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microRNA101增強紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡 張積廣 福建省立醫(yī)院胸外科，福建福州350001 摘要目的研究microRNA-101(miR-101)對紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡的影響，并探討其潛在機制。方法將miR-101mimics、siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染到非小細胞肺癌細胞中；應(yīng)用流式細胞學annexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡；應(yīng)用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2,Bim和cleavedPARP的表達。結(jié)果miR-101過表達或EZH2基因沉默促使紫杉醇誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞凋亡,與相應(yīng)的陰性對照組相比凋亡細胞數(shù)量分別為2.4倍及2.2倍，；miR-101抑制EZH2表達并增強凋亡相關(guān)蛋白Bim和cleavedPARP的表達，,與相應(yīng)的陰性對照組相比Bim和cleavedPARP的表達分別為1.8倍及2.7倍。結(jié)論miR-101增強紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡。其機制可能為miR-101介導(dǎo)的EZH2低表達誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bim生成，因此促進紫杉醇誘導(dǎo)肺癌凋亡。 關(guān)鍵詞微小rna-101；ezh2基因；非小細胞肺癌；細胞凋亡；紫杉醇 R739.5A1674-074（4）10（b）055-03 基金項目福建省自然科學基金資助項目（xxJ05136）；福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項目（212-2-2）。 非小細胞肺癌的發(fā)病率及病死率高，對放化療不敏感，療效欠佳。紫杉醇是非小細胞肺癌治療的一線化療藥物，臨床應(yīng)用較廣泛，其抗腫瘤機制主要是通過凋亡促使腫瘤細胞死亡，而凋亡抵抗是惡性腫瘤細胞的一個重要生物學特征，嚴重降低紫杉醇的治療效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增強其抗腫瘤作用，提高其療效。microRNA是單鏈非編碼小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，是腫瘤學近年研究的熱點，據(jù)文獻1報道m(xù)iRNA可改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。該研究起止時間為xx年1月xx年5月，旨在闡明miR-101促進紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡，并探討其可能機制，現(xiàn)報道如下。 1方法 1.1細胞培養(yǎng) H358(支氣管肺泡癌)和H226(鱗癌)細胞株購自ATCC，細胞株在含10%FBS、含雙抗(100IU青霉素和100g/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 1.2miRNA-101mimics和siRNA的細胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine2000說明書的步驟進行轉(zhuǎn)染。將適當數(shù)量肺癌細胞接種于96孔或6孔板，細胞匯合度達到50%60%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h，更換培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM。 1.3實時定量PCR 用Trizol從細胞中提取總RNA。 microRNA-101表達檢測 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR擴增，反應(yīng)體系如下。 2Real-timePCRBuffer10L，miRspecificPrimerset(5mol/L)0.6LmiRNARTproduct(物稀釋3倍)2L，TaqDNApolymerase（5U/L）0.2L，ddH2OTo20L。混勻上述各組分，953min,9512s，5840s，40個循環(huán)，PCR反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上完成。U6作為內(nèi)參，用2-ct法計算。該實驗重復(fù)3次。 EZH2-mRNA表達檢測 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR擴增，反應(yīng)體系如下。 上、下游引物各(10mol/L)1L，SYBRGreenReal-timePCRMasterMix12.5L，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(稀釋10倍)1L，AddH2Otofinal25L。將上述各部分混勻。9560s；9515s，5615s，7245s，共40個循環(huán)。 1.4WesternBlot 每個孔均加入細胞裂解液充分搖勻，在冰上作用30min后進一步離心后吸取上清液，蛋白濃度用Bi-Rad蛋白測定試劑盒測定，-70保存于深低溫冰箱。取30g樣品進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫下封閉1h后分別與相應(yīng)一抗、二抗充分相互作用，最后用ECL化學發(fā)光試劑進行檢測。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。 1.5細胞凋亡檢測 將肺癌細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染方法同前，將每種細胞分為4組即siRNA-EZH2組、siRNA陰性對照組及轉(zhuǎn)染miR-101組、miRNA陰性對照組。將紫杉醇（終濃度為40nmol/L）加入轉(zhuǎn)染72h后細胞，并孵育48h。將收集的每組細胞分為倆份，一份用于AnnexinV-FITC凋亡檢測，而另外一份用于westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白，按試劑盒說明操作。 1.6統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均以SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)標準差(xs)表示。 2結(jié)果 2.1miR-101過表達或EZH2基因沉默增強紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡 非小細胞肺癌H358和H226細胞株對紫杉醇的藥物敏感性低，因而被用于該研究。EZH2是miR-101的靶基因，具有癌基因特性，促進非非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此將沉默EZH2表的siRNA-EZH2作為陽性對照。miR-101mimics或siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細胞72h后再加入紫杉醇培養(yǎng)48h，用流式檢測細胞凋亡，結(jié)果表明miR-101過表達或EZH2基因沉默(圖A)顯著增強腫瘤細胞對紫杉醇敏感性，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡數(shù)量顯著上升(圖B和圖C)。 2.2miR-101抑制EZH2表達并增強凋亡相關(guān)蛋白Bim和cleavedPARP的表達 為了研究miR-101增強腫瘤細胞對紫杉醇敏感性的可能機制，同時我們亦收集上述與紫杉醇培養(yǎng)48h后的肺癌細胞，用于檢測凋亡相關(guān)蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim是決定腫瘤細胞對紫杉醇敏感性的重要因子2，而EZH2抑制Bim表達3，所以我們檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2、Bim、和cleavedPARP的表達。該實驗結(jié)果表明，EZH2蛋白在miR-101和siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細胞組的表達水平顯著低于相應(yīng)的陰性對照組，而Bim和cleavedPARP蛋白在miR-101和siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細胞組的表達水平顯著高于相應(yīng)的陰性對照組(圖D和圖E)。 3討論 非小細胞肺癌對化學藥物治療不敏感，且預(yù)后通常欠佳4-6，這種狀況在過去的幾十年中并未得到改善。紫杉醇是當前廣泛應(yīng)用于非小細胞肺癌治療的臨床一線藥物，主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，雖然其取得一定臨床治療成績，但并不理想，若能進一步提高其療效則有益于肺癌患者。因此，檢測miR-101能否增進紫杉醇誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞凋亡及其可能的機制值得進一步深入研究。該研究顯示提高miR-101表達或沉默EZH2基因均能促進紫杉醇誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，同時亦降低EZH2蛋白表達和增強Bim蛋白表達。先前文獻研究顯示Bim能增進非小細胞肺癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性，而下調(diào)Bim基因表達則顯著減少紫杉醇導(dǎo)致的非小細胞肺癌細胞死亡，此表明Bim是連接紫杉醇和凋亡之間的一個重要分子。EZH2已經(jīng)被證實能通過后生性抑制Bim表達而減少腫瘤細胞凋亡。結(jié)合上述科研成果，研究結(jié)果提示miR-101調(diào)節(jié)紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌凋亡的機制如下：由miR-101介導(dǎo)的EZH2低表達誘導(dǎo)Bim蛋白生成，因此增強紫杉醇誘導(dǎo)的非小細胞肺癌凋亡。 綜上，在非小細胞肺癌中miR-101能增強紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡。該研究結(jié)果提示miR-101和EZH2可能成為臨床非小細胞肺癌治療的潛在新靶點，有望改善非小細胞肺癌患者的臨床治療效果。 參考文獻 1Esquela-KerscherA,SlackFJ.Onirs-microRNAswitharoleincancerJ.NatureReviewsCancer，xx（6）:259-269. 2PorkkaKP,PfeifferMJ,WalteringKK,etal.MicroRNAexpressionprofilinginprostatecancerJ.CancerResearch，xx，67:6130-6135. 3CimminoA,CalinGA,FabbriM,etal.miR-15andmiR-16induceapoptosisbytargetingBCL2J.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，xx，102:13944-13949. 4GalardiS,MercatelliN,GiordaE,etal.miR-221andmiR-222expressionaffectstheproliferationpotentialofhumanprostatecarcinomacelllinesbytargetingp27Kip1J.JournalofBiologicalChemistry，xx，282:23716-23724. 5GilliesJK,LorimerIA.Regulationofp27Kip1bymiRNA221/2