高效液相色譜法原理及其應(yīng)用ppt課件

高效液相色譜法（HPLC）,第一節(jié) 高效液相色譜法基本原理,色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要分支，是一個(gè)具有強(qiáng)大生命力的分離分析技術(shù)。 采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)，最終得到各組分的色譜峰。,（一）高效液相色譜法的特點(diǎn),一、與經(jīng)典液相色譜法比較 現(xiàn)代液相色譜法是在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測(cè)器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。,二、與氣相色譜法比較 1分析對(duì)象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較 低的樣品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、 熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣 品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè) 占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包 括有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難 氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分 子和離子型樣品均可檢測(cè) 用途廣泛，占有機(jī)物的80%,2流動(dòng)相的區(qū)別 GC：流動(dòng)相為惰性氣體，組分與流動(dòng)相無(wú)親合作 用力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作 用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì) 分離起正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余 地廣，改變流動(dòng)相極性和pH值也對(duì)分離起到 調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以 上液體作為流動(dòng)相也可以增大分離選擇性。,3操作條件區(qū)別 GC：加溫操作（對(duì)氣相色譜分離效率最有影響的因素） HPLC：室溫；高壓,三、高效液相色譜法的特點(diǎn),1 分離效能高 2 選擇性高 3 檢測(cè)靈敏度高 4 分析速度快,（二）高效液相色譜法的分類及分離機(jī)制,按固定相的聚集狀態(tài)分類： 液液色譜法、液固色譜法 按分離機(jī)制分類： 分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法及親合色譜法,按流動(dòng)相與固定相極性的相對(duì)強(qiáng)弱分類： 正相色譜法、反相色譜法,一、液固吸附色譜法（LSC） 流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑 分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異 調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間 出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱,二、液液分配色譜法（LLC）,分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異 正相色譜固定相極性 流動(dòng)相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后柱，適用于分離溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)，用于含有不同官能團(tuán)物質(zhì)的分離。,反相色譜固定相極性 流動(dòng)相極性 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱 用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。 通常對(duì)于親水固定液采用 疏水性 流動(dòng)相,三、離子交換色譜法（IEC）,分離機(jī)制：利用組分與固定相表面離子的交換能力的差別（與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)） 離子交換色譜與紫外可見(jiàn)檢測(cè)器適用于檢測(cè)可離解化合物 離子交換色譜與電導(dǎo)檢測(cè)器結(jié)合適用于檢測(cè)無(wú)機(jī)離子離子色譜法（IC）,四、空間排斥色譜法（SEC）,分離機(jī)制：利用組分的分子尺寸與凝膠固定相孔徑間的滲透系數(shù)的差別 按流動(dòng)相的性質(zhì)不同： 流動(dòng)相為有機(jī)溶劑凝膠滲透色譜 流動(dòng)相為水溶液凝膠過(guò)濾色譜 主要用于分離生物大分子組分,五、親合色譜法（AC）,分離機(jī)制：利用組分與固定相表面上配基的專屬性親和作用的差別 固定相具有生物活性的配基鍵合到載體表面上形成 適用于生物樣品中酶、抗體、受體等的分離,六、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）,分離機(jī)制：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，使組分在吸附分配的過(guò)程中分離 應(yīng)用較廣泛的色譜法：反相鍵合相色譜 固定相：極性小的烷基鍵合相 C8柱，C18柱（ODS柱） 流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水 流動(dòng)相極性 固定相極性,按分離過(guò)程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較,（四）高效液相色譜法的定性定量分析方法,與氣相色譜法的分析方法基本相同 定性分析方法： 色譜鑒定法 化學(xué)鑒定法 兩譜聯(lián)用鑒定法 定量分析方法： 外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法 面積歸一化法（要求每一個(gè)組分都出峰）,第二節(jié) 高效液相色譜儀,1貯液瓶（濾芯，可濾 去顆粒狀物質(zhì)） 2高壓泵（輸液泵、梯 洗脫度） 3進(jìn)樣裝置 4色譜柱分離 5檢測(cè)器分析 6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置,（一）輸液系統(tǒng) 一、儲(chǔ)液裝置：過(guò)濾器 二、脫氣裝置：脫氣機(jī) 流動(dòng)相脫氣： （1）吹氦脫氣法 （2）加熱回流法 （3）抽真空脫氣法 （4）超聲波脫氣法 （5）在線真空脫氣法,流動(dòng)相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個(gè)非常重要的實(shí)驗(yàn)因素。改變流動(dòng)相的性質(zhì)和組成將改變?nèi)苜|(zhì)組分的保留值、分離選擇性和柱效。在實(shí)際工作中，流動(dòng)相的可選擇范圍較大是液相色譜的一個(gè)顯著特點(diǎn)。,液相色譜中, 組分的保留值大小決定于組分與流動(dòng)相和固定相分子間作用力：比如吸附、分配、離子交換、親和力等。,（二）高壓輸液泵及梯度洗脫裝置,一、高壓輸液泵的種類 高壓輸液泵可以分為以下兩類： 1恒流泵：可輸出恒定體積流量的流動(dòng)相。 （1）注射式泵（又稱螺桿注射泵） （2）往復(fù)型泵 （又稱往復(fù)柱塞泵）,往復(fù)柱塞泵，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，保證將流動(dòng)相以穩(wěn)定的速度流過(guò)色譜柱的部件。,二、高壓輸液泵的原理,2恒壓泵：恒壓泵又稱氣動(dòng)放大泵，是輸出恒定壓力的泵。,避免使用對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑。 例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物， 四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混 合物等。,過(guò)濾用濾膜過(guò)濾或垂熔漏斗過(guò)濾,脫氣采用超聲或過(guò)濾的方法,注意,流動(dòng)相 使用前,沖洗,使用含酸、堿、緩沖液的流動(dòng)相后， 必須用不含鹽的有機(jī)溶劑-水沖洗！,二、高壓輸液泵的基本要求： 1. 流量范圍寬 2. 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好 3. 輸出的流動(dòng)相無(wú)脈沖影響 4. 輸出壓力高且耐壓 5. 密封性能好 6. 具備壓力檢測(cè)和保護(hù)功能,三、高壓輸液泵的性能參數(shù),用于分析型輸液泵的流量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.075%0.3% 流量范圍是0.01010ml/min 流動(dòng)相流速是13ml/min 最高工作壓力可達(dá)34.4741.36MPa(300500bar,50006000psi),四、梯度洗脫裝置,梯度洗脫：又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，梯度性地改變洗脫液的組成。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。,梯度洗脫的原理： 流動(dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成，通過(guò)改變流動(dòng)相中各溶劑組成的比例改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離。,梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)： 1.縮短分析周期； 2.提高分離能力； 3.峰型得到改善，減少拖尾； 4.增加靈敏度。但有時(shí)引起基線漂移。,（三）進(jìn)樣裝置,一、手動(dòng)注射進(jìn)樣器 二、六通閥進(jìn)樣裝置 三、自動(dòng)進(jìn)樣器,進(jìn)樣閥的基本要求： 1. 耐高壓 2. 進(jìn)樣量準(zhǔn)確 3. 進(jìn)樣重復(fù)性好 4. 無(wú)流量和壓力波動(dòng)影響,進(jìn)樣閥的保護(hù)措施： 1. 在泵和進(jìn)樣閥之間安裝在線過(guò)濾器，防止機(jī)械雜質(zhì)進(jìn)入進(jìn)樣閥。 2. 以緩沖液作流動(dòng)相時(shí)，定期用水清洗進(jìn)樣閥，尤其是在色譜儀關(guān)機(jī)前。,自動(dòng)進(jìn)樣器的組成部分： 1. 進(jìn)樣閥 2. 樣品環(huán)管 3. 進(jìn)樣針頭 4. 樣品瓶 5. 支架,（四） 色譜柱,色譜柱是液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離的核心部分，試樣中各組分在色譜柱中被分離。,色譜柱的要求： 柱效高：通過(guò)減小填料粒度來(lái)提高柱效 選擇性好：可通過(guò)改變固定相的種類和流動(dòng)相的種類來(lái)改變色譜柱的選擇性。 分析速度快,一、柱材料及規(guī)格 1柱材料：色譜柱由柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成。 HPLC柱的填料材料有硅膠、以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁和有機(jī)聚合物微球等。,2柱規(guī)格：粒度通常為3m、5m、7m、10m，柱長(zhǎng)1030cm，內(nèi)徑26mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。 目前以反相鍵合相色譜柱應(yīng)用最多，尤其是C18、C8柱,二、色譜柱的性能評(píng)價(jià) 1. 理論塔板數(shù) 2. 不對(duì)稱因子 3. 保留值的重現(xiàn)性,三、色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng) 1. 加流路過(guò)濾器和保護(hù)預(yù)柱 2. 避免高壓沖擊 3. 采用適合柱的分離條件：PH、柱溫和流動(dòng)相 4. 過(guò)濾流動(dòng)相和樣品 5. 用強(qiáng)溶劑定期沖洗柱,1.色譜柱的保養(yǎng),色譜柱使用與保存： 所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱 色譜柱 柱體積 沖洗體積 150 4.6mm 2.5ml 50ml 200 4.6mm 3.3ml 65ml 250 4.6mm 4.2ml 80ml,（1）反相譜柱用后的保存：使用緩沖液或含鹽溶液作為流動(dòng)相，每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)用20倍柱體積的甲醇/乙腈水溶液（5%）沖洗，使色譜柱內(nèi)的鹽完全溶解洗脫出，再用高濃度的甲醇/乙腈水溶液（80%100 % ）沖洗，使色譜柱中的強(qiáng)吸附物質(zhì)沖洗出來(lái)。,（2）反相色譜柱長(zhǎng)期保存： 反相柱可以儲(chǔ)存于甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chǔ)存于經(jīng)脫水處理的正己烷中，離子交換柱可以貯存于5%甲醇水的溶液中，并將色譜柱兩端的堵頭擰緊，以免干枯，室溫保存。,3.色譜柱的維修,（1）如果柱壓實(shí)然增大，可將色譜柱出、入口端顛倒過(guò)來(lái)，用1020倍柱體積的流動(dòng)相沖洗。 （2）如果峰形變壞，表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型號(hào)填料和乙醇配成勻漿，將塌陷處填平，壓緊。,2.色譜柱的再生,（1）反相色譜柱的再生步驟：甲醇二氯甲烷正己烷二氯甲烷甲醇 （2）正相色譜柱的再生步驟：無(wú)苯正己烷二氯甲烷異丙醇二氯甲烷無(wú)苯正己烷,（3）離子交換柱的再生步驟：用稀酸緩沖液沖洗可使陽(yáng)離子交換柱再生，用稀堿緩沖液沖洗可使陰離子柱再生。,（五） 檢測(cè)器,一、定義 檢測(cè)器是將色譜洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變成電信號(hào)的傳感器，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄，根據(jù)所得色譜圖上峰的位置、形狀和大小，進(jìn)行定性、定量分析。,二、分類 通用型：示差折光檢測(cè)器（DRID）、安培檢測(cè)器（AD）、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD） 專屬型：紫外檢測(cè)器（UVD）、可變紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器（DAD）、熒光檢測(cè)器（FD）,三、檢測(cè)器的性能指標(biāo) （1）噪聲 （2）基線漂移 （3）靈敏度 （4）線性范圍 （5）重復(fù)性,四、紫外檢測(cè)器 1固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器 2可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器 3光二極管陣列檢測(cè)器 只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，工作原理基于Lambert-Beer定律。,五、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器 是目前配置最多的檢測(cè)器，可根據(jù)組分的最大吸收波長(zhǎng)來(lái)設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。,高效液相色譜儀的使用及維護(hù) 使用HPLC級(jí)試劑和流動(dòng)相 清潔的儀器、流動(dòng)相和樣品，如果必要，進(jìn)行過(guò)濾 保證溶劑的相溶性 如果必要，沖洗整個(gè)系統(tǒng)，去掉鹽，防止污染 在規(guī)定的pH范圍內(nèi)選用流動(dòng)相 對(duì)儀器的使用、維護(hù)和保養(yǎng)進(jìn)行記錄,建立高效液相色譜分析方法的一般步驟,通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問(wèn)題： 根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。 選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長(zhǎng)）和所選用固定相（粒徑及孔徑）。,選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動(dòng)相的組成、流速及洗脫方式。 由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。,第三節(jié) 高效液相色譜法應(yīng)用示例,鹽酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:15mg）含量測(cè)定 測(cè)定方法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0g和高氯酸鈉7.0g，加水1300ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)PH值至2.2）乙腈（85:15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為294nm。,稱取左氧氟沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品和雜質(zhì)E對(duì)照品各適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各6g的混合溶液，取10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，左氧氟沙星峰的保留時(shí)間約為15分鐘。左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰和左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度應(yīng)分別大于2.0與2.5。,供試品溶液的制備與測(cè)定 精密量取本品1.0ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱左氧氟沙星對(duì)照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算出供試品中C18H20FN3O4的含量，即得。本品含鹽酸左氧氟沙星以左氧氟沙星（C18H20FN3O4）計(jì)，應(yīng)為標(biāo)示量的92.0%108.0%。,（1）配制系統(tǒng)適用性溶液，通過(guò)圖譜得到相應(yīng)峰之間的分離度。 左氧氟沙星峰的保留時(shí)間 左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰的分離度 左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度,（2）配制供試品溶液，進(jìn)樣，通過(guò)圖譜