液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的小知識.doc

1、 開機water 2695/micromass zq4000:開機步驟1. 分別打開質(zhì)譜、液相色譜和計算機電源，此時質(zhì)譜主機內(nèi)置的CPU會通過網(wǎng)線與計算機主機建立通訊聯(lián)系，這個時間大約需要1至2分鐘。2. 等液相色譜通過自檢后，進入Idle狀態(tài)，依照液相色譜操作程序，依次進行操作。（具體根據(jù)液相色譜不同型號來執(zhí)行，下面以2695為例）。a.打開脫氣機 (Degasser On)。b.濕灌注(Wet Prime)。c.Purge Injector。d.平衡色譜柱。3.雙擊桌面上的 MassLynx 4.0圖標進入質(zhì)譜軟件。4.檢查機械泵的油的狀態(tài)（每星期），如果發(fā)現(xiàn)渾濁、缺油等狀況，或者已經(jīng)累積運行超過3000小時，請及時更換機械泵油。5.點擊質(zhì)譜調(diào)諧圖標（MS Tune） 進入質(zhì)譜調(diào)諧窗口 。6.選擇菜單“Options Pump”，這時機械泵將開始工作，同時分子渦輪泵會開始抽真空。幾分鐘后，ZQ就會達到真空要求，ZQ前面板右上角的狀態(tài)燈“Vacuum”將變綠。7.點擊真空狀態(tài)圖標，檢查真空規(guī)的狀態(tài) ，以確認真空達到要求。8. 確認氮氣氣源輸出已經(jīng)打開，氣體輸出壓力為90 psi。9.設置源溫度 （Source Temp）到目標溫度。關機1點擊質(zhì)譜調(diào)諧圖標進入調(diào)諧窗口。2.點擊Standby 讓MS 進入待機狀態(tài)時，這時狀態(tài)燈會由綠變紅，這一過程是關質(zhì)譜高電壓的過程。3停止液相色譜流速，如果還需要沖洗色譜柱，可以將液相色譜管路從質(zhì)譜移開到廢液瓶。4等脫溶劑氣溫度（ESI）或APCI探頭溫度降到常溫，點擊氣體圖標關閉氮氣。5 逆時針方向擰開機械泵上的Gas Ballast 閥，運行20分鐘后關閉（鎮(zhèn)氣）。a) 對于ESI源，至少每星期做一次。b) 對于APCI源，每天做一次。6再次確認機械泵的Ballast閥是否已經(jīng)關閉。7選擇Option / Vent，這時質(zhì)譜開始泄真空，ZQ 前面板的狀態(tài)燈“Vacuum”開始閃爍，幾分鐘后機械泵會停止運行，這時可以關閉質(zhì)譜電源。FINNIGEN DECA 開關機及校正流程1 開機前準備事項（1） 確保質(zhì)譜總電源開關（白色開關）及主板電源開關（黑色開關）處于關閉狀態(tài)（O）；（2） 檢查真空泵油液面，確保泵內(nèi)油頁面處于標定的上下兩線之間；（3） 查看離子源潔凈程度，ESI源查看噴口是否有固體析出，毛細管口是否完好；APCI噴口是否有積液；（4） 氣體壓力，打開高純氮氣鋼瓶總閥，調(diào)節(jié)出口壓力調(diào)至0.65MPa，打開高純氦氣鋼瓶總閥,調(diào)節(jié)出口壓力調(diào)至0.25Mpa;（5） 檢查殼氣及輔助氣接口連接緊固，松開液相管路與離子源的接口；（6） 開啟動力電源，電壓穩(wěn)定，正常；（7） 確保室內(nèi)溫度在1825度。二 找方法a、 其實做方法不是很難的，先找的條件，然后建立連上液相找液質(zhì)方法就可以了，然后在優(yōu)化離子源氣體流量，以及溫度就可以了。b、首先，我們應該知道被測化合物的結構式，pKa，溶解度等理化性質(zhì)。1，根據(jù)化合物極性和分子量大小選擇離子源，非極性強的化合物可用APCI源，非極性弱的用ESI，此外ESI可形成多電荷離子，適合檢測多肽等分子量大的化合物（APCI則不行）。2，根據(jù)化合物的酸堿性選擇用正離子或負離子：一般堿性化合物用正離子，酸性或中性化合物選擇負離子。正離子條件下：流動相一般加0.010.1的甲酸，負離子條件下：流動相一般加0.010.1的甲酸銨。3，離子源和正負條件確定好后即可優(yōu)化化合物的質(zhì)譜參數(shù)：建議先搞清楚各個參數(shù)是與流速相關還是與分子量相關，與TSQ Quantumn為例：與流速相關的參數(shù)有：Spray voltage，Sheath gas， Aux gas，Capillary temperature等參數(shù)，如果流速在較低范圍內(nèi)變動，這些參數(shù)就不用優(yōu)化，使用廠家的推薦值即可。與分子量相關的參數(shù)有Tube lens offset等參數(shù)，這個一般也不建議優(yōu)化。使用校正表上的值即可。所以這一步最關鍵的是找到母離子，如有加合離子建議加大Source CID試試，給一定能量，看看打碎的主要子離子。注意：如讓儀器自動找子離子也能找到，但其優(yōu)化的碰撞能量一般偏高，一般需要在其基礎上減去Source CID的值大小即可C、如果是簡單的定性，對于錐孔電壓沒什么太苛刻的要求。但是如果是要對樣品進行定量，特別是低含量的，要講究靈敏度，那就我對單個樣品直接進樣，分別優(yōu)化毛細管電壓和錐孔電壓。三 質(zhì)譜儀按質(zhì)量分析器(或者磁場種類)可分為靜態(tài)儀器和動態(tài)儀器，即穩(wěn)定磁場（單聚焦及雙聚焦質(zhì)譜儀）和變化磁場（飛行時間和四極桿質(zhì)譜儀）。MS儀器一般由進樣系統(tǒng)、電離源、質(zhì)量分析器、真空系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)構成。 1、真空系統(tǒng) 質(zhì)譜儀中所有部分均要處高度真空的條件下(10-4-10-6Torr或mmHg), 其作用是減少離子碰撞損失。真空度過低，將會引起：a) 大量氧會燒壞離子源燈絲；b) 引起其它分子離子反應，使質(zhì)譜圖復雜化；c) 干擾離子源正常調(diào)節(jié)；d) 用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電。 2、進樣系統(tǒng)對進樣系統(tǒng)的要求：重復性、不引起真空度降低。進樣方式：a) 間歇式進樣：適于氣體、沸點低且易揮發(fā)的液體、中等蒸汽壓固體。如圖所示 注入樣品(10-100g)-貯樣器(0.5L-3L)-抽真空(10-2 Torr)并加熱-樣品蒸分子(壓力陡度)-漏隙-高真空離子源。b) 直接探針進樣：高沸點液體及固體探針桿通常是一根規(guī)格為25cm6mm i.d.,末端有一裝樣品的黃金杯(坩堝)，將探針桿通過真空閉鎖系統(tǒng)引入樣品，如圖所示。 我們試驗室用的是ABI 3000質(zhì)譜儀，主要定量分析生物樣品。 LC-MS/MS方法學開發(fā)的一般步驟是 首先通過微量注射泵獲得母離子和子離子以及DP CE這四個主要參數(shù)然后利用梯度程序考察流動相組成（包括有機相的比例，甲酸或緩沖鹽的加入量）對質(zhì)譜響應的影響。 流動相的組成確定后利用FIA優(yōu)化確定其他參數(shù)，主要是氣體參數(shù)和TEM IS。一臺LC/MS由以下幾部分組成：HPLC、離子源接口、離子束聚焦、質(zhì)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)處理、化學工作站。HPLC就不說了，先說離子源，目前比較好的離子源設計為Agilent的直角噴霧技術，好處：1。去溶劑效果好,耐受液相高流速；2。霧化針零電位,位置免調(diào)整,操作安全簡便,重現(xiàn)性好;3。離子截取面積大,靈敏度高;4。反吹干燥氮氣,有效阻擋中性分子,減少污染并保護真空;5。大口徑非加熱石英毛細管,離子傳輸效率高,有利于高靈敏度檢測；有效防止樣品熱降解；調(diào)諧穩(wěn)定，碰撞誘導解離（CID）譜圖重現(xiàn)性好；6。鉸鏈設計,不同離子源的切換,簡單方便,易于操作。下面說質(zhì)量分析器：沒有一種質(zhì)量分析器可以適用于所有領域，目前的質(zhì)量分析器有：單四極桿質(zhì)譜、三級串聯(lián)質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜、四極-飛行時間質(zhì)譜。離子檢測器：電子倍增管（EMT）：經(jīng)質(zhì)量分析器分離出來的離子首先撞擊高能轉(zhuǎn)換打拿極發(fā)射二次粒子，正、負離子轉(zhuǎn)換的二次粒子最終均為電子；隨后發(fā)射的電子進入電子倍增器的彎曲形內(nèi)壁，撞擊管壁涂層，產(chǎn)生更多的二次電子；最后以電信號輸出。電子倍增管的放大倍數(shù)約為107。 光電倍增管（PMT）：經(jīng)質(zhì)量分析器分離出來的離子首先撞擊倍增管最前端的閃爍晶體發(fā)射光子，光子照射光陰極射線管而發(fā)射電子，隨后發(fā)射的電子進入電子倍增管進行信號放大，最終同樣以電信號輸出。 微通道板（MCP）：由一組圓柱形微通道管組成，每個微通道管的作用與電子倍增管類似。當離子進入微通道管時，產(chǎn)生二次電子，反射通過這些微通道管時，不斷產(chǎn)生更多的電子。MCP的最大優(yōu)點在于具有超快的時間響應。如果將幾塊微通道板用適當?shù)姆椒ǒB在一起，放大倍數(shù)將達108。ESI是氣相離子化過程，主要包括三個步驟：1、在噴霧毛細管尖端產(chǎn)生帶電液滴；2、通過溶劑蒸發(fā)和霧滴分裂使帶電液滴變小，這個過程反復進行；3、由很小的帶電霧滴產(chǎn)生氣相離子。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統(tǒng)做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。四液質(zhì)經(jīng)驗我認為要維護好儀器，首先流速不能過大，液質(zhì)是不能承載過大流速的；其次電壓不要加到極限，尤其是正負離子轉(zhuǎn)換時要適當調(diào)整；最后是做完樣一定要及時沖洗和吹掃管路。做液質(zhì)時跑一針的時間最好不要超過45分鐘，否則儀器會很累。另外我認為API4000定量很準，但是打多級碎片時最好用的是離子阱，因為它能夠在一次進樣后同時分析多個離子，很方便，而不像四級桿一次只能進行一種離子的多級研究。1、由于液質(zhì)的流速較小（ESI一般為0.2ml/min），所以配置樣品的溶劑強度不能太大，盡量小于起始比例，否則，會出現(xiàn)保留時間偏移等問題。2、如果在液相上摸好的條件，注意尤其是流動相的組成要轉(zhuǎn)化成合適LCMS分析的。3、磷酸鹽及其他不揮發(fā)緩沖鹽在離子源會沉淀并堵塞毛細管等，要更換成可揮發(fā)的有機緩沖鹽。4、緩沖鹽會導致離子抑制，因此要控制緩沖液的強度，10mM。5、去污劑、表面活性劑會有離子抑制現(xiàn)象發(fā)生， 表面活性劑產(chǎn)生的加合物和離子簇會干擾質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因此作液質(zhì)聯(lián)用儀時，不要使用洗滌劑清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建議超聲清洗多次。比如分析的樣品必須要干凈，這樣既可以保護色譜柱，也可以防止污染質(zhì)譜；分析了大量的生物樣品后，沖洗系統(tǒng)時，先用高比例的水相沖洗，把源也給洗一下，然后再換用高比例的有機相，這時要把柱后管路從源上拿下來，避免柱中的雜質(zhì)給沖進質(zhì)譜1. 前處理：樣品一定要干凈，不管是為了質(zhì)譜還是為了保護柱子，生物樣品提取的好些，如果直接沉淀，一定要注意，盡量高轉(zhuǎn)速12000rpm以上，低溫離心，最好離2次（保險一點），轉(zhuǎn)移樣品也要仔細，從中間慢慢吸，有時會有漂浮物，島津的質(zhì)譜好像做直接沉淀的源比較容易堵，Waters的好些。2.樣品濃度：質(zhì)譜是靈敏度很高的儀器，進樣濃度一定不能太高，12ug/ml已經(jīng)可以啦，太高的濃度對儀器來說比較容易造成殘留，而且定量也會不準啦。3.流動相:流動相中盡量加易揮發(fā)的鹽，盡量不要加表面活性劑之類的，容易離子抑制，如果遇到離子抑制，可以試試把你的樣品峰往后推推或者改變提取方法，也可以試試用APCI源。如果你的液相是低壓混合的，盡量不要跑梯度，那樣很費時間，如果沒辦法，一針又要走很長時間的話，可以考慮切換，只測樣品出峰前后的那段時間，這樣可以保護質(zhì)譜。但是如果你用粗柱子，較高流速的也可以考慮跑梯度，如API4000，但要盡量減小死體積。4.沖洗:沖柱子自然不用說了，低有機相和高有機相分別沖一定時間（各至少半個小時以上吧），柱子保存在高有機相中。做完試驗，沖源也是很重要的，也是低有機相和高有機相沖，但是時間可以不用那么長，你可以先沖源再沖柱子，或者兩者分開沖，個人覺得分開沖好些，這樣柱子上的臟東西就不會進到源里面去啦。沖源的時候氣可以關小些。waters的液質(zhì)有在線除鹽的功能1、樣品必須過0.22um濾膜過濾，不得有顆粒物；2、上樣的溶劑，必須是色譜純，最好和你的流動相比例一致；3、反相體系，不允許用正己烷之類極性弱的溶劑溶解樣品并上樣。4、水，自然是純凈水了；5、樣品不允許含有金屬離子、表面活性劑（不要用洗潔精洗瓶子）、磷酸鹽、硼酸鹽等不揮發(fā)鹽；6、淋洗液緩沖溶劑必須用可揮發(fā)的，如乙酸、乙酸銨、氫氧化四丁基銨等，色譜純級別。7、樣品pH57嚴禁含有無機或有機強酸強堿。8、六通閥處變?nèi)?，最好把沒有信號的區(qū)域，切換到廢液，這樣減少源的污染9、定期振氣、清洗離子源，換油、1.峰漂移的程度與進樣體積有關，一般體積越小，對峰漂移的影響越小，缺點是響應也減小。2.峰漂移與其出鋒時間流動相的組成有關，如果出峰時間流動相強度很大影響就很小。個人觀點，僅供參考。一般氣源檢查，總壓力不能過大，檢查泵油位置，查看真空度等，勤沖洗管路。1. 定期震氣，更換機械泵油、濾網(wǎng)，必要時儀器除塵等。2.每個項目做完，大約1000個樣品后，清洗離子源、樣品錐孔、預四級桿等。3.定期對質(zhì)譜進行期間核查、校準等。儀器狀態(tài)正常時，以上是最基本的維護。還有一些注意事項：1.每次進完樣后，液相和質(zhì)譜部分都要沖洗干凈。2.樣品前處理一定要干凈。3.非揮發(fā)性的鹽不能用在質(zhì)譜中。4.如果遇到放長假，實驗室沒有人，最最保險的辦法就是關機，以免遇到停電的情況。5.質(zhì)譜所處的工作環(huán)境最好要無塵，溫、濕度要嚴格控制。6.樣品濃度不能太高，以免污染離子源和四級桿。7.做實驗時，經(jīng)常關注真空、柱壓、碰撞氣壓力等，如遇情況可以及時處理。8.操作人員一定要培訓后才能上崗。一般也就是勤沖洗，特別是測完樣品后多沖，離子源多清洗，泵油定期檢查、更換，濾網(wǎng)及時更換清洗，其它的也沒什么好做的了。首先流速不能過大，液質(zhì)是不能承載過大流速的；其次電壓不要加到極限，尤其是正負離子轉(zhuǎn)換時要適當調(diào)整；最后是做完樣一定要及時沖洗和吹掃管路。注意：做液質(zhì)時跑一針的時間最好不要超過45分鐘，否則儀器會很累。做液質(zhì)三年了，島津、waters、ABI和finigan的都摸過，經(jīng)驗談不上，說點自己的注意點吧。1.前處理：樣品一定要干凈，不管是為了質(zhì)譜還是為了保護柱子，生物樣品提取的好些，如果直接沉淀，一定要注意，盡量高轉(zhuǎn)速12000rpm以上，低溫離心，最好離2次（保險一點），轉(zhuǎn)移樣品也要仔細，從中間慢慢吸，有時會有漂浮物，島津的質(zhì)譜好像做直接沉淀的源比較容易堵，Waters的好些。2.樣品濃度：質(zhì)譜是靈敏度很高的儀器，進樣濃度一定不能太高，12ug/ml已經(jīng)可以啦，太高的濃度對儀器來說比較容易造成殘留，而且定量也會不準啦。3.流動相：流動相中盡量加易揮發(fā)的鹽，盡量不要加表面活性劑之類的，容易離子抑制，如果遇到離子抑制，可以試試把你的樣品峰往后推推或者改變提取方法，也可以試試用APCI源。如果你的液相是低壓混合的，盡量不要跑梯度，那樣很費時間，如果沒辦法，一針又要走很長時間的話，可以考慮切換，只測樣品出峰前后的那段時間，這樣可以保護質(zhì)譜。但是如果你用粗柱子，較高流速的也可以考慮跑梯度，如API4000，但要盡量減小死體積。4.沖洗：沖柱子自然不用說了，低有機相和高有機相分別沖一定時間（各至少半個小時以上吧），柱子保存在高有機相中。做完試驗，沖源也是很重要的，也是低有機相和高有機相沖，但是時間可以不用那么長，你可以先沖源再沖柱子，或者兩者分開沖，個人覺得分開沖好些，這樣柱子上的臟東西就不會進到源里面去啦。沖源的時候氣可以關小些。日常維護:注意用流動相HPLC級,水用超純水,不含磷酸鹽等緩沖液.防濕防塵(用除濕機各遮布).用UPS電源以防臨時停電影響.樣品分析后用異丙醇液清洗霧化室.此外,定期清洗霧化針和查看泵油液面等.液相部分：應勤過濾流動相或更換新流動相，一般配制一次水相使用時間不要超過三天；及時清洗流動相濾頭；若發(fā)現(xiàn)排空壓力增大應及時更換泵頭濾芯；每天做完樣應及時沖洗管路及色譜柱。質(zhì)譜部分：勤洗離子源，并定期進行一次徹底的清洗維護，不定時檢查霧化針的情況并可定期用異丙醇（或異丙醇：水）懸空超聲清洗；每天進樣時檢查霧化狀況；每天檢查氣源情況，防止氣源不足造成斷氣既影響工作又影響儀器使用壽命；定期檢查前級泵泵油情況，及時震氣使油回流；若長時間分析樣品，每天或每隔幾天應重啟電腦及與質(zhì)譜的通訊設備，防止因通訊故障造成質(zhì)譜采樣出錯或無法連接。簡單說說IT-TOF日常維護：1 每分析完一批樣品（大概30-40個生物樣品），IT-TOF中的離子源及Heat Block模塊要用甲醇或異丙醇清洗2 每隔一段時間要進行一次儀器調(diào)諧以保證準確質(zhì)量數(shù)；平時可只做TOF的調(diào)諧；調(diào)諧完畢之后要先用乙腈以0.2mL/min的流速沖洗30min以上并清洗離子源。3 LC中若使用緩沖鹽，實驗結束之后先用水沖洗柱子，柱子最后要保存在有機相中；用于洗泵頭的溶劑要經(jīng)常更換5 每4個月更換一次泵油；每隔兩星期打開真空泵放氣閥約30min，關閥后要再往回旋2圈。說說我們在建立方法時感觸最深的幾點：1. 選擇的離子對一定要穩(wěn)定，質(zhì)譜的參數(shù)要細細優(yōu)化：尤其在選擇用加合離子定量時，尤其要注意這一點，一般加合離子需要在一定的條件下（酸堿度、離子強度等）才能保持離子化程度一樣，就響應一樣。用對照品溶液測定時可能一致，可實際樣品中要復雜的多，其他物質(zhì)對離子化可能有影響。2.確定待測物在柱上是否有保留：計算一下管路的死體積、柱的死體積之和，除以你的流速所得到的值，一定要小于你的待測物的出峰時間，最好差值在0.5min以上。因為液質(zhì)不同液相，柱上沒有保留在前面流出的物質(zhì)噴霧時不穩(wěn)定，會導致低濃度點、尤其定量下限附近同一樣品響應不穩(wěn)定。我們在測得時遇到低濃度點的QC能相差雙倍，怎么也不符合要求（80120），于是就將同一樣品重復進樣，發(fā)現(xiàn)重復性非常差，也是成倍的差異，于是就尋找原因，什么都試了就是不行，后來咨詢了應用工程師，才懷疑是否有保留。于是，改變比例，推遲出峰，嘿，問題就解決了。就此問題，浪費了我們一個多星期來找原因。3. 樣品的處理方法及內(nèi)標的選擇：當測定復雜樣品時，如生物樣品血漿、膽汁、尿等，一定要考察在不同的實際樣品中，內(nèi)標、待測物是否能保持一致。我們就遇到特別郁悶的事情，在空白血漿中內(nèi)標提取后響應非常一致，線性及QC樣品都很好，可加入不同時間點采得的血漿后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)標出現(xiàn)高低不平的現(xiàn)象，有時甚至相差1倍?？赡転椴煌瑫r間點的血漿中的背景物質(zhì)、或pH等不一致、導致其在提取、離子化過程中存在差異。質(zhì)譜儀所能檢測的最小到最大的質(zhì)量范圍： 不同儀器： 四極桿 1600Da，14000Da，磁質(zhì)譜：110000Da，飛行時間質(zhì)譜：無上限，離子阱質(zhì)譜：12000Da，14000Da，質(zhì)譜圖中的橫坐標，質(zhì)量與電荷之比。若離子所帶電荷為z = 1，則質(zhì)荷比等于該離子的質(zhì)量數(shù)。離子是以12C原子的1/12定義為一個質(zhì)量單位，用u表示。 1u=1.66054x10-27kg其它常用符號，Da, 道爾頓 1Da=1u 分辨力(Resolution Power, RP) 分辨力：分開兩個鄰近質(zhì)量峰的能力。 何為分開：若兩個相鄰峰的峰谷低于峰高的10%(或5%，50%)，則認為是分