常用培養(yǎng)基制備滅菌與消毒.ppt

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂1520g，水1000mL，PH7.07.2(后調(diào)),高氏1號培養(yǎng)基,高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂1520g，水1000mL，pH7.47.6。,查氏合成培養(yǎng)基,查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的培養(yǎng)基,其配方如下： NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然,麥芽汁培養(yǎng)基,用來培養(yǎng)酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止,調(diào)整糖液濃度,煮沸后，過濾，調(diào)pH為6.0。,消毒與滅菌 消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體 滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。 方法： 物理的方法：加熱、過濾、輻射 化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。,加熱法： 干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌 1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160170C）加熱滅菌12h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事項： 1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法； 2）溫度控制在180； 3）物品不能太擠； 4）溫度降至70時才開箱門。,濕熱法 ： 原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。 高壓蒸汽滅菌法： 1、設(shè)備：高壓滅菌鍋 2、時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。 3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。 4、注意事項： 1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時方可打開。,在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見表2,常壓蒸汽滅菌： 對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。 煮沸滅菌法： 適用注射器和解剖器皿，時間1015min， 超高溫殺菌 135-150C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品滅菌。 優(yōu)點 ：保持食品價值和營養(yǎng)成分。,過濾除菌： 原理：介質(zhì)在有壓力時阻隔微生物。 適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。 優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。 注意事項：1、壓力適當(dāng)； 2、無菌條件下進(jìn)行； 3、防止?jié)B透現(xiàn)象。,輻射滅菌： 原理：紫外線波長在200300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細(xì)胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。 缺點：穿透力不大。距照射物1.2m為宜。 應(yīng)用：無菌室，醫(yī)院。 注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。,化學(xué)藥品滅菌： 原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機能。 殺菌劑如重金屬離子； 抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。 注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微 生物所處的環(huán)境有關(guān)。 常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸 福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等,分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種 或某一株微生物的過程。 為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保 證是一種菌。 常用的分離、純化方法： 單細(xì)胞挑取法、稀釋涂布平板法 稀釋混合平板法、平板劃線法,實驗四 微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù),稀釋涂布平板法 ： 步驟： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。 2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。 3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。 4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37培養(yǎng)1-2days。 5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。,平板劃線法： 1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。 2、劃線方法 稀釋混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度 3、混合均勻,微生物培養(yǎng)技術(shù) 1、斜面接種 2、液體培養(yǎng)基接種 3、穿刺接種 將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4冰箱中 保存。,觀察菌落形態(tài)并記錄,序號 來源 大小 形狀 邊緣 顏色 表面 代謝物 種類,實驗五：放線菌及霉菌形態(tài)觀察,目的要求 1.了解放線菌、霉菌的形態(tài)觀察的原理。 2.學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法。 3.初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。,原理,放線菌是一群絲狀，G+的細(xì)菌，在氣生菌絲末端形成孢子。 細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，最適pH與細(xì)菌相似。主要以孢子方式進(jìn)行無性繁殖。 其DNA 堿基組成中GC含量特別高。超過任何已知的細(xì)菌。 許多臨床應(yīng)用的抗生素都由鏈霉菌種產(chǎn)生。,放線菌(Actinomycetes),分生孢子絲,瓊脂表面,基內(nèi)菌絲,氣生菌絲,The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium （基內(nèi)菌絲）and aerial mycelium（氣生菌絲） with chains of conidiospores（分生孢子）,分生孢子絲,瓊脂表面,基內(nèi)菌絲,氣生菌絲,The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基內(nèi)菌絲） and aerial mycelium （氣生菌絲）with chains of conidiospores（分生孢子）,放線菌生長到一定階段，大部分氣生菌絲分化成孢子絲，通過橫割分列的方式產(chǎn)生成串的分生孢子。孢子絲形態(tài)多樣，有直、彎曲、鉤狀、螺旋狀、輪生等多種形態(tài)。孢子也有球形、橢圓形、桿狀和瓜子狀等等。它們的形態(tài)構(gòu)造都是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。 放線菌的菌落早期絨狀同細(xì)菌菌落月牙狀相似，后期形成孢子菌落呈粉狀、干燥，有各種顏色呈同心圓放射狀。,鏈霉菌的各種 孢子絲結(jié)構(gòu),鏈霉菌的分離 ： pH中性偏堿 喜干（含水少） 采用含各種無機鹽的選擇性培養(yǎng)基,已知放線菌能夠產(chǎn)生500多種抗生素。 大多數(shù)抗生素對不同的細(xì)菌有獨特的療效 有50多種被實際應(yīng)用,放線菌Actinomycetes,霉菌 ( molds),是絲狀真菌的總稱,即“發(fā)霉的真菌”。通常指菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實體的真菌。常在潮濕的氣候下大量生長繁殖。,形態(tài)特征（ Morphological characteristics ）,屬異養(yǎng)型真核生物，具有絲狀或管狀結(jié)構(gòu)，單個分支稱為菌絲。菌絲形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)稱為菌絲體。 營養(yǎng)菌絲（vegetative mycelium）：汲取營養(yǎng) 氣生菌絲（aerial mycelium） 繁殖菌絲:孢子絲，進(jìn)行繁殖。,分類（classification）,有隔菌絲：有隔菌絲中有橫隔膜將菌絲分隔成多個細(xì)胞，在菌絲生長過程中細(xì)胞核的分裂伴隨著細(xì)胞的分裂，每個細(xì)胞含有一至多個細(xì)胞核。橫隔膜可以使相鄰細(xì)胞之間的物質(zhì)相互溝通。如曲霉和青霉。 無隔菌絲：菌絲中無橫膈膜，整個細(xì)胞是一個單細(xì)胞，菌絲內(nèi)有許多核，在生長過程中只有核的分裂和原生質(zhì)體質(zhì)量的增加，沒有細(xì)胞數(shù)目的增多。如毛霉和根霉。,nonseptate,(2)septate,繁殖方式,無性繁殖： 芽生孢子 節(jié)孢子 孢囊孢子 后垣孢子 分生孢子 有性繁殖： 卵孢子 接合孢子 子囊孢子,Sporangiospores,孢囊孢子（Sporangiospores are formed within a sporangium ）,節(jié)孢子Arthrospores,分生孢子Conidiospores,卵孢子（Oospores）,antheridium,oospheres,oospores,oogonium,Oospores formation,接合孢子 Zygospores,接合孢子 形成過程,子囊孢子 Ascospores,幾種常見霉菌,根霉,根霉的形態(tài)結(jié)構(gòu),曲霉,曲霉的形態(tài)結(jié)構(gòu) 左側(cè)分生孢子梗具有一層小梗；右側(cè)分生孢子梗具 有二層小梗,青霉,青霉的形態(tài)結(jié)構(gòu) A單輪型 B非對稱型 C對稱二輪型,實驗內(nèi)容,人們設(shè)計了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌和霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。本實驗采用插片法。,插片法: 倒平板插片接種培養(yǎng)鏡檢記錄繪圖 壓印法: 倒平板劃線接種挑取菌落加蓋玻片鏡檢記錄繪圖 埋片法: 倒瓊脂切槽接種培養(yǎng)鏡檢記錄繪圖,倒平板 將培養(yǎng)基熔化后，倒10-12毫升左右于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后使用. 插片 將滅菌的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基中，插入深約為1/2或1/3。 接種與培養(yǎng) 用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片與瓊脂相接的沿線，放置28培養(yǎng)37天。 觀察 培養(yǎng)后菌絲體生長在培養(yǎng)基及蓋玻片上，小心用鑷子將蓋玻片抽出，輕輕擦去生長較差的一面的菌絲體，將生長良好的菌絲體面向的載玻片，壓放于載玻片上。直接在顯微鏡下觀察。,關(guān)鍵步驟及注意事項,倒平板要厚一些，接種時劃線要密。 插片時要有一定角度并與劃線垂直。 觀察時，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，更換高倍鏡觀察。 如果用0.1%美藍(lán)對培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察，效果會更好。,思考題,鏡檢時，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲? 你認(rèn)為霉菌和放線菌菌絲的主要區(qū)別是什么？,實驗六、菌種保藏,幾種常用的保藏方法： 1、傳代培養(yǎng)法 保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。 可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長保存期。 2、載體法 使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。,3、懸液法 將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。 4、冷凍法 使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。 此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。 5、真空干燥法 這類方法包括冷凍真空干燥法和L干燥法。 冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。 L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。,操作方法 1、斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。