（茶學(xué)專業(yè)論文）茶樹(shù)β13葡聚糖酶基因的克隆及原核表達(dá)分析.pdf

摘要 茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，茶葉為我國(guó)主要出n g , j 匯農(nóng)產(chǎn)品。長(zhǎng)期以來(lái)， 真菌病害一直是危害茶樹(shù)生長(zhǎng)、影響茶葉產(chǎn)量的主要病害之一，給我國(guó)的茶葉帶來(lái)巨 大的經(jīng)濟(jì)損失，因此防治真菌病害一直是人們非常關(guān)注的問(wèn)題。自栽培茶樹(shù)以來(lái)，人 類(lèi)采取了多種措施防治真菌病害：通過(guò)傳統(tǒng)育種方法，培育抗病新品種；施用化學(xué)殺 菌劑；采用綜合防治等方法盡量減少農(nóng)藥的使用量和農(nóng)藥殘留量。但由于作物本身的 遺傳資源有限，真菌的高變異性以及化學(xué)殺菌劑的污染問(wèn)題，使得利用基因工程的手 段培育抗病品種成為近年來(lái)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。 本論文中，首次從木本植物茶樹(shù)中克隆出1 3 1 , 3 一葡聚糖酶基n ( g 1 u ) 的全長(zhǎng)序列， 并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，鑒定表達(dá)蛋白的活性，為開(kāi)展茶樹(shù)抗真菌病害的基因工程 研究及運(yùn)用生物技術(shù)培養(yǎng)茶樹(shù)良種打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明： 1 根據(jù)已知茶樹(shù)g l u3 - 端的部分序列設(shè)計(jì)特異引物，采用5 - r a c e 技術(shù)獲得了5 一 端核酸序列片段1 0 0 5 b p ，經(jīng)過(guò)測(cè)序，在g e n b a n k 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索分析表明，克隆所 得堿基序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列與已報(bào)道的其他植物的c d n a 相應(yīng)序列有很高 的一致性，推測(cè)該特異產(chǎn)物為茶樹(shù)g l u 的片段。 2 ，根據(jù)已知g l u3 - 端部分序列和克隆得到的5 一端序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)采用高保 真酶體系做p c r 反應(yīng)，得到全長(zhǎng)序列2 0 0 2 b p ，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 4 8 8 b p ，編碼4 9 5 個(gè)氨基酸。在g e n b a n k 和s w i s s p o r t 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索分析表明，該序列所推導(dǎo)的氨 基酸序列與已報(bào)道的其他植物g l u 的e d n a 相應(yīng)序列有3 0 - - 7 0 的一致性，推測(cè) 該全長(zhǎng)片段為茶樹(shù)g l u 。 3 選用p e t 3 2 a 表達(dá)載體和b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 宿主菌的原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)g l u 的開(kāi)放閱 讀框片段進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)i p t g 誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白的分子量約為7 3 k d a ，推算出 g l u 基因表達(dá)蛋白分子量為5 3 5 k d a ，與預(yù)計(jì)的分子量5 2 9 k d a 相符。表達(dá)的蛋白 經(jīng)薄層層析分析，但沒(méi)有酶活性。 關(guān)鍵詞：茶樹(shù)1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶 e d n a蛋白表達(dá) 1 1 1 a b s t r a c t t e ap l a n t 【c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) ok u n t z e s 】i so n eo ft h ei m p o r t a n ti n d u s t r i a lc r o p sa n de x p o r t a g r i c u l t u r a lp r o d u c t si nc h i n a s i n c eal o n gt i m e ，f u n g a ld i s e a s e sh a v eb e e no n eo f t h ep r i n c i p a lc a u s e s o ft e ap l a n tg r o w t ha n dt e ay i e l d ，w h i c hr e s u l t st h en a t i o n a lt e ag r e a te c o n o m i cl o s s e s 。s oh o wt o c o n t r o lf u n g a ld i s e a s e sh a sb e e no d eo f t h ec o n c e r n e dq u e s t i o n sb yt h eb r e e d e r s s i n c eh u m a ns t a r t e dt o c u l t i v a t et e ap l a n t s ，al o to f m e a s u r e sh a v eb e e na p p l i e dt oc o n t r o lt h ef u n g a ld i s e a s e s ，s u c ha sb r e e d i n g t h ef u n g u s r e s i s t a n tc u l t i v a r sb yc o n v e n t i o n a lb r e e d i n gw a y s ，t h ea p p l i c a t i o no fp e s t i c i d e s ，a n d c o l l i g a t e dw a y st or e d u c ed o s a g eo f a g r o c h e m i c a l sa n dr u d i m e n t a la g r o c h e m i c a l s b u td u et ot h el i m i t e d i n h e r i t a n c er e s o u r c e s ，t h eh i 【g hv a r i a b i l i t yo f f u n g a la n dt h ep o l l u t i o no f t h ep e s t i c i d e se t c ，w h i c hl e a d s t oa p p l y i n gt h et e c h n o l o g yo f g e n ee n g i n e e r i n gt ob r e e dt h ea n t i p a t h o g e n sc u l t i v a r sb e c o m e so n eo f t h e r e c e n tr e s e a r c hf o c u s e so f a g r i c u l t u r a lb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r t h ef u l l - l e n g t he d n ao fb - 1 , 3 一g l u c a n a s eo f t e ap l a n th a db e e nc l o n e da n ds t u d i e da t t h ef i r s tt i m e t h i sg e n ew a se x p r e s s e di ne c o l ia n di t sp r o t e i na c t i v e n e s sw a sd e t e r m i n e d ，w h i c hw a s n o to n l yc o n t r i b u t et ot h eg e n ee n g i n e e r i n gr e s e a r c ho na n t i - f o n g a lp a t h o g e n so ft e ap l a n t ，b u tm a k ea b a s ef o ra p p l y i n gt h eb i o l o g i c a lt e c h n o l o g yt ob r e e dt h et e ac u l t i v a r s i nt h i sw o r k ，t h ee x p e r i m e n tr e s u l t s s h o w t h a t ： i a c c o r d i n g t o t h e p a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c e o f1 5 1 ，3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t ，w e d e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt h eg s pp r e m i e rf o r5 - r a c er e a c t i o n a1 0 0 5 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db y 5 - r a c ew h i c hw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n kd a t e - b a s ea f t e rs e q u e n c i n g ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo ft h en u c l e o d d ea n dd e d u c e da m i n oa c i d sh a dh i g li d e n t i t yw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gp a r to fb - 1 , 3 - g l u c a n a s ec d n a s o f o t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h i ss p e c i f i c p r o d u c t m a yb e t h e p a r t i a l f r a g m e n t o fb - 1 , 3 - g l u c a n a s e o f t e a p l a n t 2 a c c o r d i n gt ot h ep a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c ea n dc l o n e d5 - t e r m i n a ls e q u e n c e ，w ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt w ot e r m i n a lg s pp r e m i e r s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n to f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ee d n a w a sa m p l i f i e dp c rb yu s i n gh i g h - f i d e l i t yd n a p o l y m e r a s e ，a n dt h es e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e d t h a t t h e f u l l - l e n g t ho f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ec d n a w a sc o m p o s e d o f 2 0 0 2 b p ，a n d t h e o r ：w a s1 4 8 8 b p ， c o d i n gf o r4 9 5a m i n oa c i d s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n tw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n ka n d s w i s s - p o r td a t e - b a s e s ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i d sh a d3 0 - - 7 0 i d e n t i t y w i t ht h ec o r r e s p o n d i n gp a r to fp 1 3 g l u c a n a s ec d n a so fo t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h i ss p e c i f i cp r o d u c tm a yb et h ef u l l - l e n g t hf r a g m e n to fb - 1 3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t 3 t h eo r fs e q u e n c eo fb 一1 , 3 一g l u c a n a s ew a sc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 aa n de x p r e s s e di n b l 2 i t r x b ( d e 3 ) t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h ef u s i o na n dt a r g e tp r o t e i ni n d u c e db yi p t gw a sa b o u t l v 7 3 k d a a n d5 3 5 k d ar e s p e c t i v e l ya c c o r d e dw i t ht h ee s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h t5 2 9 k d a e n z y m ea c t i v i t yw a sa n a l y z e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , b u tn oa c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d k e y w o r d s ：t e a p l a n t c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e s ) ；b - 1 , 3 - g l u c a n a s e c d n a ；e x p r e s s i o np r o t e i n v 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成 果。盡我所知除了文中特矧j j n 以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā) 表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū) 而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明 確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名 魚(yú)迄 時(shí)1 8 1 ：) o b y - 年6 月2 j f i 關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保酎 送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。可以采用影印、縮印或掃描等復(fù) 制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、 傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 研究生簽名：亟邀時(shí)間：砂5 ，年f 月確 第一導(dǎo)師簽名：時(shí)間： 時(shí)哞z 月 、 文獻(xiàn)綜述 植物抗病性及其機(jī)制一直是植物病理學(xué)和抗病育種中的熱點(diǎn)問(wèn)題。植物抵抗病原 菌的機(jī)制般有兩種，一種是先天的結(jié)構(gòu)性障礙和( 或) 誘導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)，另外一 種是系統(tǒng)性獲得性抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t e n c e ，s a r ) 【1 1 前者的典型例子是過(guò) 敏性反應(yīng)( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 誘導(dǎo)1 2 1 ，h r 與植物的抗病性有直接的關(guān)系， 但h r 的原理還不十分清楚，一般認(rèn)為植物受到病原苗感染后，細(xì)胞發(fā)生程序性死亡， 但同時(shí)植物也釋放出胞液中儲(chǔ)存的有害物質(zhì)，如植保素和病程相關(guān)蛋白 ( p a t h o g e n s i s r e l a t e d p r o t i e n ，p r ) p j ，葡聚糖酶即是這樣一種蛋白。 1 1 3 1 , 3 葡聚糖酶的基本生物學(xué)特性 b 一1 ，3 葡聚糖酶在高等植物內(nèi)廣泛分布，包括花粉管壁、精細(xì)胞壁、篩管端壁等 結(jié)構(gòu)中均有存在，它們?cè)谥参镎５陌l(fā)育階段中發(fā)揮重要作用。以往的研究表明d 1 ，3 一 葡聚糖酶涉及到許多生理過(guò)程，包括谷類(lèi)發(fā)芽、胚軸和胚芽鞘發(fā)育、韌皮部運(yùn)輸和胼 胝質(zhì)的運(yùn)動(dòng)、微管組織運(yùn)輸調(diào)節(jié)和細(xì)胞壁生物合成、花的發(fā)育、小孢子形成、花粉管 發(fā)育、果實(shí)成熟、植物衰老以及固定和愈色性葡聚糖的清除等方面。在植物抵抗外來(lái) 病原菌的過(guò)程中，b 一1 ，3 一葡聚糖酶是植物過(guò)敏性反應(yīng)( h r ) 中合成的重要水解酶類(lèi)。 植物抵抗病菌侵害的途徑多種多樣，包括加固細(xì)胞壁、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，而其首要的方 式則是h r 。根據(jù)基因的進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)特點(diǎn)和氨基酸序列相似程度等方面，b 1 ，3 一 葡聚糖酶可以分為不同的類(lèi)型。綜合以往的研究結(jié)果，b 1 ，3 葡聚糖酶可以歸納為三 種類(lèi)型：定位于液泡的堿性類(lèi)型、胞外定位的酸性類(lèi)型、還有其它一些b 1 ，3 葡聚糖 酶在序列上與以上馕種類(lèi)型相差甚遠(yuǎn)，可以單獨(dú)作為一類(lèi)【4 】。 2 p - 1 ，3 葡聚糖酶在植物抗病中的作用 d 1 ，3 葡聚糖酶是一類(lèi)重要的病程相關(guān)蛋白( p r ) ，p r 類(lèi)蛋白是由植物寄主基因 編碼的，在病理或相關(guān)條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，p r 類(lèi)蛋白與植物系統(tǒng)獲得性抗性 ( s a r ) 和系統(tǒng)誘導(dǎo)性抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) 有密切相關(guān)【5 】。根據(jù) 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的p r 蛋白可分為十一類(lèi)，d 1 ，3 葡聚糖酶屬于p r 一2 類(lèi)【6 】o p l ，3 - 葡聚糖酶在植物的抗病過(guò)程中扮演著重要角色。p 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)是 真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分，許多真菌的菌絲尖端，b 1 ，3 葡聚糖和幾丁質(zhì)暴露在表 面，能夠直接受到p 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的攻擊，體外抑菌試驗(yàn)表明，b 1 ，3 葡聚 糖酶對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用嘲。不過(guò)，只有液泡定位的堿性葡聚糖酶能夠降解菌絲 壁，從而抑制生長(zhǎng)，而胞間定位的類(lèi)型則沒(méi)有抑菌活性【7 1 ，b 1 ，3 葡聚糖酶與幾丁質(zhì) 酶共同作用時(shí)抑菌效果更明顯。當(dāng)然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白( g l u c a n a s e i n h i b i t o rp r o t e i n ，r i p ) ，r i p 特異性地抑制寄主內(nèi)源葡聚糖酶的活性【8 】，這反映了植 物與微生物共進(jìn)化的一種關(guān)系。更重要的是，在水解過(guò)程中有真菌細(xì)胞壁釋放出來(lái)的 寡聚糖能夠作為植物多種抗病反應(yīng)的激發(fā)因子，誘導(dǎo)植物的全面抗病反應(yīng)【引o l 。這方 面的報(bào)道集中在大豆與大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葡聚糖酶激發(fā) 子結(jié)合蛋白( g l u c a n e l i c i t o r b i n g d i n g p r o t e i n ，g e b p ) ，定位于大豆根部細(xì)胞的質(zhì)膜上， 能夠特異性地結(jié)合口1 ，3 一葡聚糖酶降解過(guò)程中釋放出來(lái)的寡糖激發(fā)子，誘導(dǎo)植物的防 衛(wèi)反應(yīng)j 。綜上所述，8 】，3 一葡聚糖酶的作用方式是由病原或植物信號(hào)因子誘導(dǎo)，經(jīng) 過(guò)一系列的反應(yīng)，植物b 1 ，3 一葡聚糖酶( 包括胞內(nèi)積累的堿性類(lèi)型和胞問(wèn)積累的酸性 類(lèi)型) 大量合成。b 1 ，3 一葡聚糖酶直接攻擊真菌絲上的葡聚糖，抑制真菌的生長(zhǎng)，同 時(shí)，水解中產(chǎn)生的寡糖作為植物h r 中的激發(fā)子，誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。 3 p 1 ，3 。葡聚糖酶基因的研究 人們對(duì)包括煙草、水稻和大豆等重要農(nóng)作物在內(nèi)的十幾種植物中的葡聚糖酶基洲 進(jìn)行了研究( 見(jiàn)表1 ) 。植物中的d 1 ，3 葡聚糖酶有堿性和酸性同工型【1 2 】。在健康植株 的種子發(fā)芽、下胚軸和胚芽鞘的生長(zhǎng)、韌皮部的傳輸調(diào)節(jié)和花器官的發(fā)育等過(guò)程中都 存在堿性b 1 ，3 葡聚糖酶i i ，其表達(dá)具有器官特異性。在幼嫩的莖葉中少量表達(dá)或小 表達(dá)，在衰老部位表達(dá)量較高【1 4 l ”。在植物的萼片中表達(dá)明顯，花瓣居中，在雄蕊和 一d 皮中檢測(cè)不到該酶的表達(dá)i l6 j 。堿性b 1 ，3 葡聚耱酶也可在煙草組培組織中積累l 6 j 。 對(duì)從不同植物中分離到的c d n a 克隆和基因組克隆的研究表明，d 1 ，3 葡聚糖酶的州 工酶在物理性質(zhì)、酶活性和細(xì)胞內(nèi)的位置各不相同。這些同工酶大體分為3 種1 2 “第 1 種為堿性同工酶，主要在植株的液泡中組成型表達(dá)并積累：第2 種是酸性同工酶 i f 常植株中不存在，但可由病原菌和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要在細(xì)胞間隙表達(dá)積祟。 這兩種類(lèi)型的酶由一個(gè)小的基因家族編碼，同一類(lèi)型基因之間的氨基酸序列同源性高 于不同類(lèi)型的。第3 種主要以煙草中細(xì)胞外表達(dá)的酸性p r q 和番茄中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 堿性8 一l ，3 葡聚糖酶為代表。第1 種與第2 、3 種分別有5 5 的氨基酸序列同源性 第2 、3 種之間的氨基酸序列同源性約在5 4 5 9 之間i i ”。 4 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因在植物抗真菌基n i 程中的應(yīng)用 d 一1 ，3 葡聚糖酶的抑菌活性引起人們的重視。迄今，d 一1 ，3 一葡聚糖酶基因已經(jīng) 轉(zhuǎn)入到煙草、獼猴桃和玫瑰等植物中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其抗性表現(xiàn)不盡一致，由 于幾丁質(zhì)酶和p 一1 ，3 一葡聚糖酶在體外的協(xié)同抑菌效果，更多的轉(zhuǎn)化研究則是將p 一1 ，3 一 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶共同導(dǎo)入受體植物基因組中( 見(jiàn)表2 ) 。j o n g e d i j k 等】將煙草的 c t a s s i 型b l ，3 - 葡聚糖酶基因和c l a s s i 型幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化番茄肘發(fā)現(xiàn)，二者有明顯 寰1 p - 1 3 - 葡聚一豆其基因在不圈擅中的研究狀況 ! ! ! ! ! ：壘堅(jiān)! ! ! 三苧! ! ! ! ! ! ! ! 璺z2 1 生! 圭g ! ! ! 1 2 1 蘭! ! 壘! 壘g ! ! 壁也p ! ! 翌主苧 植物鑒定或分離的酶的性質(zhì)誘導(dǎo)物與其他植物葡聚糖酶 參考文獻(xiàn) 基因個(gè)數(shù)的同源性 的協(xié)同表達(dá)效果，番茄發(fā)病率降低3 6 5 8 ，但基因表達(dá)時(shí)抗病能力沒(méi)有增強(qiáng)。同 樣，s e l a - b u u r l a g e 等1 4 5 在煙草d 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)化煙草的研究中，發(fā)現(xiàn)胞 間汁液對(duì)立枯病具有很強(qiáng)的抑制效果，而單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中的一個(gè)基因時(shí)，效果降低。對(duì) 于卵菌綱的真菌麗言，由于其菌絲壁不含幾丁質(zhì)，轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因沒(méi)有效果，導(dǎo)入 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因則更有意義。z h u 等【4 6 】在水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因r c h i o 和苜蓿酸 性b l ，3 葡聚糖酶基因4 g z 們轉(zhuǎn)化煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)雜交的方式將二者協(xié)同 表達(dá)可以明顯增強(qiáng)煙草對(duì)蛙眼病的抗性，而且其抗性與基因的拷貝相關(guān)，表現(xiàn)為 ( c h i t i n a s e 2 n + g l u c a n a s e 2 n ) ( c h i t i n a s e l n + g l u c a n a s e l n ) ，即二基因在純合狀態(tài)下的協(xié) 同表達(dá)效果更好，表現(xiàn)在發(fā)病期的延遲，病斑數(shù)和病斑面積的減小。轉(zhuǎn)基因植株不僅 對(duì)于煙草的蛙眼病抗性提高，同時(shí)對(duì)于葉斑病及苗期猝倒病同樣有抵抗效果?？梢?jiàn)。 p r 類(lèi)抗病基因協(xié)同表達(dá)可能是一種創(chuàng)建抗病新資源的有效方式。 寰21 3 - 1 8 - 囊i l l 一基園撫寞基園工曩研究 a d v a n c e 口nt h e5 t u d yo f 爭(zhēng)1 ，3 哩i n c 瑚口eg e n e si nc o n t r o lo f f u n g a ld i s e a s e s 植物外源基因 抗病效果 參考文獻(xiàn) 煙草煙草b 一1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( p h y t o n p h t h o r n p a r a s i t i c a 和p e r o n o s p o r at a b a c i n a l 獼猴桃大豆b - 1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( b o r n t i s c i n e r e a ) 攻瑰大麥b 一1 3 - 葡聚糖酶沒(méi)有效果( d i p l o c a r p o n r o s a e ) 煙草煙草b 一1 3 - 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶有抑制作用( f u s a r i u ms o a n i ) 煙草 苜蓿b 一1 3 - 葡聚糖酶和水稻幾丁質(zhì)酶癥狀減輕( c e r c o s p o r a n i c o t t a l l a e ) 番茄炳草b l ，3 一葡聚糖酶和幾丁質(zhì)癥狀減輕3 娟5 鼴 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p h ) v o p e r s i c i ) 煙草大麥b 一1 。3 - 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶癥狀減輕( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 旨蓿 苜蓿b 一1 3 - 葡黎藉酶和水稻凡丁質(zhì)酶抗性提高( p h y t o p h t h o r a m e g a s g e r m a ) 沒(méi)有效果( s t e m p h y l i u m 劬0 扣e ) 胡蘿h 煙草b 1 3 一葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶 油菜煙草b 一1 。3 - 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶 煙草煙草b l 。3 一葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶 抗性增強(qiáng)“l(fā) t e r n a r i ad a u c l ar a d i c i n a , c e r c o p o r ac a r o t a e , e r y s i p h eh e r a c l e o ( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r i u m ) 癥狀減輕( a l t e r n a r i a a l t e r n a t e ) 5 2 】 5 3 j f 5 4 3 p r 類(lèi)的8 1 ，3 一葡聚糖酶或組成型、或誘導(dǎo)型表達(dá)，在不同組織中有不同的表達(dá) 反應(yīng)，而且酶也被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的不同部位，對(duì)于抵御真菌病原的攻擊是具有積極意義 的。然而，迄今為止，沒(méi)有證據(jù)表明該酶在“病原寄主”的相互作用為“基因?qū)颉?模式，而更為可能的是，該酶參與的是一種對(duì)病原攻擊的廣泛的，非特異性的反應(yīng)。 由此可見(jiàn)，多種因素參與了植物對(duì)于病原攻擊的防御反應(yīng)，這些因素的協(xié)同表達(dá) 往往能增強(qiáng)寄主的抗病能力，不僅僅是葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，而且還有幾丁質(zhì)酶和核 糖體失活蛋白等等，因而多因素的改造將成為植物抗病育種的一個(gè)發(fā)展方向。 5 b 一1 ，3 一葡聚糖酶與其它防衛(wèi)蛋白的協(xié)同表達(dá) 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因可以在植物抗病反應(yīng)中獨(dú)立地發(fā)揮作用，但在植物整個(gè)抗病 系統(tǒng)反應(yīng)中，各種防衛(wèi)反應(yīng)往往表現(xiàn)出協(xié)同作用。 體外試驗(yàn)表明，6 1 ，3 葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶共同作用時(shí)能有效地抑制供試的1 8 種 真菌中的1 5 種。b o i l e rt 等( 1 9 8 3 ) 悼鄙報(bào)道，在幾丁質(zhì)酶與8 1 ，3 葡聚糖酶的協(xié)同作 用下對(duì)真菌細(xì)胞壁的降解作用增強(qiáng)。將c l a s si 幾丁質(zhì)酶和c l a s si1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶的基 因修飾后再轉(zhuǎn)入煙草，從轉(zhuǎn)入修飾過(guò)的基因的煙草胞外檢測(cè)出其產(chǎn)物，這兩種酶在體 外仍具抑菌活性，兩酶共存時(shí)有增效作用。這兩種酶在體外對(duì)鐮刀菌( f u s a r i u ms o l a n i ) 4 m 嗍 叫 等真菌也呈現(xiàn)了抑制活性。 b 1 ，3 葡聚糖酶或幾丁質(zhì)酶與核糖體失活蛋白也具有很強(qiáng)的協(xié)同作用。李明等 ( 1 9 9 9 ) 【56 j 將含有大麥核糖體失活蛋白( b r i p ) 編碼序列的質(zhì)粒p r c 2 4 b r i p 改造 后，依次與含有水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因r c h l 0 和水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因r a c 2 2 編碼 序列的質(zhì)粒p a b c 2 以及含有苜蓿b 一1 ，3 葡聚糖酶編碼序列的質(zhì)粒p a a g 8 9 連接，得 到了中間載體p r a s l 0 。p r a s l 0 再與根癌農(nóng)桿菌雙元載體p c a m b i a l 3 0 0 連接，得 到了合適水稻轉(zhuǎn)化的雙元載體p r a s l 3 0 0 ，并導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌l b a a 4 4 0 4 中。蔡應(yīng) 繁等( 2 0 0 0 ) t 5 7 5 8 j 構(gòu)建了來(lái)自大麥c d n a 克隆的b 1 ，3 葡聚糖酶基因等的植物表達(dá)載體， 通過(guò)基因槍法等導(dǎo)入棉花，已獲得轉(zhuǎn)基因棉株。 可見(jiàn)，8 1 ，3 葡聚糖酶是植物抗真菌病中重要的抗性物質(zhì)之一，而且作為植物內(nèi) 源蛋白的b 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，在轉(zhuǎn)基因植物的安全性方面更有其利用價(jià)值。 有的學(xué)者( m e i n s ，fj l l 9 9 3 ) 甚至預(yù)測(cè)，由病原微生物侵染誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的i 類(lèi)b 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的結(jié)合可能是潛在的體外殺真菌劑【5 9 l 。將其應(yīng)用于植物抗真菌 病基因工程中，外源b ! ，3 葡聚糖酶既可單獨(dú)地被導(dǎo)入植物發(fā)揮作用，又可與其它防 衛(wèi)蛋白一起轉(zhuǎn)入植物協(xié)同表達(dá)。 6 p l ，3 。葡聚糖酶基因的表達(dá)調(diào)控 不同類(lèi)型的b 1 ，3 葡聚糖酶具有不同的誘導(dǎo)調(diào)控形式，酸性1 3 - 1 ，3 一葡聚糖酶分泌 到細(xì)胞問(wèn)隙，其表達(dá)受病原菌攻擊、水楊酸和細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)，而對(duì)乙烯和傷害的 誘導(dǎo)不敏感。堿性類(lèi)型則在健康的植株根部和下部葉片中組成性表達(dá)。堿性6 1 ，3 葡 聚糖酶定位于液泡，受到病原侵染、乙烯和紫外輻射以及傷害的誘導(dǎo)，但受細(xì)胞分裂 素和生長(zhǎng)素的抑制i 矧，堿性b 1 ，3 ，葡聚糖酶一般對(duì)s a 的誘導(dǎo)不敏感【6 l 】。 從擬南芥中克隆的b g 4 和b g 5 則不受病原菌和水楊酸的誘導(dǎo)，植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期 間也不受階段發(fā)育調(diào)控和激素的誘導(dǎo)，但對(duì)于b g 4 ，子房的花柱和隔膜中表達(dá)量高， 該基因的表達(dá)與生殖過(guò)程有關(guān)1 6 2 1 。 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因的表達(dá)中。一些順式因子和反式因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮了重 要作用。在水楊酸應(yīng)答元件( a s l i c y l i c a c i d r e s p o n s e e l e m e n t ，s a r e ) 的研究中，s h a l l 等【6 3 】發(fā)現(xiàn)在p 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 2 d 的啟動(dòng)子序列中，一個(gè)2 5 b p 的順式元件對(duì)于 s a 的誘導(dǎo)具有重要作用，試驗(yàn)表明核內(nèi)存在反式因子與其特異結(jié)合m 】。大量研究表 明，水楊酸是植物抗病反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，s a 調(diào)控轉(zhuǎn)錄可能涉及到基因啟動(dòng)子 的多個(gè)區(qū)域。 煙草b 1 ，3 葡聚糖酶基因g l n 2 啟動(dòng)子區(qū)中存在乙烯應(yīng)答元4 鍛 e t h y l e n er e s p o n s e e l e m n e t ，e r e ) ，其核心序列為a g c c g c c ，又稱為a g c 盒【6 ”。e r e 結(jié)構(gòu)在許多病 原反應(yīng)基因的啟動(dòng)子中存在，與相應(yīng)的乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白( e t h y l e n er e s p o n s i v e e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，e r e b p ) 作用1 ”1 。 v a n d e r h e e 等州對(duì)煙草的研究表明酸性葡聚糖酶基因上游1 7 5 0 b p 序列含有多個(gè) 調(diào)控元件，而堿性葡聚糖酶基因啟動(dòng)子1 4 7 6 到“6 的區(qū)段是其器官特異表達(dá)和階段 發(fā)育調(diào)控以及侵染和其它脅迫處理誘導(dǎo)所必須的，啟動(dòng)子序列中含有若干個(gè)g c 元件 ( g g c g g c t c t t a ) n - - i 能與煙草堿性葡聚糖酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。 多項(xiàng)研究表明一個(gè)基因的上游序列中可以存在某種誘導(dǎo)因子的多個(gè)j ：陵式；：件，途 些順式元件之間的關(guān)系是極為復(fù)雜的。另一方面，即使在一個(gè)很小的區(qū)段，如2 5 b p 區(qū)段中，也可能存在緊密毗鄰的幾個(gè)元件，這給順式元件的鑒定帶來(lái)困難。反式因子 與順式因子之間的作用可能并不是真正專一性的，隨著外界環(huán)境條件的改變，這種特 異性也可能發(fā)生改變，就s a 而言，在b 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 4 的5 上有序列中就存 在多個(gè)反應(yīng)區(qū)段，而且調(diào)控s a 的過(guò)程中也可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止一兩種反式因子。 6 二、引言 一、j l 口 真菌病害一直是危害植物生長(zhǎng)、影響作物產(chǎn)量的主要病害，病發(fā)流行時(shí)損失巨大 一般年份的損失及化學(xué)農(nóng)藥防治造成的污染亦相當(dāng)嚴(yán)重。因此如何有效地防治真菌病 害一直是育種學(xué)家們努力攻克的難題。自栽培農(nóng)業(yè)以來(lái)，人類(lèi)采取了多種措施來(lái)防治 真菌病害，多數(shù)病害的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用和抗病育種，但傳統(tǒng)抗病育種 費(fèi)事費(fèi)力，而化學(xué)農(nóng)藥的使用易對(duì)環(huán)境造成污染，危害人類(lèi)、牲畜的健康。防治該類(lèi) 病害的根本措施是利用抗病品種，但由于病菌變異迅速，抗源缺乏及目前常規(guī)育種手 段繁雜，抗病品種遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了生產(chǎn)上的需要。所以，人們考慮應(yīng)用生物技術(shù)來(lái)防治 植物病害，解決上述難題。利用生物技術(shù)防治植物病害，主要涉及植物抗性基因和病 原菌無(wú)毒基因的分離和克隆、對(duì)病原菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶的抑制劑及抗菌蛋白的研 究。出于基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，利用動(dòng)物、植物和微生物的基因相互轉(zhuǎn)移，突破 了遠(yuǎn)緣雜交不親和性的困難，開(kāi)辟了作物抗病育種的新途徑。 植物基因工程是在分子水平上定向重組d n a 并導(dǎo)入植物細(xì)胞改造其遺傳特性 從而使作物的性狀得到改良，或者作為重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生產(chǎn)體系。基因克隆技術(shù)、 d n a 重組技術(shù)、分子雜交技術(shù)及基因表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)操作技術(shù)的發(fā)展為植物 蛙因工程奠定了基礎(chǔ)。 自1 9 8 3 年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，迄今通過(guò)基因工程技術(shù)已可以把不同來(lái)源 ( 包括動(dòng)物、植物和微生物) 的基因?qū)胫参锛?xì)胞并整合迸植物基因組中，獲得轉(zhuǎn) 基因植株。山于植物基因工程技術(shù)不僅不受物種之問(wèn)的生理障礙的限制?？梢猿浞掷?j j 不f 司種質(zhì)基因資源來(lái)改良農(nóng)作物，而且克服了傳統(tǒng)育種方法存在的培育新品種j 囂要 的時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程煩瑣，需要耗費(fèi)大量的人力和物力的局限性，因此基因工程技術(shù)已成 為改良植物性狀，培育優(yōu)良高產(chǎn)作物新品種的分子育種技術(shù)。 1 研究意義 茶樹(shù)病害與其它作物相比，在病原菌方面有如下特點(diǎn)：到目前為止，我國(guó)茶樹(shù)l 。 部和莖部幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病原物，也很少有病毒和類(lèi)病原體引起的病害，以真菌病 害最多。大量的病蟲(chóng)害嚴(yán)重影響了茶葉的質(zhì)量和產(chǎn)量，茶葉作為一種飲料，若以化學(xué) 方法防治茶樹(shù)病蟲(chóng)害，直接關(guān)系到人們的身體健康，所以茶葉的農(nóng)藥殘留量問(wèn)題已經(jīng) 越來(lái)越引起人們的普遍關(guān)注。長(zhǎng)期以來(lái)，茶葉工作者采用綜合防治等方法盡量減少農(nóng) 藥的使用量和農(nóng)藥殘留量，同時(shí)通過(guò)各種方法選育抗病蟲(chóng)的品種，但進(jìn)展不大，因此 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病蟲(chóng)品種已迫在眉睫【6 ”。到目前為止。已從許多不同植物分離 到6 1 ，3 一葡聚糖酶基因，而且毗煙草中p - l ，3 - 葡聚糖酶研究最透徹，但在木本植物中 關(guān)于b 一1 ，3 一葡聚糖酶的作用卻知之甚少。本研究對(duì)茶樹(shù)鮮時(shí)中具有廣譜抗真菌病害的 b i ，3 葡聚糖酶基因c d n a 進(jìn)行了克隆、序列的測(cè)定和酶活性檢測(cè)，旨在為開(kāi)展茶樹(shù) 抗真菌病害的基因工程研究及運(yùn)用生物技術(shù)培養(yǎng)茶樹(shù)良種打f 基礎(chǔ)。 2 技術(shù)路線和研究?jī)?nèi)容 2 1 技術(shù)路線 茶樹(shù)葉片總r n a 的提取和c d n a 的第一鏈合成 上 b - i ，3 一葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 擴(kuò)增 土 1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖酶c d n a 全序列的擴(kuò)增 構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入e c o l i 中 、l 表達(dá)蛋白檢測(cè)和酶活性鑒定 2 2 研究?jī)?nèi)容 2 21d l ，3 葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 反應(yīng)：根據(jù)已知3 一端的部分序列設(shè)計(jì)特異引 物，進(jìn)行5 - r a c e 反應(yīng)，擴(kuò)增5 - 端的序列。 2 2 2b l ，3 一葡聚糖酶c d n a 全序列的擴(kuò)增：根據(jù)已知3 端的部分序列和克隆得到的 5 - 端序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。 2 2 3 原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建：選用p e t 3 2 a 原核表達(dá)載體和b l 2lt r x b ( d e 3 ) 宿主菌， 將g l u 基因構(gòu)建入p e t 3 2 a 載體，轉(zhuǎn)化b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 菌株，經(jīng)i p t g 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。 2 2 4 表達(dá)蛋白檢測(cè)和酶活性鑒定：選用薄層層析法分析表達(dá)蛋白的酶活性。 ， 三、材料與方法 1 材料 鮮葉采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶業(yè)系教學(xué)茶園，品種為龍井4 3 4 c a m e h 脅s m e n s 擔(dān)( l ) 0 k u n t z e s 一芽二葉初展。 2 儀器與試劑 2 1 主要儀器設(shè)備 p c r 儀：b i o t r m e t r a - t g r a d i e n t 凝膠成像系統(tǒng)：上海天能( t a n n o ng i s 凝膠圖像處理系統(tǒng)) 電泳儀：北京六一儀器廠 超低溫冰箱：r 本s a n y o 高速冷凍離心機(jī)：b e c k m a nc o u l t e r 臺(tái)式離心機(jī)：上海安事科學(xué)儀器廠 制冰機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠 恒溫冷凍水循環(huán)儀：德國(guó)h u b e r 公司( p l o y s t a t ek 6 - 1 ) 電子天平：m e t i l e r1 o l e d o 公司 d h 計(jì)：m e t i l e rt o l e d o 公司 7 5 6 m c 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海第三儀器廠 超凈工作臺(tái)：上海浦東物理光學(xué)儀器廠 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京儀器廠 真空干燥箱：m e d c e n t e re i n r i c h n 州g e ng m b hv a c u c e l l 微量移液器：吉爾森數(shù)字可調(diào)式移液器和e p p e n d o f f 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司 2 。2 試劑 上海生工產(chǎn)品：d n am a r k e r 、t a qd n a 聚合酶，p c r 合成系統(tǒng)、g e le x t r a c t i o n k i t c l o n t e c h 公司產(chǎn)品：s m a r tr a c e e d n a a m p l i c a t i o nk i t ( 含t h ea d v a n t a g e2 p c r k i t 和n u c l e o t r a pg e le x t r a c t i o nk i t ) 、a d v a n t a g e g c2p c r k i t p h a m a c i a 公司產(chǎn)品：m r n a 提取純化試劑盒 9 t a k a r a 公司產(chǎn)品：曲i 、b a m h l 、p m d 1 8 - t 載體、t a q t md n a 聚合酶 p y r o b e s t t md n a 聚合酶、x - e c o t t 4 id i g e s tm a r k e r p r o m e g a 公司產(chǎn)品：1 4d n a 連接酶和m m l v 逆轉(zhuǎn)求酶 n o v a g e n 公司產(chǎn)品：菌株e c o l ib l 2 1 t r x b ( d e 3 ) i i 收達(dá)拔體p e t 一3 2 a ( + ) m b i 公司產(chǎn)品：d n am a r k e r 與蛋白質(zhì)m a r k e r 實(shí)驗(yàn)中所用引物的合成及p c r 產(chǎn)物的n y ：- ：作皆山上海 j - ；l l 合作寵成。 3 方法 3 1 茶鮮葉中r n a 的提取、檢測(cè)與e d n a 第一鏈的合成 3 1 1 總r n a 的抽提與檢測(cè)：參考文獻(xiàn) e 7 6 8 的方法，稍有修改 i ) 茶鮮葉( 一芽二葉初展) 放在研缽中，加入液態(tài)氮和玎i 溶性聚乙烯毗略炕酮 ( p v p p ) 磨成粉術(shù)，p v p p 設(shè)5 和1 0 ( w w ) 2 個(gè)處理。準(zhǔn)確稱取i 司樣重量的粉 末( 按粉術(shù)：鮮葉= l ：0 8 折算為4 5 0 m g 鮮葉) 分別放入冰上預(yù)冷的離心管中。 2 ) 每管加入o 9 m l 變性溶液( 含4 m o l l 異硫氰酸胍，2 5 m m o l l 檸檬酸鈉p h 7 0 0 5 十二烷基肌氨酸鈉，o 1 m o l l 2 - 巰基已醇) ，冰浴1 5 r a i n ，間歇緩慢攪動(dòng)。 3 1 4 c ，1 4 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n ，將上清液移至干凈的預(yù)冷的離心管中。 4 1 加入1 1 0 體積2 m o l ln a a c ，p h 4 0 ，等體積飽和酚( p h 3 5 ) ，1 5 體積氯仿 異戊醇( 4 9 ：1 ) ，顛倒l o 次，充分混勻，冰浴1 5 r a i n ，讓其靜止分層。 5 14 ，1 4 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n 。將上清液移至干凈的離心管中，加入等體積的異 丙醇，混勻后簧7 0 冷凍一個(gè)小時(shí)或2 0 冷凍2 小時(shí)以上，沉淀r n a 。 6 14 c ，1 3 0 0 0 9 離心2 0 m i n ，棄1 1 清。川2 5 0 p l 變性溶澉徹底溶解沉淀加入 等體積的異丙醇，混勻后置。7 0 冷凍3 0 分鐘或型長(zhǎng)時(shí)m ，沉淀r n a 。 7 14 c ，1 3 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n ，j f j1 m l7 5 乙醇淋沈( 即離心) r n a 沉淀2 次。 每次冰浴5 m i n ，4 c ，1 2 0 0 0 9 ，離心5 m i n 。 8 ) 除盡乙醇空氣中干燥沉淀。剛3 5