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microRNA101增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡 張積廣 福建省立醫(yī)院胸外科，福建福州350001 摘要目的研究microRNA-101(miR-101)對紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其潛在機(jī)制。方法將miR-101mimics、siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中；應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)annexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；應(yīng)用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2,Bim和cleavedPARP的表達(dá)。結(jié)果miR-101過表達(dá)或EZH2基因沉默促使紫杉醇誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡,與相應(yīng)的陰性對照組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量分別為2.4倍及2.2倍，；miR-101抑制EZH2表達(dá)并增強(qiáng)凋亡相關(guān)蛋白Bim和cleavedPARP的表達(dá)，,與相應(yīng)的陰性對照組相比Bim和cleavedPARP的表達(dá)分別為1.8倍及2.7倍。結(jié)論miR-101增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能為miR-101介導(dǎo)的EZH2低表達(dá)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bim生成，因此促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)肺癌凋亡。 關(guān)鍵詞微小rna-101；ezh2基因；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞凋亡；紫杉醇 R739.5A1674-074（4）10（b）055-03 基金項(xiàng)目福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（xxJ05136）；福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項(xiàng)目（212-2-2）。 非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率及病死率高，對放化療不敏感，療效欠佳。紫杉醇是非小細(xì)胞肺癌治療的一線化療藥物，臨床應(yīng)用較廣泛，其抗腫瘤機(jī)制主要是通過凋亡促使腫瘤細(xì)胞死亡，而凋亡抵抗是惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特征，嚴(yán)重降低紫杉醇的治療效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增強(qiáng)其抗腫瘤作用，提高其療效。microRNA是單鏈非編碼小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，是腫瘤學(xué)近年研究的熱點(diǎn)，據(jù)文獻(xiàn)1報(bào)道m(xù)iRNA可改變腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。該研究起止時(shí)間為xx年1月xx年5月，旨在闡明miR-101促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，并探討其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。 1方法 1.1細(xì)胞培養(yǎng) H358(支氣管肺泡癌)和H226(鱗癌)細(xì)胞株購自ATCC，細(xì)胞株在含10%FBS、含雙抗(100IU青霉素和100g/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 1.2miRNA-101mimics和siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine2000說明書的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將適當(dāng)數(shù)量肺癌細(xì)胞接種于96孔或6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h，更換培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM。 1.3實(shí)時(shí)定量PCR 用Trizol從細(xì)胞中提取總RNA。 microRNA-101表達(dá)檢測 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下。 2Real-timePCRBuffer10L，miRspecificPrimerset(5mol/L)0.6LmiRNARTproduct(物稀釋3倍)2L，TaqDNApolymerase（5U/L）0.2L，ddH2OTo20L?；靹蛏鲜龈鹘M分，953min,9512s，5840s，40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上完成。U6作為內(nèi)參，用2-ct法計(jì)算。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 EZH2-mRNA表達(dá)檢測 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下。 上、下游引物各(10mol/L)1L，SYBRGreenReal-timePCRMasterMix12.5L，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(稀釋10倍)1L，AddH2Otofinal25L。將上述各部分混勻。9560s；9515s，5615s，7245s，共40個(gè)循環(huán)。 1.4WesternBlot 每個(gè)孔均加入細(xì)胞裂解液充分搖勻，在冰上作用30min后進(jìn)一步離心后吸取上清液，蛋白濃度用Bi-Rad蛋白測定試劑盒測定，-70保存于深低溫冰箱。取30g樣品進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫下封閉1h后分別與相應(yīng)一抗、二抗充分相互作用，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。 1.5細(xì)胞凋亡檢測 將肺癌細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染方法同前，將每種細(xì)胞分為4組即siRNA-EZH2組、siRNA陰性對照組及轉(zhuǎn)染miR-101組、miRNA陰性對照組。將紫杉醇（終濃度為40nmol/L）加入轉(zhuǎn)染72h后細(xì)胞，并孵育48h。將收集的每組細(xì)胞分為倆份，一份用于AnnexinV-FITC凋亡檢測，而另外一份用于westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白，按試劑盒說明操作。 1.6統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示。 2結(jié)果 2.1miR-101過表達(dá)或EZH2基因沉默增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡 非小細(xì)胞肺癌H358和H226細(xì)胞株對紫杉醇的藥物敏感性低，因而被用于該研究。EZH2是miR-101的靶基因，具有癌基因特性，促進(jìn)非非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此將沉默EZH2表的siRNA-EZH2作為陽性對照。miR-101mimics或siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后再加入紫杉醇培養(yǎng)48h，用流式檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明miR-101過表達(dá)或EZH2基因沉默(圖A)顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著上升(圖B和圖C)。 2.2miR-101抑制EZH2表達(dá)并增強(qiáng)凋亡相關(guān)蛋白Bim和cleavedPARP的表達(dá) 為了研究miR-101增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇敏感性的可能機(jī)制，同時(shí)我們亦收集上述與紫杉醇培養(yǎng)48h后的肺癌細(xì)胞，用于檢測凋亡相關(guān)蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim是決定腫瘤細(xì)胞對紫杉醇敏感性的重要因子2，而EZH2抑制Bim表達(dá)3，所以我們檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2、Bim、和cleavedPARP的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EZH2蛋白在miR-101和siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的陰性對照組，而Bim和cleavedPARP蛋白在miR-101和siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的陰性對照組(圖D和圖E)。 3討論 非小細(xì)胞肺癌對化學(xué)藥物治療不敏感，且預(yù)后通常欠佳4-6，這種狀況在過去的幾十年中并未得到改善。紫杉醇是當(dāng)前廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌治療的臨床一線藥物，主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，雖然其取得一定臨床治療成績，但并不理想，若能進(jìn)一步提高其療效則有益于肺癌患者。因此，檢測miR-101能否增進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。該研究顯示提高miR-101表達(dá)或沉默EZH2基因均能促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)亦降低EZH2蛋白表達(dá)和增強(qiáng)Bim蛋白表達(dá)。先前文獻(xiàn)研究顯示Bim能增進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性，而下調(diào)Bim基因表達(dá)則顯著減少紫杉醇導(dǎo)致的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡，此表明Bim是連接紫杉醇和凋亡之間的一個(gè)重要分子。EZH2已經(jīng)被證實(shí)能通過后生性抑制Bim表達(dá)而減少腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)合上述科研成果，研究結(jié)果提示miR-101調(diào)節(jié)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡的機(jī)制如下：由miR-101介導(dǎo)的EZH2低表達(dá)誘導(dǎo)Bim蛋白生成，因此增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌凋亡。 綜上，在非小細(xì)胞肺癌中miR-101能增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果提示miR-101和EZH2可能成為臨床非小細(xì)胞肺癌治療的潛在新靶點(diǎn)，有望改善非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療效果。 參考文獻(xiàn) 1Esquela-KerscherA,SlackFJ.Onirs-microRNAswitharoleincancerJ.NatureReviewsCancer，xx（6）:259-269. 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