撞，酶與底物先形成可逆復(fù)合物ES。ES形成的結(jié)合能一部分用來驅(qū)動(dòng)過渡態(tài)復(fù)合物形成。經(jīng)過EP復(fù)合物，最終釋放出產(chǎn)物P和自由酶E。形成過渡態(tài)復(fù)合物需要的活化能比單獨(dú)形成過渡態(tài)底物所需的活化能低，導(dǎo)致總反應(yīng)活化能顯著下降，所以酶促反應(yīng)速率大大增加。但是，酶不能改變反應(yīng)的總自由能變，也就是它不影響反應(yīng)的平衡方向。,酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)過程的自由能變化,過渡態(tài)穩(wěn)定的化學(xué)機(jī)制,與酶催化相關(guān)聯(lián)的過渡態(tài)穩(wěn)定是酶活性中心結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性以及活性中心與結(jié)合底物之間的相互作用的必然結(jié)果。酶充分使用一系列的化學(xué)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)過渡態(tài)的穩(wěn)定并由此加速反應(yīng)。這些機(jī)制歸納起來主要有六種機(jī)制： （1）鄰近定向效應(yīng)； （2）廣義的酸堿催化； （3）靜電催化； （4）金屬催化； （5）共價(jià)催化； （6）底物形變。,鄰近定向效應(yīng),鄰近定向效應(yīng)是指兩種或兩種以上的底物（特別是雙底物）同時(shí)結(jié)合在酶活性中心上，相互靠近（鄰近），并采取正確的空間取向（定向），這樣大大提高了底物的有效濃度，使分子間反應(yīng)近似分子內(nèi)反應(yīng)從而加快了反應(yīng)速度。 底物與活性中心的結(jié)合不僅使底物與酶催化基團(tuán)或其它底物接觸，而且強(qiáng)行“凍結(jié)”了底物的某些化學(xué)建的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，促使它們采取正確的方向，有利于鍵的形成。,廣義的酸堿催化,廣義的酸堿催化是指水分子以外的分子作為質(zhì)子供體或受體參與催化，這種機(jī)制參與絕大多數(shù)酶的催化。蛋白質(zhì)分子上的某些側(cè)鏈基團(tuán)（如Asp、Glu和His）可以提供質(zhì)子并將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)的過渡態(tài)中間物而達(dá)到穩(wěn)定過渡態(tài)的效果。如果一個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的pKa值接近7，那么該側(cè)鏈基團(tuán)就可能是最有效的廣義的酸堿催化劑。蛋白質(zhì)分子上的His組氨酸殘基的咪唑基就是這樣的基團(tuán)，因此它作為很多酶的催化殘基。,廣義的酸堿催化和特定的酸堿催化的差別： （1）特定酸堿催化是H+或OH-加速反應(yīng)，廣 義的酸堿催化是酶分子上的酸性和堿性基團(tuán)催 化反應(yīng)。 （2）緩沖溶液對他們的影響不同。特定酸堿 催化反應(yīng)速率只取決于pH，與緩沖溶液濃度無 關(guān)，廣義的酸堿催化，緩沖溶液有助于通過提 供或奪取質(zhì)子來穩(wěn)定過渡態(tài)，反應(yīng)速度取決于 底物和酶的質(zhì)子化狀態(tài)，還取決于緩沖溶液的 濃度。緩沖溶液濃度的升高提高了廣義酸堿催 化的效率。,靜電催化,活性中心電荷的分布可用來穩(wěn)定酶促反應(yīng)的過渡態(tài)，酶使用自身帶電基團(tuán)去中和一個(gè)反應(yīng)過渡態(tài)形成時(shí)產(chǎn)生的相反電荷而進(jìn)行的催化稱為靜電催化。 有時(shí)，酶通過與底物的靜電作用將底物引入到活性中心。,溶菌酶Glu35將質(zhì)子交給糖苷鍵上的O原子以后，O因此帶上正電荷，隨后糖苷鍵斷裂，左邊的糖基1號(hào)位的C原子帶上正電荷，鄰近的Asp52的羧基本來于解離狀態(tài)，帶負(fù)電荷，起著中和正電荷穩(wěn)定過渡態(tài)的作用。,溶菌酶的最適pH與Glu35和Asp52的解離狀態(tài)有關(guān),金屬催化,近三分之一已知酶的活性需要金屬離子的存在，這些酶分為兩類，一類為金屬酶，另一類為金屬激活酶。前者含有緊密結(jié)合的金屬離子，多數(shù)為過渡金屬，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者與溶液中的金屬離子松散地結(jié)合，通常是堿金屬或堿土金屬，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。 金屬離子參與的催化被稱為金屬催化。金屬離子以5種方式參與催化：（1）作為酸接受電子，使親核基團(tuán)或親核分子親核性更強(qiáng)；（2）與底物結(jié)合，促進(jìn)底物在反應(yīng)中正確定向；（3）作為親電催化劑，穩(wěn)定過渡態(tài)中間物上的電荷；（4）通過價(jià)態(tài)的可逆變化，作為電子受體或電子供體參與氧化還原反應(yīng)；（5）酶結(jié)構(gòu)的一部分。,共價(jià)催化,共價(jià)催化是指酶在催化過程中必須與底物上的某些基團(tuán)暫時(shí)形成不穩(wěn)定的共價(jià)中間物的一種催化方式。許多氨基酸殘基的側(cè)鏈可作為共價(jià)催化劑，例如Lys賴氨酸、His組氨酸、Cys半胱氨酸、Asp天冬氨酸、Glu谷氨酸、Ser絲氨酸或Thr蘇氨酸，此外，一些輔酶或輔基也可以作為共價(jià)催化劑，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸吡哆醛。,幾種酶的共價(jià)催化,Y比X更好的離開基團(tuán)，X是比Z更好進(jìn)攻的基團(tuán)，共價(jià)中間物的反應(yīng)性比底物強(qiáng)。,親核共價(jià)修飾反應(yīng),底物形變,底物形變是指當(dāng)酶與底物相遇時(shí)，酶分子誘導(dǎo)底物分子內(nèi)敏感鍵更加敏感，產(chǎn)生“電子張力”發(fā)生形變，比較接近它的過渡態(tài)。,底物形變,溶菌酶也利用這種方式進(jìn)行催化：與溶菌酶活性中心結(jié)合的6碳糖在溶菌酶的誘導(dǎo)下，從椅式構(gòu)象變成半椅式構(gòu)象而發(fā)生形變，周圍的糖苷鍵更容易發(fā)生斷裂。,幾種常見酶的結(jié)構(gòu)與功能,蛋白酶,蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶的總稱。盡管肽鍵的水解在能量學(xué)上是十分有利的，但如果沒有蛋白酶的催化，一個(gè)肽鍵在中性pH和25條件下大概需要300年600年的時(shí)間才能完成水解。 根據(jù)活性中心催化基團(tuán)的性質(zhì)，蛋白酶可以分為四類：（1）絲氨酸蛋白酶此類蛋白酶的催化基團(tuán)包括1個(gè)不可缺少的Ser殘基，DIFP是它們的不可逆抑制劑；（2）金屬蛋白酶這類蛋白酶在活性中心結(jié)合金屬離子，其活性絕對需要金屬離子，因此金屬離子的螯合劑EDTA或鄰菲羅啉的存在可導(dǎo)致其活性的喪失；（3）天冬氨酸蛋白酶其催化基團(tuán)包括兩個(gè)重要的Asp，在偏堿性的pH下無活性；（4）巰基蛋白酶其催化基團(tuán)包括1個(gè)Cys的巰基，巰基試劑為它們的不可逆抑制劑。,所有蛋白酶在催化過程中都經(jīng)歷四面體的過渡態(tài)，該過渡態(tài)形成的原因是反應(yīng)涉及一個(gè)親核基團(tuán)進(jìn)攻肽鍵的羰基碳。如果是絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，進(jìn)攻的親核基團(tuán)分別是Ser殘基的羥基和Cys殘基的巰基，否則就是水分子。絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的催化機(jī)理中包括共價(jià)催化，脂?；甘敲概c底物的共價(jià)中間物，而金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反應(yīng)更為直接，沒有共價(jià)催化。,絲氨酸蛋白酶,這一類蛋白酶以一個(gè)特定的Ser殘基作為必需的催化基團(tuán)，屬于該家族成員的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、激肽釋放酶原、凝血酶、纖溶酶和組織型纖溶酶原激活劑。 絲氨酸蛋白酶的催化機(jī)制屬于共價(jià)催化和廣義酸堿催化的混合體，由三個(gè)不變的氨基酸殘基構(gòu)成的催化三元體（Ser、His和Asp（天冬氨酸）起主導(dǎo)作用，這三個(gè)氨基酸殘基任何一種突變或修飾（例如，Ser被DIPF修飾）均可導(dǎo)致酶活性的喪失。,雖然各種絲氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但構(gòu)成催化三元體的三個(gè)氨基酸殘基在肽鏈中的位置并不完全相同。然而，酶學(xué)家已達(dá)成共識(shí)，將這三個(gè)氨基酸殘基總是進(jìn)行一樣的編號(hào)，即His57、Asp102和Ser195。它們在催化中的具體功能是：（1）Ser195充當(dāng)進(jìn)攻底物的親核基團(tuán)；（2）His57作為廣義的酸堿催化劑；（3）Asp102 的功能僅僅是定向His57，影響His的 pKa，改變其酸堿性質(zhì)。,胰蛋白酶具有很深的底物結(jié)合口袋，而口袋的底部又是Asp，特別適合長的堿性氨基酸側(cè)鏈（Lys賴和Arg精）的結(jié)合；胰凝乳蛋白酶的底物結(jié)合口袋沒有胰蛋白酶深，但比它寬，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特別適合芳香族氨基酸的結(jié)合；彈性蛋白酶的底物結(jié)合口袋非常淺，最適合結(jié)合側(cè)鏈較小的氨基酸殘基。,糜蛋白酶的催化經(jīng)歷了酯酰化酶共價(jià)中間物，全部反應(yīng)分五步：,1、底物和活性中心的Ser195和Gly（甘）193 殘基通過氫鍵形成ES復(fù)合物，疏水口袋正好能 容納芳香環(huán)。 2、親核的Ser195殘基進(jìn)攻羰基碳，形成第一 個(gè)四面體的過渡態(tài)中間物。 活性中心的三個(gè)氨基酸殘基依次參與此階段 的反應(yīng),糜蛋白酶催化的四 面體中間物的形成,糜蛋白酶催化形成的 四面體中間物的穩(wěn)定,3、四面體中間物因肽氧負(fù)離子與Ser195以及Gly193之間形成氫鍵而穩(wěn)定。 4、肽鍵斷裂，離開基團(tuán)從His57咪唑環(huán)上得到一個(gè)質(zhì)子。原來肽鍵羧基一側(cè)通過氫鍵以及與Ser195形成共價(jià)鍵仍與酶結(jié)合。 5、水進(jìn)入活性中心，質(zhì)子化His57，使之成為酸。釋放出來的OH-親核進(jìn)攻留下來的多肽羰基碳，第二個(gè)四面體形的過渡態(tài)中間物形成。最后Ser195從His57重新獲得質(zhì)子，His仍然與它通過氫鍵相連，過渡態(tài)中間物瓦解，酯酰化酶中間物被水解。,天冬氨酸蛋白酶,活性中心涉及兩個(gè)重要的Asp殘基，他們交替充當(dāng)廣義的酸堿催化劑。多數(shù)天冬氨酸蛋白酶都具有由兩葉（N端和C端各成一葉，每一葉相當(dāng)一個(gè)結(jié)構(gòu)域）組成的三級結(jié)構(gòu)，兩葉呈兩重對稱。屬于這一蛋白酶家族的有胃蛋白酶，腎素、組織蛋白酶等。在中性或偏酸條件下活性最高，與絲氨酸蛋白酶一樣，在功能上要么是消化酶，要么是調(diào)節(jié)酶。其催化機(jī)制為：,1、水和多肽底物進(jìn)入兩重對稱的活性中心。 2、兩個(gè)Asp殘基的羧基具有不同的pKa。pKa高的Asp殘基上羧基作為廣義堿從水分子中抽取一個(gè)質(zhì)子，產(chǎn)生的OH-親核肽鍵上的羰基碳，形成氧負(fù)離子。后者親核進(jìn)攻活性中心pKa低的Asp215殘基上的羧基，奪取質(zhì)子。第二個(gè)Asp殘基充當(dāng)廣義酸，為氧負(fù)離子提供質(zhì)子，形成四面體狀中間物。 3、Asp32和Asp215相互之間酸堿反應(yīng)，質(zhì)子從Asp32傳到Asp215。 4、 Asp32和Asp215的酸堿催化導(dǎo)致四面體中間物拆分，產(chǎn)物釋放，最后Asp32和Asp215再次進(jìn)行質(zhì)子交換，各自回到催化前狀態(tài)。,酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制,酶需要在正確的時(shí)間 和正確的地點(diǎn)有正確活性,不合適的表達(dá)或激活導(dǎo)致細(xì)胞的癌變或死亡！,酶的“量變”和“質(zhì)變”的比較,酶的“量變”,改變酶量的方式有兩種，一種是通過同工酶，另外一種是通過控制酶基因的表達(dá)和酶分子的降解。,同工酶,同工酶是指催化相同的反應(yīng)但性質(zhì)不同（Vmax和/或Km不同）的酶。它們可能以不同的量出現(xiàn)在一種動(dòng)物不同的組織或器官，也可能出現(xiàn)在任何真核生物細(xì)胞不同的細(xì)胞器。例如，高等動(dòng)物的乳酸脫氫酶（LDH）有五種形式M4、M3H、M2H2、MH3和M4。M4由四個(gè)M亞基組成，主要存在于骨骼肌，H4由四個(gè)H亞基組成，主要存在于心臟。,乳酸脫氫酶催化的酶促反應(yīng),酶的“質(zhì)變”,別構(gòu)調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾、水解激活、調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合和解離以及單體的聚合和解離。,酶活性的別構(gòu)調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾和水解激活調(diào)節(jié)的異同,別構(gòu)調(diào)節(jié),別構(gòu)調(diào)節(jié)的原理在于一些酶除了活性中心以外，還含有所謂的別構(gòu)中心，該中心能夠結(jié)合一些特殊的配體分子（有時(shí)為底物）。當(dāng)別構(gòu)中心結(jié)合配體以后，酶構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響到活性中心與底物的親和力，并最終導(dǎo)致酶活性發(fā)生變化。能夠進(jìn)行別構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱為別構(gòu)酶，與別構(gòu)中心結(jié)合調(diào)節(jié)酶活性的配體分子稱為別構(gòu)效應(yīng)物。起抑制作用的別構(gòu)效應(yīng)物稱為別構(gòu)抑制劑，起激活作用的別構(gòu)效應(yīng)物稱為別構(gòu)激活劑。由底物作為別構(gòu)效應(yīng)物產(chǎn)生的別構(gòu)效應(yīng)稱為同促效應(yīng)，否則，就稱為異促效應(yīng)。許多別構(gòu)酶具有多個(gè)別構(gòu)中心，能夠與不同的別構(gòu)效應(yīng)物結(jié)合。 具有協(xié)同效應(yīng)的酶和無協(xié)同效應(yīng)的酶都可以受到別構(gòu)調(diào)節(jié)。,酶活性的反饋抑制,別構(gòu)調(diào)節(jié)最多出現(xiàn)在代謝途徑中的反饋抑制，它是指一條代謝途徑（通常是合成代謝途徑）的終產(chǎn)物作為別構(gòu)抑制劑抑制代謝途徑前面限速酶的活性，因此也被稱為終產(chǎn)物抑制。,齊變學(xué)說解釋別構(gòu)效應(yīng)物的作用機(jī)理,當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)物在別構(gòu)中心與酶結(jié)合，誘導(dǎo)酶的構(gòu)想發(fā)生變化，打破R態(tài)酶和T態(tài)酶之間的平衡。如果是激活劑，則更容易與R態(tài)酶結(jié)合，將平衡向左移動(dòng)，使更多的酶轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)，最終產(chǎn)生激活的效果。如果是抑制劑，則更容易與T態(tài)酶結(jié)合，使平衡向右移動(dòng)，使更多的酶變成T態(tài)，產(chǎn)生抑制效果。,酶活性的別構(gòu)調(diào)節(jié),激活物的存在意味著溶液中有更多的酶處于R態(tài)，這樣就省掉了底物去誘發(fā)T態(tài)向R態(tài)轉(zhuǎn)變，所以底物協(xié)同效應(yīng)下降。如果存在大量的激活劑，溶液中幾乎所有