流式細(xì)胞分析.ppt

1,流式細(xì)胞術(shù)及臨床應(yīng)用,吳林軍 樂山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,2,01,流式細(xì)胞術(shù)的原理,流式細(xì)胞術(shù)是以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下經(jīng)熒光標(biāo)記的單細(xì)胞（生物顆粒），通過檢測(cè)產(chǎn)生的散射光和熒光素發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性或者定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的細(xì)胞分析或分選的技術(shù)。,樣本傳輸與聚焦,信號(hào)產(chǎn)生與收集,信號(hào)檢測(cè)與存貯,整體架構(gòu)的支持和布局,3,fcm 的結(jié)構(gòu)一般分為5 部分： 流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)； 激光光源及光束成形系統(tǒng)； 光學(xué)系統(tǒng)； 信號(hào)檢測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)； 細(xì)胞分選系統(tǒng),4,流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過激光束。 鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng)，操作人員無(wú)法隨意改變其流動(dòng)的速度，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，并且保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。如下圖。 因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。流動(dòng)室是液流系統(tǒng)的核心部件。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。,5,flow cell,injector tip,fluorescence,signals,focused laser,beam,sheath fluid,6,7,。 高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。 低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如dna分析,8,激光光源與光束成形系統(tǒng),目前臺(tái)式機(jī)fcm，大多采用氬離子氣體激光器。激光（light amplification by stimulated emission of radiation , laser）是一種相干光源，它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源，這是因?yàn)橛捎诩?xì)胞快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1 微秒左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。,9,光學(xué)系統(tǒng),fcm 的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器 在fcm 的光學(xué)系統(tǒng)中主要光學(xué)原件是濾光片（filter），主要分成3 類：長(zhǎng)通濾片（long-pass filter, lp）、短通濾片（short-pass filtr, sp）及帶通濾片（band-pass filter, bp）。,10,pmt,pmt,pmt,pmt,dichroic,filters,bandpass,filters,example channel layout for laser-based flow cytometry,laser,1,2,3,4,flow cell,11,信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng),當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時(shí)，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360 度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。,12,（1）散射光信號(hào)：散射光分為前向角散射（forward scatter,fsc）和側(cè)向角散射（sidescatter,ssc），散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù) 前向角散射：前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小關(guān)，確切說與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在fcm 應(yīng)用中，選取fsc 作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。 側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交90o 方向的散射光信號(hào)，側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。 以上兩種信號(hào)都是來自激光的原光束，其波長(zhǎng)與激光的波長(zhǎng)相同，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞群體，或在未進(jìn)行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。,13,forward angle light scatter 前向角,14,90 degree light scatter 90度側(cè)向角,15,（2）熒光信號(hào)：當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析，就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量,16,流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的信號(hào),非熒光信號(hào),顆粒度,細(xì)胞大小,17,上述兩種信號(hào)都是來自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細(xì)胞亞群，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖3-2）為fsc和ssc組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開。,18,19,fcm 測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示和分析,目前fcm 數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(duì)（list mode）方式。因?yàn)槟壳癴cm 所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光參數(shù)標(biāo)記物如是4 個(gè)，采用list mode 方式可大量地節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被測(cè)4 個(gè)參數(shù)，那么獲取10000 個(gè)細(xì)胞，所占容量為410000 個(gè)（字或雙字）。同時(shí)當(dāng)只檢測(cè)1 個(gè)參數(shù)時(shí)（如dna），可靈活的關(guān)閉其它3 個(gè)參數(shù)，節(jié)省3/4 的空間。數(shù)據(jù)文件雖然有易于加工處理分析的優(yōu)點(diǎn)，但缺乏直觀性。數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點(diǎn)圖、等高線圖、密度圖等幾種。,20,fl5 (pe-cy7),fl3 (percp),fl2 (pe),fl1 (fitc),ss,488/10,530/30,fs,488/10,585/40,670lp,785/60,491/lp,550lp,645lp,660/20,785/60,740lp,488/10,反光鏡,fl6 (apc-cy7),fl4 (apc),反光鏡,fl1,fl2,01,流式細(xì)胞儀工作原理模擬圖,21,流式細(xì)胞儀臨床應(yīng)用,22,01,流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)范圍及特點(diǎn),流式細(xì)胞術(shù)在流動(dòng)狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性,檢測(cè)范圍 樣本種類：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，灌洗液，實(shí)體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞）微生物，人工合成微球等; 可檢測(cè)免疫復(fù)合物、dna、rna、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、ca2+等,特點(diǎn) 特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快；并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；,紫色采血管,血液樣本要求： 抗凝（edta)全血2-3ml 樣本常溫保存不超過24小時(shí) 進(jìn)行免疫球蛋白或白蛋白治療患者，三天內(nèi)不送檢,23,02,流式項(xiàng)目淋巴細(xì)胞亞群,24,免疫系統(tǒng),02,感染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、妊娠失敗、移植排斥、惡性腫瘤、衰老與亞健康等都有免疫平衡的異常變化,25,淋巴細(xì)胞亞群與免疫功能,02,t4細(xì)胞（cd3+cd4+） 誘導(dǎo)/輔助性t細(xì)胞,t8細(xì)胞（cd3+cd8+） 抑制/細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞,b細(xì)胞（cd3-cd19+) 分泌抗體,nk細(xì)胞（cd3-cd16+cd56+）,t細(xì)胞（cd3+） 細(xì)胞免疫主力軍,特異性免疫,體液免疫主力軍,非特異性免疫,淋巴細(xì)胞亞群（t/b/nk）：淋巴細(xì)胞及其亞群的消長(zhǎng)最能反映機(jī)體在不同條件下免疫功能的變化。 主要用于與免疫系統(tǒng)明顯相關(guān)疾病的輔助診斷、判斷病情、評(píng)估預(yù)后、指導(dǎo)治療及療效監(jiān)測(cè),免疫力指標(biāo)分析：,26,淋巴細(xì)胞亞群分析方法比較,02,淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法包括： 顯微鏡法、酶聯(lián)免疫法和流式細(xì)胞術(shù)法 流式細(xì)胞術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)本用量少，特異性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的標(biāo)準(zhǔn)方法。,淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)規(guī)范,27,淋巴細(xì)胞亞群分析腫瘤疾病,02,腫瘤發(fā)生、發(fā)展與免疫： 惡性腫瘤患者常存在免疫抑制現(xiàn)象。受損的免疫系統(tǒng)不能有效識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。 淋巴細(xì)胞亞群的分類和計(jì)數(shù)，能夠真實(shí)反映腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)，在腫瘤的鑒別診斷、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中發(fā)揮著重要作用。,1 診斷與鑒別診斷 對(duì)淋巴細(xì)胞惡性增殖性疾病進(jìn)行初步篩查，如，淋巴瘤，淋巴瘤白血病等。 通過淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)有助于良性與惡性腫瘤的鑒別。 肺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌患者常表現(xiàn)為cd3細(xì)胞、cd4細(xì)胞及cd4/cd8比值降低，cd8細(xì)胞升高。 肺良性疾病、卵巢良性腫瘤和子宮肌瘤患者與健康對(duì)照者的細(xì)胞亞群和cd4/cd8比值無(wú)明顯明顯。,28,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,2 臨床分期 不同發(fā)展階段的腫瘤患者，免疫功能狀態(tài)也存在很大差異。 隨病程進(jìn)展，cd3、cd4、cd4/cd8逐漸降低，cd8逐漸增高。 期：cd4、cd8未見明顯抑制，cd4/cd8比值基本正常； 期：cd4減少明顯，cd8增高，cd4/cd8比值下降； -期：cd4顯著減少，cd8明顯降低，cd4/cd8下降或倒置。,29,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,3 療效觀察 監(jiān)測(cè)治療前后患者免疫功能恢復(fù)的動(dòng)態(tài)過程，有助于醫(yī)生確認(rèn)治療方案是否有效。,現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)2010年09月第18卷第09期,4 判斷預(yù)后 惡性腫瘤病人的免疫功能多異常，手術(shù)、放療、化療等往往造成患者免疫功能進(jìn)一步低下；導(dǎo)致患者發(fā)生感染、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者二次腫瘤的危險(xiǎn)增高。 臨床隨訪中動(dòng)態(tài)檢測(cè)免疫功能有助于判斷病情的發(fā)展?fàn)顟B(tài) 免疫狀態(tài)的恢復(fù)者，常預(yù)后較好，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移幾率小 免疫狀態(tài)惡化則預(yù)示較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后差,化療期間若聯(lián)合使用免疫增強(qiáng)劑（如干擾素、左旋咪唑等），流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群可見患者細(xì)胞免疫功能提高，化療副作用減輕，患者生存質(zhì)量提高。,30,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,案例：對(duì)39例術(shù)后化療的期胃腺癌患者，利用流式細(xì)胞術(shù)，分別對(duì)術(shù)前第1天，術(shù)后1、3和6個(gè)月的靜脈血液循環(huán)中淋巴細(xì)胞亞群（cd3/cd4/cd8/cd19/cd16+56/cd25）進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示，在整個(gè)觀察期，復(fù)發(fā)組患者外周血的cd3+和cd4+t細(xì)胞和cd4+/cd8+比值始終低于未復(fù)發(fā)組 提示與cd3+和cd4+ t細(xì)胞減少相關(guān)的免疫抑制是iii期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,31,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,案例：隨訪研究提示循環(huán)系統(tǒng)中cd19+淋巴細(xì)胞比例高的胃癌患者較cd19+淋巴細(xì)胞比例低的患者預(yù)后良好,32,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,5 指導(dǎo)腫瘤免疫治療 免疫因子制劑(il-2,干擾素)、胸腺肽、活化的淋巴細(xì)胞(cik,lak),腫瘤疫苗等是目前臨床常用提高腫瘤患者免疫功能的方法,淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)在整個(gè)細(xì)胞治療過程中的質(zhì)量控制和療效評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)起到至關(guān)重要的作用,33,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫功能腫瘤疾病,02,【臨床案例】 乳腺癌患者，女，52歲，經(jīng)左乳切除和化療治療。停藥一年后，腫瘤轉(zhuǎn)移至肺。 t淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：cd4、cd3、cd4/cd8在化療期間和停藥各階段均明顯降低，而cd8則在停藥后06月、612月升高，提示該患者細(xì)胞免疫功能低下，免疫功能明顯受抑制。,治療（化、放療等）前后精確檢測(cè)t淋巴細(xì)胞亞群，準(zhǔn)確判斷患者免疫功能 由粗放化向精細(xì)化轉(zhuǎn)變,改善治療： 化療中，同步給予免疫增強(qiáng)劑（如干擾素、左旋咪唑等）后， cd8下降，cd4、cd4/cd8升高，機(jī)體自身抗腫瘤免疫效得到有力發(fā)揮，患者恢復(fù)良好,34,淋巴細(xì)胞亞群分析風(fēng)濕免疫病,02,疾病機(jī)理 風(fēng)濕免疫病多由于自身免疫耐受的破壞，機(jī)體產(chǎn)生自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞和自身抗體，免疫功能的紊亂，常表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞亞群不同程度地升高或降低 比如： ra活動(dòng)期常表現(xiàn)為cd4+細(xì)胞、cd4/cd8比值 ，cd8+細(xì)胞 sle活動(dòng)期常表現(xiàn)為cd4+細(xì)胞、cd4/cd8比值 ，cd8+細(xì)胞 非活動(dòng)期，淋巴細(xì)胞亞群與正常人無(wú)明顯差異，故可根據(jù)cd4+、cd8+、cd4/cd8情況判斷活性期與非活性期,（clin rheumatol. 2000, 19:270274）,35,淋巴細(xì)胞亞群分析風(fēng)濕免疫病,02,免疫指標(biāo)療效監(jiān)測(cè) tbnk檢測(cè)是療效觀察的重要依據(jù)，治療有效時(shí)常表現(xiàn)為cd4、cd8、cd4/cd8比值恢復(fù)正常 舉例：sle治療前，cd4/cd8降低；聯(lián)合使用激素和甲氨蝶呤治療后，比值恢復(fù)正常，,（clin rheumatol. 2000, 19:270274）,36,淋巴細(xì)胞亞群分析風(fēng)濕免疫病,02,風(fēng)濕免疫病生物治療的療效預(yù)測(cè)監(jiān)測(cè) 美羅華（利妥昔單抗） 首個(gè)以b細(xì)胞為靶標(biāo)治療ra的藥物。還用于sle和多發(fā)性硬化癥（ms）等自身免疫性疾病。 是全球第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療非霍奇金淋巴瘤（nhl）的單克隆抗體，用于復(fù)發(fā)或化療抵抗性b淋巴細(xì)胞型nhl。 作用機(jī)理自身免疫病的發(fā)病與b細(xì)胞相關(guān)，美羅華可選擇性地殺滅b細(xì)胞 美羅華治療后，b 淋巴細(xì)胞的下降得越早、清除得越徹底（0.1個(gè)/l），治療效果越好,（ arthritis rheum. 2013, 65:2783-90 ）,37,淋巴細(xì)胞亞群分析風(fēng)濕免疫病,02,免疫指標(biāo)美羅華治療不良反應(yīng)的監(jiān)測(cè) 美羅華的副作用消除 b 淋巴細(xì)胞的同時(shí)，部分患者的 t 淋巴細(xì)胞也會(huì)下降。cd4+低于500個(gè)/l，可能導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生。 tbnk檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)美羅華治療過程中cd4+t細(xì)胞的水平。若出現(xiàn)cd4+細(xì)胞低于500個(gè)/l，需要醫(yī)生考慮預(yù)防性使用抗生素或改變治療方案,（ arthritis rheum. 2013, 65:2783-90 ）,38,淋巴細(xì)胞亞群分析風(fēng)濕免疫病,02,淋巴細(xì)胞亞群在風(fēng)濕免疫病治療中不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中的作用,一些細(xì)胞毒藥物（具有較強(qiáng)骨髓抑制作用），激素等，也可用于風(fēng)濕免疫病的治療。均對(duì)免疫功能有較大影響，因此應(yīng)定期通過tbnk監(jiān)測(cè)病人的免疫狀態(tài)。若免疫細(xì)胞數(shù)量低于正常值，臨床應(yīng)考慮預(yù)防性使用骨髓刺激藥物和抗生素。 臨床上可以通過白細(xì)胞計(jì)數(shù)、tbnk檢測(cè)等監(jiān)測(cè)免疫功能的變化。但由于化療藥物主要抑制的是各種淋巴細(xì)胞，因此以淋巴細(xì)胞亞群作為監(jiān)測(cè)項(xiàng)目更有意義。,常用治療藥物 甾體抗炎藥：如布洛芬 細(xì)胞毒藥物：如環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、環(huán)孢素a 糖皮質(zhì)激素：如潑尼松 生物制劑：如美羅華（利妥昔單抗）,39,老年人群的免疫功能評(píng)估,02,老年人群中普遍存在免疫老化現(xiàn)象：隨年齡增長(zhǎng)，機(jī)體各器官功能下降，免疫系統(tǒng)功能發(fā)生退行性改變，機(jī)體對(duì)感染性疾病易感性升高。 免疫老化所致的免疫紊亂，是導(dǎo)致心腦血管疾病、腫瘤、感染等老年性疾病的重要因素。,40,老年病人手術(shù)圍手術(shù)期免疫監(jiān)測(cè)術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，預(yù)防術(shù)后感染,02,心臟手術(shù) 示例：心臟手術(shù)后，年齡越大的老年患者（如75歲）總淋巴細(xì)胞數(shù)、cd3細(xì)胞數(shù)和b細(xì)胞數(shù)更低（與60歲的老年患者比較），該結(jié)果提示高齡老年患者術(shù)后免疫功能低下，具高度感染的風(fēng)險(xiǎn),骨關(guān)節(jié)手術(shù) 老年人骨質(zhì)疏松，易發(fā)生骨折。如進(jìn)行關(guān)節(jié)成形術(shù)的老年患者，當(dāng)免疫功能低下，易誘發(fā)感染。 如術(shù)后發(fā)生肺炎常表現(xiàn)：cd4、cd8和b細(xì)胞百分比減少發(fā)生泌尿系統(tǒng)感染：cd4細(xì)胞、cd8細(xì)胞減少。因此淋巴細(xì)胞亞群百分比降低是術(shù)后感染的一個(gè)重要危險(xiǎn)指標(biāo)。 不同年齡患者，其b細(xì)胞、cd4細(xì)胞百分比也呈現(xiàn)不同水平，特別是cd4細(xì)胞百分比隨著年齡增大逐漸降低。,（ rev ortop traumatol (madr.). 2007, 51:309-13）,（ journal of laboratory and clinical medicine. 1997, 129:592-602）,特點(diǎn)：手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉、圍手術(shù)期輸血均可產(chǎn)生免疫抑制；,【術(shù)前】可預(yù)測(cè)患者手術(shù)預(yù)后情況，特別是老年患者（提高老年患者免疫水平，可增加手術(shù)安全性）。 【術(shù)后】及時(shí)掌握手術(shù)后恢復(fù)進(jìn)程，減少患者手術(shù)并發(fā)癥、術(shù)后感染發(fā)生率及死亡率（老年患者，術(shù)后3d內(nèi)是并發(fā)感染的危險(xiǎn)期）。,41,淋巴細(xì)胞亞群分析健康體檢,02,免疫與健康 免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡是人體抵抗病原微生物的侵襲，保持健康的前提。 不良的生活習(xí)慣、長(zhǎng)期處于競(jìng)爭(zhēng)激烈、超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)的強(qiáng)壓緊張狀態(tài)中，均容易引起機(jī)體免疫功能紊亂，形成亞健康狀態(tài)。 免疫功能紊亂會(huì)導(dǎo)致身體抵抗力差，體質(zhì)變的敏感，不僅容易被細(xì)菌或病毒感染，還容易發(fā)生過敏反應(yīng)，甚至出現(xiàn)自體免疫錯(cuò)亂，產(chǎn)生自身免疫病。 定期進(jìn)行體檢，監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫狀態(tài)，有助于預(yù)防疾病的發(fā)生。,42,淋巴細(xì)胞亞群分析與健康體檢亞健康、慢性疲勞綜合癥,02,慢性疲勞綜合癥患者可見免疫功能紊亂 慢性疲勞綜合癥常表現(xiàn)各種不適的自我感覺，但臨床各項(xiàng)檢查和化驗(yàn)結(jié)果常為陰性。 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)可見患者免疫功能紊亂，若不加以干預(yù)，免疫力進(jìn)一步低下會(huì)誘發(fā)各種疾病。,健康體檢與免疫“識(shí)別”亞健康人群 一項(xiàng)針對(duì)廣州市非體力勞動(dòng)者的亞健康狀況的流行病學(xué)研究表明，亞健康人群免疫力低下表現(xiàn)為： cd3細(xì)胞、cd4細(xì)胞百分比和cd4cd8比值顯著降低 cd4細(xì)胞絕對(duì)值降低。,43,免疫功能檢測(cè)與中醫(yī)藥完美結(jié)合,02,中醫(yī)診病療特點(diǎn)：辨證論治，從機(jī)體整體入手，扶正祛邪 中醫(yī)的重要貢獻(xiàn)：治未?。ㄖ挝床≈。?淋巴細(xì)胞亞群： 反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，可為中醫(yī)臨床辨證分型和治療提供客觀的免疫學(xué)依據(jù)。,證候是中醫(yī)學(xué)理論的核心。 施治之時(shí)，皆據(jù)證議法，譴藥立方，其著眼點(diǎn)全在于證候。,44,中醫(yī)藥免疫檢測(cè)與亞健康狀態(tài),03,免疫力檢測(cè)使得這個(gè)理念完美結(jié)合 許多白領(lǐng)、公務(wù)員、教師、醫(yī)生工作繁忙透支生命，處于亞健康狀態(tài)，這時(shí)免疫力處于低下狀態(tài)。檢測(cè) cd 系列細(xì)胞數(shù)值偏低，中醫(yī)辨證為“虛證”。 雖然未發(fā)?。ㄎ麽t(yī)無(wú)法診斷出疾病），但需要調(diào)理和干預(yù)，應(yīng)用中醫(yī)的理論辯證施治，有明顯的效果，起到西醫(yī)起不到的作用。,“上醫(yī)治未病” 扁鵲曰：上醫(yī)治未病之病，中醫(yī)治將病之病，下醫(yī)治已病之病 中醫(yī)、中藥治未病之病，這是防病、治病的重要理念。,45,中醫(yī)藥免疫監(jiān)測(cè)與亞健康狀態(tài),02, 女，28歲，主訴疲倦乏力、睡眠不佳，易感冒，無(wú)其他器質(zhì)性疾病。舌淡，苔薄白，表面粗糙，脈浮虛。屬正氣不足，元?dú)馓撊?。輔以t淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，cd4偏低、cd4/cd8在正常范圍下限。 治療：用玉屏風(fēng)散，生黃芪120克，炒白術(shù)180克，防風(fēng)60克，制成散劑，每日9克，代茶飲。,一療程后，患者cd4、cd4/cd8顯著升高，主訴癥狀明顯改善，感冒次數(shù)減少，說明患者正氣提升，免疫功能得到有效提高。,論文發(fā)表：加味玉屏風(fēng)湯對(duì)提高慢性病患者cd4指標(biāo)臨床觀察 上海中醫(yī)藥雜志,2007年第41期第10卷,46,免疫功能與感染性疾病,02,免疫功能紊亂，易引發(fā)感染性疾病,感染，同時(shí)可直接抑制、干擾和損傷免疫系統(tǒng),淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能在人體抗感染中發(fā)揮重要作用 在抗菌或抗病毒時(shí)，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，提高療效，可少用或慎用抗菌素。指導(dǎo)抗菌素的應(yīng)用。,47,淋巴細(xì)胞亞群變遷的意義感染性疾病,02,細(xì)菌性感染 t4細(xì)胞 t8或 t4/t8比值,病毒/胞內(nèi)菌/寄生蟲感染 t8細(xì)胞 t4或 t4/t8比值,上述變化是指感染的初期中期； 全身性感染變化幅度大于局部性感染； 不同病原微生物感染引起的變化幅度不同； 不同個(gè)體的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性不同，變化幅度有差別； 晚期，患者t、t4、t8細(xì)胞全線減少。,t淋巴細(xì)胞,自身免疫性性疾病 b細(xì)胞輕微 igm ,細(xì)菌性感染 b細(xì)胞 igg ,變態(tài)反應(yīng) b細(xì)胞 ige ,b淋巴細(xì)胞,nk細(xì)胞,48,淋巴細(xì)胞亞群分析與感染性疾病艾滋病,02,艾滋病 （1）疾病診斷：cd4細(xì)胞與hiv/aids診斷 aids患者cd4+t淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的進(jìn)行性減少與疾病惡化進(jìn)程呈正相關(guān)，是hiv感染的特征性變化之一 who推薦使用cd4+t淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)作為aids疾病確診及病情惡化程度的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。,進(jìn)行性hiv感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)： iii期和iv期臨床癥狀 和/或 cd4細(xì)胞350/mm3。 成人及15歲以上青少年符合以下一項(xiàng)者即可診斷為艾滋病 cd4細(xì)胞200/mm3 有成人艾滋病指征性疾病（c組臨床表現(xiàn)） 15歲一下兒童符合以下一項(xiàng)者即可診斷為艾滋病 cd4細(xì)胞25%（11月齡），或20%（12-35月齡），或15%（36-59月齡），或 200/mm3 （5-14歲） 有小兒艾滋病指征性疾?。╢組臨床表現(xiàn)）,（ws 293-2008 艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，2008）,49,淋巴細(xì)胞亞群分析與感染性疾病艾滋病,02,cd4細(xì)胞與hiv/aids治療啟動(dòng)治療時(shí)機(jī) 成人：cd4細(xì)胞500/mm3 1-5歲兒童：cd4細(xì)胞500/mm3或25% iii期和iv期臨床癥狀 和/或 cd4細(xì)胞350/mm3 合并活動(dòng)性結(jié)核；合并活動(dòng)性hbv，需要抗hbv治療；妊娠；配偶或固定性伴侶中hiv陽(yáng)性的一方 1歲嬰兒,治療監(jiān)控 病毒學(xué)監(jiān)測(cè)：hiv rna拷貝 免疫學(xué)監(jiān)測(cè)：cd4細(xì)胞,治療失敗、更換治療方案 病毒學(xué)失?。篽iv rna拷貝 免疫學(xué)失?。篶d4細(xì)胞下降到或低于基線水平，或降低至峰值的50%，或持續(xù)低于100/mm3 臨床失?。簷C(jī)會(huì)性感染或腫瘤,50,淋巴細(xì)胞亞群分析與感染原發(fā)性免疫缺陷病,02,流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群可作為原發(fā)性免疫缺陷病常規(guī)篩查項(xiàng)目,免疫指標(biāo)原發(fā)性免疫缺陷病分型和輔助診斷,51,淋巴細(xì)胞亞群分析與感染性疾病傳染性單核細(xì)胞增多癥,02,細(xì)胞免疫傳染性單核細(xì)胞增多癥（im） 血象中異型淋巴細(xì)胞增多（多為t淋巴細(xì)胞，且以cd8+t細(xì)胞為主）。 b細(xì)胞是ebv的靶細(xì)胞 異淋手工鏡檢操作時(shí)間長(zhǎng)，易受主觀影響 tbnk檢測(cè)可輔助傳單的診斷： cd3、cd8細(xì)胞明顯 cd4、cd4/cd8、b細(xì)胞顯著 ,【案例一】某女孩，11歲診斷傳單，cd4細(xì)胞減少，占8%左右，未進(jìn)行干預(yù)治療，康復(fù)后一直沒有回升，16歲并發(fā)nk細(xì)胞瘤。 【案例二】某男孩，16歲診斷傳單，cd4細(xì)胞減少，12%左右；臨床給予積極治療，康復(fù)復(fù)查24%左右，至今還是24%。,im有轉(zhuǎn)化成血液病的風(fēng)險(xiǎn) 加用免疫調(diào)節(jié)藥物促進(jìn)疾病的恢復(fù)，隨訪監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群。,52,淋巴細(xì)胞亞群分析與感染性疾病反復(fù)呼吸道感染,02,廣東醫(yī)學(xué), 2012, 33（4）,通過檢測(cè)cd3、cd4、cd8了解rrti患兒用藥前后免疫功能變化，從而判斷藥效，指導(dǎo)選藥方案。,三者聯(lián)合應(yīng)用，能明顯提高患兒免疫功能，減少呼吸道感染發(fā)生率，安全無(wú)不良反應(yīng)。,玉屏風(fēng)顆粒聯(lián)合鐵劑和鋅劑，可提高反復(fù)呼吸道感染患兒免疫功能。,兒童反復(fù)呼吸道感染（rrti） 免疫功能低下，與患兒反復(fù)呼吸道感染的發(fā)生密切相關(guān)： 患兒的cd3、cd4、cd4/cd8比值均明