（微生物與生化藥學(xué)專業(yè)論文）共表達pdi提高ifnβhsa在畢赤酵母中表達的研究.pdf

摘要 摘要 b 干擾素( i f n l 3 ) 是干擾素家族中的一員，具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和免疫調(diào)節(jié) 作用。為了改善i f n 3 的體內(nèi)穩(wěn)定性，雷楗勇等構(gòu)建了d 干擾素與人血清白蛋白融合蛋 白( i f n 3 h s a ) 融合基因，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進行表達，得到了長效融合蛋白 i f n 3 h s a 。這種融合蛋白具有廣闊的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用前景。但是該菌株表達量較低， 為進一步提高i f n d h s a 的表達量，本文構(gòu)建雙重重組酵母，使其共表達具有分子伴侶 活性的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( p d i ) ，并分析產(chǎn)量差異。為進一步提高i f n1 3 h s a 定量分 析方法的靈敏度，本文對實驗條件進行優(yōu)化，并對新方法進行考核。 參照g e n b a n k 數(shù)據(jù)庫登記號為e u 8 0 5 8 0 7 的p d i 基因序列設(shè)計引物，以畢赤酵母基 因組為模板，采用p c r 方法，擴增p d i 基因。將其插入到克隆載體p m d l 9 t 中，構(gòu)建 重組質(zhì)粒p m d l 9 t - p d i ，進行測序。測序結(jié)果顯示克隆得到的p d i 基因與g e n b a n k 公 布的p d i 基因序列完全一致。將該基因插入畢赤酵母表達載體p p i c z a a 中，構(gòu)建重組 表達載體p p i c z a a p d i ，經(jīng)s a ci 線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母k m 7 1 p p i c 9 k i f n l 3 h s a ， 得到雙重表達p d i 和i f n1 3 h s a 的雙重重組子。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，共表達p d i 的菌 株較原始菌株目的蛋白i f n1 3 h s a 產(chǎn)量提高6 0 。 i f n f l h s a 雙抗體夾心e l i s a 檢測方法的優(yōu)化。將純化后的i f n l 3 一h s a 融合蛋白作 為抗原標準品，優(yōu)化緩沖體系、抗體工作濃度及實驗條件，建立了新的檢測方法。該方 法的靈敏度達到1 3 8 8n g m l ，線性檢測范圍2 1 0 1n g m l 6 7 2 5 0n g m l ，相關(guān)系數(shù) r 2 0 9 9 。經(jīng)方法學(xué)考核，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2 4 6 8 8 9 和2 7 9 9 7 4 ，發(fā)酵 液上清回收率為9 1 3 0 1 0 8 4 4 ，與i f nb 、h s a 基本無交叉反應(yīng)，健全性分析表明發(fā) 酵液及小鼠血清稀釋倍數(shù)對該方法無影響，穩(wěn)定性試驗顯示預(yù)包被酶標板可在4 下穩(wěn) 定保存3 個月以上。 本文研究結(jié)果表明共表達p d i 能夠提高i f n1 3 h s a 的產(chǎn)量，高產(chǎn)菌株的獲得，為 后續(xù)發(fā)酵及純化工藝研究提供方便。i f n l 3 h s a 雙抗體夾心e l i s a 檢測方法可用于發(fā)酵 過程中融合蛋白的檢測，可以有效檢測目的蛋白的含量，為發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供了必要 的數(shù)據(jù)支持，并為后期藥代動力學(xué)以及臨床研究提供了備選分析方法。 關(guān)鍵詞：畢赤酵母分子伴侶蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶i f n f l h s a e l i s a a b s t r a c t a b s t r a c t t h ei n t e r f e r o n ( i f n1 3 ) i sam e m b e ro ft h ep o t e n tm u l t i f u n c t i o n a lc y t o i k i n e sf a m i l y , w h i c hp o s s e s s e saw i d er a n g eo fa n t i v i r a l ，i m m u n o m o d u l a t o r ya n dg r o w t hi n h i b i t o r y p r o p e r t i e s t oi n c r e a s et h es t a b i l i t yo fi f n1 3i nv i v o ，l e ij i a n y o n gd e v e l o p e dal o n g a c t i n g i f n p ( i f n p h s a ) b ya l b u m i nf u s i o nt e c h n o l o g y t h ef u s i o ng e n ei f n l 3 一h s aw a se x p r e s s e d i np i c h i ap a s t o r i s t h ef u s i o np r o t e i ni f n d - h s ah a sb r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t si nt h ef u t u r e i no r d e rt oi n c r e a s et h es e c r e t i o no fi f n l 3 h s ai np i c h i ap a s t o r i s ，w ec o n s t r u c t e dt h ed o u b l e r e c o m b i n a n ty e a s ta n dm a d ei to v e r - e x p r e s sc h a p e r o np r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e ( p d i ) t h e y i e l dd i f f e r e n c e so ff u s i o np r o t e i nw e r ea n a l y z e d t oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo ft h es a n d w i c h e l i s am e t h o dw h i c hp u r i f i e df u s i o np r o t e i ni f n d h s a ，t h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e da n dt h en e wm e t h o dw a se x a m i n e d p c rt e c h n o l o g yw a se m p l o y e dt oa m p l i f yt h ep d ig e n e ，w i t hap a i ro fp r i m e r sd e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fp d ig e n ep r e s s e di ng e n b a n kw h i c ha c c e s s i o n n u m b e rw a se u 8 0 58 0 7a n dt h et e m p l a t ed n ae x t r a c t e df r o m 尸i c h i ap a s t o r 括n l ep d ig e n e r e c o v e r e df r o mp c rw a sc l o n e di n t op l a s m i dp m d19 ta n dt h e ns e q u e n c e d t 1 1 er e s u l t d e m o n s t r a t e dt h a tt h en u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fc l o n e dp d ig e n ew a si nc o r r e s p o n d e n c ew i t h p d ip r e s s e di ng e n b a n k ，n l ec o n f i r m e dg e n ew a si n s e r t e di ti n t o e x p r e s s i o nv e c t o r p p i c z a at oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c z a a p d i t h ee x p r e s s i o nv e c t o r p p i c z a a - p d il i n e a r i z e db ys a ci r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ew a st r a n s f o r m e di n t o 量m 1 71 p p i c 9 k i f n p - h s as t r a i no fp i c h i ap a s t o r i sb ye l e c t r o p o r a t i o n t h ey i e l do ff u s i o n p r o t e i ne x p r e s s e db yt h eb e s td o u b l er e c o m b i n a n ts t r a i nw a s6 0 h i g h e rt h a nt h ei n i t i a ls t r a i n s e c r e t e di nt h es h a k ef l a s k o p t i m i z a t i o no fd o u b l e a n t i b o d ys a n d w i c he l i s am e t h o d t h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i n i f n b h s aw a su s e da sa n t i g e ns t a n d a r do ft h ee l i s am e t h o d t h ea g e n t sa n de x p e r i m e n t c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da n dad o u b l e a n t i b o d ys a n d w i c he l i s am e t h o dt od e t e c ti f n1 3 一h s aq u a n t i t a t i v e l yw a ss e tu p t h es e n s i t i v i t yo ft h em e t h o di sl3 8 8n g m la n dt h e m e a s u r e m e n tr a n g ei s21 01n g m lt o6 7 2 5 0 n g m lw i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 彰 o 9 9 m e t h o d o l o g ye x a m i n a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ei n t r a - a n di n t e r - a s s a yc o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n w e r e2 4 6 , - - 8 8 9 a n d2 7 9 9 7 4 r e s p e c t i v e l y a 1 1o ft h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h em e t h o d h a sg o o ds t a b i l i t y e f f e c to fc o e x p r e s s i o np d ii np i c h i ap a s t e r i se x p r e s s e df o r e i g np r o t e i nw a sr e s e a r c h e d i nt h i st h e s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o e x p r e s s i o nc h a p e r o n e sc o u l di m p r o v et h ey i e l do f f u s i o np r o t e i ni f n l 3 h s aa n dt h i sc o n v e n i e n c e dt h er e s e a r c ho ff e r m e n t a i o na n dp u r i f i c a t i o n i nt h ef u t u r e d e t e c t i n gi f n d h s af u s i o np r o t e i nw i t ht h em e t h o dc a l le f f e c t i v e l yd e t e r m i n e t h ec o n t e n to ft a r g e tp r o t e i na n dp r o v i d es u p p o r tt oi m p r o v et h et e c h n i c a lp r o c e d u r e so ft h e f e r m e n t a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，a n di t g i v e sa no p t i o n a la n a l y t i cm e t h o di nt h ec o m i n g p h a r m a c o k i n e t i c sa n dc l i n i c a lr e s e a r c h k e y w o r d s ：p i c h i ap a s t o r i sc h a p e r o n e s p d i i f n p h s ae l i s a i i 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取 得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文 中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南 大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志 對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 簽名： 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定： 江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允 許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫 進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文， 并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽備壓雎 導(dǎo)師簽名：鑼爭 日 期：砑：型：之 w 1 1 寸y 礦 第一章緒論 第一章緒論 1 1b 干擾素與人血清白蛋白融合蛋白 1 1 1p 干擾素概況 干擾素( i n t e r f e r o n s ，i f n s ) 是一類具有廣譜抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在 不同途徑上影響細胞的代謝、生長和分化的細胞因子。自1 9 5 7 年被發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過近 半個世紀的基礎(chǔ)和臨床研究，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。迄今 為止，發(fā)現(xiàn)的人干擾素的類別有：干擾素q ，p ，6 ，丫，1 c ，九，t ，( z e t a ) l i m i t i n 等。研究較多、并用于臨床治療的有a ，b ，丫。從受體不同來分類，人干擾素有i ，i i 和i i i 型。i f n a ，i f n p 稱為i 型干擾素；i f n 和i f n t 等也屬于i 型；i f n 7 為i i 型干擾 素。干擾素九1 3 為m 型干擾素【l j 。 人b 干擾素( h u m a ni n t e r f o mp ，m f n l 3 ) 是由纖維細胞產(chǎn)生的糖蛋白，由1 6 6 個氨基 酸組成，在a s n 8 0 處存在n 糖基化，分子量2 0 2 3 k d a ，糖約占2 0 。在d n a 水平上 與干擾素a 有3 0 的同源性【2 ，3 】。在i f nb 蛋白中含有c y s l 7 、c y s 3 1 和c y s l 4 13 個c y s 殘基，其中c y s 3 1 。c y s l 4 1 形成的一對二硫鍵對其生物學(xué)活性的發(fā)揮是必需的1 4 , 5 1 。 k a r p u s a s 6 】等測定了2 2 a 分辨率下的i f n 3 晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示它具有典型的i 型干擾 素折疊方式，屬于長鏈螺旋細胞因子家族。美國f d a 已于1 9 9 3 年批準i f n d 用于治療 多發(fā)性硬化癥。亞洲的日本、新加坡、歐洲的意大利、西班牙等國家已批準i f nd 用于 多發(fā)性硬化癥、肝炎或其它病毒性感染的治療。 然而i f n l 3 作為小分子量多肽藥物，在體內(nèi)穩(wěn)定性方面存在一定的缺陷。干擾素進 入體內(nèi)后易被水解；分子量小于2 0k d a 的多肽因子在代謝過程中易被腎小球濾過；通 過腎小管時多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。為了達 到良好的治療效果，需要頻繁大劑量用藥，長期的頻繁注射不僅增加了病人的痛苦和治 療費用，而且易引發(fā)一系列嚴重的毒副作用。因此，開發(fā)優(yōu)良的藥物載體，改善小分子 量多肽藥物的藥學(xué)特性成為蛋白多肽類藥物二次研發(fā)的重要方向r 7 ，8 】。 1 1 21 3 干擾素與人血清白蛋白融合蛋白( i f n b h s a ) 人血清白蛋i 芻( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是人體血漿的主要成分，血液中含量最 高的蛋白( 達4 0 9 l ) ，無酶活性和免疫原性，人體相容性好，分子量大( 約為6 6 k d a ) ，半 衰期長達1 9d 。由于這些優(yōu)點，使白蛋白成為改善小分子量多肽藥物藥代動力學(xué)特性較 理想的藥物載體，并得到廣泛應(yīng)用。 本研究室雷楗勇博士利用基因融合技術(shù)，將i f n p 與h s a 基因融合，轉(zhuǎn)入畢赤酵母 表達系統(tǒng)中進行表達，得到了i f n d h s a 融合蛋白【9 1 。該蛋白分子結(jié)構(gòu)見圖1 1 。 i f n p h s a 融合蛋白增大了蛋白藥物的分子量，減少了異源蛋白的免疫原性，從而減少 腎小球濾過率和體內(nèi)清除率，在保持i f n p 生理特性的基礎(chǔ)上延長了其體內(nèi)的半衰期， 在藥學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。然而該重組菌表達i f n b h s a 的表達量不高，影響了 江南人學(xué)項十學(xué) 口論文 后期分離純化及藥代動力學(xué)等藥品臨床前研究的進程。囚此，提高i f n p - h s a 在畢赤酵 母中的表達量成為亟待解決的問題。 一 u e n e l l c u s 【o n _ _ 旺旺e 墨田固匝宙 i n t e r f e r o n0 圖1 1i f nb h s a 模擬結(jié)構(gòu) f i g i - 1t h es i m u l a t es h u c t u r eo f i f nb - h s ap r o t e i n 1 2 畢赤酵母表達系統(tǒng) 12 i 畢赤酵母概況 巴斯德畢赤酵母( p i e h i a p a s t o r 捃) 是近年發(fā)展起來的最成功的外源蛋白真核表達系統(tǒng) 之，迄今為止，已有5 0 0 多種外源蛋白在此體系中成功表達【i n “j 。pp a s t o r i s n y 以以甲 酵作為唯一的碳源和能源，甲醇能夠迅速誘導(dǎo)其合成大量的醇氧化酶州o x ) 。醇氧化酶 有兩個編碼基因州o x i 、a o x 2 ) ，a o x i 基因嚴格受到甲醇的誘導(dǎo)和調(diào)控，在酵母細胞 中a o x i 基因表達產(chǎn)生醇氧化酶的比例- 寸9 0 而a o x 2 產(chǎn)生酵氧化酶的比例小于1 0 l l ”。 根據(jù)對甲醇利用的情況，pp a s t o r i s 宿土菌可劃分為3 種表型。多數(shù)菌株含有a o x i 和 a o x 2 基囚，在古甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似的稱為甲醇利用快型( m u t + ) ，如 g s l l 5 ( h i s 4 ) ；只含有a o x 2 基因的甲醇利用慢表型( m u t 。) ，如k m t l ( h i s 4a r 9 4 a o x l a ：a r g 4 ) ；當(dāng)a o 基因全部缺失時，則不能利用甲醇稱為甲醇利用負表型( m u t 。) ， 如m c l 0 0 3 ( h i s 4a r 酊a o x l a ：s a r g 4a o x 2 a ：p h i s 4 ) 。通常m u t + 型比m u t 5 能獲得更高的外 源蛋白產(chǎn)量。 近年柬，義開發(fā)出了新的外源基因啟動子。如三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子 儼g a p l ，改啟動子不需甲醇誘導(dǎo)，避免了發(fā)酵后甲醇殘留問題，發(fā)酵工藝吏簡單，且產(chǎn) 量較高成為目前最潛力的能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)p a o x i 的啟動子”；甲醛脫氫酶1 基因的啟動 子( p f l d i ) 能單獨被甲醇為單一碳源( 硫酸銨為氫源) 或甲胺為單一氮源( 葡萄糖為碳源) 強烈誘導(dǎo)其受甲醇或甲胺的誘導(dǎo)具有與p a o x i 啟動子表迭水平相當(dāng)?shù)墓δ?，f l d i 啟 動子被甲醇誘導(dǎo)的水平取決于使用的氮游，用甲醇和甲胺起誘導(dǎo)比片j 甲醇和硫酸錢誘 導(dǎo)表達水平更高1 1 4 ：5 1 異檸檬酸酶基因l 的啟動予( p i c l l ) ，p 1 c l l 受乙醇誘導(dǎo)，在乙醇 的誘導(dǎo)下，p i c l i 能夠成功地調(diào)控e p a s t o r i s ”。 第一章緒論 1 2 2 畢赤酵母表達載體 畢赤酵母表達載體通常為整合型載體，穿梭質(zhì)粒，一般包含強有力的啟動子如醇氧 化酶1 似o x l ) ，基因組氨醇脫氫酶基因( h i s 4 ) 選擇標記和a m p 抗性基因。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn) 化受體時，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在啟動子控制 下表達。常見的胞內(nèi)表達載體有p p i c 3 、p p h w 0 1 0 、p p i c 3 5 、p a 0 8 1 5 、p p i c z 、p g a p z 等；分泌型表達載體有p p h i l s i p 、p g a p z a 、p p i c 9 、p p i c z a 、p p i c 9 k 等i i 。 實驗室較常用到的p p i c 9 k 質(zhì)粒，具有高效的分泌信號肽旺交配因子，能引導(dǎo)外源蛋 白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進而被分泌到胞外。并能夠通過g 4 1 8 抗性來篩選高拷貝重組子，進而得到 更高的表達量；新一代的畢赤酵母分泌表達質(zhì)粒p p i c z a a 質(zhì)粒，還擁有一個特點是其具 有z e o c i n 抗性標記基因，給篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來很大的便利。重組轉(zhuǎn)化子可直接用 z e o c i n 進行篩選，即在y p d z 平板上生長的轉(zhuǎn)化子中，1 0 0 都有外源基因的整合，大大 簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程。另# b z e o e i n 抗性也同g 4 1 8 抗性一樣可以通過濃度梯度 來篩選高拷貝重組子。 1 2 3 提高外源蛋白表達的策略 ( 1 ) 外源基因的特性。外源蛋白表達量的高低很大程度上取決于外源基因自身的特 點。外源基因的密碼子也會在翻譯水平影響基因的表達，選用酵母偏好型密碼子，有助 于提高表達量；另外，外源基因的a t 含量也直接影響其整合表達。 ( 2 ) 選擇合適的載體和宿主。外源蛋白的表達還受宿主特性的影響。而對于分泌型表 達，m u t + 和m u t 都可使用。當(dāng)進行高密度發(fā)酵時，一般采用m u t + ，因為與m u t 相比， 其生長更快，能更有效地提高外源蛋白的表達型2 5 j 。 ( 3 ) 篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。一般情況下，外源基因整合后的拷貝數(shù)愈高，蛋白表達量愈 高?？梢圆捎迷隗w外載體上多次插入目的基因片段，或?qū)⑤d體中目的基因兩端連上非必 需高重復(fù)基因片段，重復(fù)多次轉(zhuǎn)化等方法，實現(xiàn)目的基因的高拷貝整合。 ( 4 ) 發(fā)酵條件優(yōu)化。發(fā)酵條件是影響外源蛋自在p p a s t o r i s 中表達的另一重要因素。 主要包括培養(yǎng)基的組成成分與配比、溫度、p h 、甲醇含量和發(fā)酵過程中的溶氧，培養(yǎng)時 間等。外源蛋白在尸p a s t o r i s 中的表達需要充足的通氣量，并且培養(yǎng)溫度不應(yīng)超過3 0 ， 而超過3 2 c 蛋白的表達將會停止。一般情況下，適當(dāng)提高作為誘導(dǎo)物的甲醇含量會提高 外源蛋白的表達量，但過量的甲醇會對重組菌產(chǎn)生毒害。誘導(dǎo)時間過短，外源蛋白難以 充分表達，但誘導(dǎo)時間過長又會由于宿主菌分泌蛋白酶，造成外源蛋白的降解增加，為 后期的分離純化帶來麻煩。 ( 5 ) 提高酵母分泌途徑的分泌效率。有研究表明，當(dāng)?shù)鞍状罅勘磉_時，酵母分泌途徑 的超載，可能是蛋白表達量達到閡值的原因之一【2 6 捌。使酵母過量表達分子伴侶，提高 酵母分泌效率能改善這一狀況【2 8 捌。該領(lǐng)域日益成為研究的熱點，而國內(nèi)的相關(guān)報道較 少。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 3 提高酵母分泌外源蛋白的效率 1 3 1 酵母蛋白分泌途徑i 馴 ( 1 ) 翻譯共轉(zhuǎn)移途徑。該途徑是一條目前研究較為透徹的分泌途徑。當(dāng)核糖體將外源 蛋白的n 端信號肽合成出來，信號識別蛋白就立即與信號肽結(jié)合，核糖體的翻譯過程也 就暫時停止；然后，信號識別蛋白牽引著核糖體及新生肽，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的信號肽識別蛋 白受體相結(jié)合；再由信號肽識別蛋白受體引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜通道( s e c 6 1 復(fù)合體) ， 隨后翻譯過程被重新啟動，新生肽就由此通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；進而新生肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分 子伴侶b i p 和p d i 等的輔助下形成正確構(gòu)象；再經(jīng)過高爾基體的進一步修飾，運輸?shù)教?定的位置。 ( 2 ) 翻譯后轉(zhuǎn)移途徑。除了依賴信號肽識別蛋白的翻譯共轉(zhuǎn)移途徑外，酵母還存在另 外的分泌途徑翻譯后轉(zhuǎn)移途徑。首先，細胞質(zhì)中的核糖體對外源蛋白的翻譯過程完 成后，再由外源蛋白n 端的信號肽牽引下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的識別受體( s e c 6 1 復(fù)合體和 s e c 6 2 6 3 復(fù)合體) 結(jié)合進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶b i p 和p d i 等的輔助下 形成正確的構(gòu)象。在這條途徑中，新生肽首先在細胞質(zhì)中翻譯完成，形成一定的中間構(gòu) 象。雖然不一定形成正確的活性形式，但是也需要細胞質(zhì)中的分子伴侶的輔助，這可以 避免蛋白質(zhì)分子中的疏水基團相互靠近形成聚體。蛋白一旦形成聚體就不能在信號肽的 引導(dǎo)下進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而是在細胞質(zhì)中就被降解掉。而目前在酵母表達系統(tǒng)中應(yīng)用最廣的 信號肽是a 交配因子( a m a t ef a c t o r ) ，此信號肽傾向于利用翻譯后轉(zhuǎn)移途徑，這也就為我 們研究提高外源蛋白的表達量提供了一個靶點。 目前，酵母由于其高表達、高穩(wěn)定和高分泌的特性，已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于外源 蛋白的表達。但是對于一些外源蛋白，特別是一些人源性的細胞因子，用酵母系統(tǒng)的表 達量不理想。外源蛋白的合成首先是通過核糖體的翻譯完成的，多肽鏈在核糖體中合成 出來，就面臨著從復(fù)雜擁擠的胞內(nèi)環(huán)境中找到自己的位置以及正確折疊的任務(wù)。細胞內(nèi) 大量的蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)間高度擁擠也可能是阻礙有效折疊的另一個因素。體外 復(fù)性研究表明，合成的新生蛋白質(zhì)若能迅速正確折疊，則會顯著降低集聚發(fā)生的頻率。 新生的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊成熟是蛋白分泌表達的限速步驟之一。未正確折疊的蛋白 被禁止離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或被降解清除甚至形成沉淀，因此外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的有效折疊和 整合一定程度上影響了外源蛋白的總產(chǎn)率【3 。研究表明，增加分子伴侶的量可以有效地 幫助新生肽的折疊，提高外源蛋白的表達量。s m i t h 掣3 2 】在研究葡萄糖苷酶在釀酒酵母 中的表達中發(fā)現(xiàn)，利用基因工程手段增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶b i p 和p d i 的量，可以將 葡萄糖苷酶表達量提高。 1 3 2 分子伴侶 ( 1 ) 分子伴侶的生物學(xué)特性。 1 9 7 8 年，l a s k e y 等發(fā)現(xiàn)d n a 和組蛋白在體外生理離子強度下重組時，必須有一種 細胞核內(nèi)的酸性蛋白核質(zhì)素( n u c l e o p l s m i n ) 存在，二者才能組裝成核小體，否則就會生 成沉淀，他給幫助核小體組裝的酸性蛋白起名為“m o l e c u l ac h a p e r o n e ”，即分子伴侶。分 4 第一章緒論 子伴侶的概念經(jīng)過幾度修正，1 9 9 3 年，e l l i s t 3 3 1 對分子伴侶做了更為確切的定義：即分子 伴侶是一類相互之間有關(guān)系的蛋白，它們的功能是幫助其他含多肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在體內(nèi)進 行正確的非共價的組裝，并且不是組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物功能時的組成部 分。就是說分子伴侶可介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確的折疊與裝配，但并不構(gòu)成被介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的組 成部分。 目前已發(fā)現(xiàn)的分子伴侶主要分以下三類。傳統(tǒng)意義上的分子伴侶：根據(jù)分子量大小 分為h s p 2 8 家族，h s p 4 0 家族，h s p 7 0 家族，h s p 9 0 家族等；分子內(nèi)分子伴侶：含前導(dǎo) 肽( p r o 肽) 的前體形式合成的蛋白質(zhì)，如枯草桿菌素a 水解蛋白酶，羧肽酶y 以及米根 霉菌的脂酶等，只有在p r o 肽存在的情況下，能形成具有活性的酶。因此，p r o 肽能夠 輔助蛋白質(zhì)的折疊和成熟，具有與分子伴侶類似的功能。與一般的分子伴侶相比，這類 分子內(nèi)分子伴侶具有高度的專一性；有酶活力的分子伴侶：折疊酶也可以幫助蛋白質(zhì)折 疊，這類酶催化與蛋白質(zhì)折疊直接有關(guān)的、對形成功能構(gòu)象所必需的共價鍵變化。如蛋 白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( p d i ) ，它催化蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的形成；肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶 ( p p i ) ，它催化蛋白質(zhì)分子中某些穩(wěn)定的反式肽基脯氨酰鍵，異構(gòu)成為功能蛋白所必需的 順式構(gòu)型p 4 。3 7 1 。 ( 2 ) 分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊成熟中的作用。 在新生肽鏈一邊合成一邊折疊的過程中，或在變性蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，會形成一些 折疊中間體。這些折疊中間體有可能形成錯誤的瞬間結(jié)構(gòu)，它們常有一些疏水性的表面， 這些錯誤的表面之間就有可能發(fā)生相互作用而形成沒有活性的分子，甚至造成分子的聚 集和沉淀。這個折疊的過程是折疊中間體的正確途徑與錯誤途徑相互競爭的過程。分子 伴侶的功能就是提高蛋白質(zhì)的合成效率，幫助正確途徑的競爭機制。分子伴侶可以結(jié)合 在折疊中的多肽上，幫助其進入正確的折疊途徑；也可以結(jié)合到錯誤折疊的蛋白質(zhì)上， 促進其解折疊，使多肽鏈回到有效折疊的途徑上來。 分子內(nèi)分子伴 呂( i m c ) p r o 肽輔助蛋白質(zhì)折疊是一種普遍存在的折疊機制。研究表 明，i m c 在蛋白質(zhì)折疊過程中起降低過渡狀態(tài)活化能的作用，從而使折疊反應(yīng)容易完成。 s h i n d e 等在研究中發(fā)現(xiàn)突變型p r o 肽和野生型p r o 肽在幫助同樣的枯草桿菌蛋白酶體外 折疊時，折疊后成熟的蛋白酶具有不同的二級結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出不同的酶學(xué)特性、熱穩(wěn)定 性和底物特性。這說明作為i m c 在輔助蛋白質(zhì)折疊的過程中起類似模板的作用。蛋白 質(zhì)在體外折疊時，如果沒有p r o 肽，蛋白質(zhì)會折疊形成熔球態(tài)的中間體，當(dāng)加入p r o 肽 后，中間體迅速折疊成有活性的酶，這說明p r o 肽可能只在折疊反應(yīng)的后期階段起分子 伴侶的作用。 1 3 3 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( p d i ) 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( p r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e ，p d i ，e c 5 3 4 1 ) 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種重 要的折疊催化劑，它既能通過其氧化活性催化蛋白形成二硫鍵并能發(fā)揮其還原活性去除 二硫鍵，也能發(fā)揮異構(gòu)酶活性催化錯誤配對二硫鍵的重排，同時它還具有抑制錯誤折疊 蛋白聚集的分子伴侶活性【3 8 , 3 9 】。 研究表明，酵母細胞表達外源蛋白分泌產(chǎn)率與p d i 及二硫鍵形成有很大的相關(guān)性。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 酵母中p d i 的過量表達能大幅度的提高外源蛋白的表達水平，尤其是含較多二硫鍵的蛋 白，這表明了解和操縱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二硫鍵形成途徑在提高外源基因表達方面有極大的應(yīng)用 潛力。 p d i 應(yīng)用于基因工程提高外源蛋白表達水平已有很多成功實例。張偉等【4 0 】在巴斯 德畢赤酵母中共表達p d i ，使外源蛋白可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體( s t r a i l ) 產(chǎn) 量明顯提高；r o b i n s o n 等【4 l j 研究發(fā)現(xiàn)過量表達p d i 可以使人血小板導(dǎo)出生長因子b 二 聚體在釀酒酵母中的分泌量提高l o 倍；m o r a l e j o 等【4 2 】的研究表明甜蛋白分泌表達量與 p d i 基因的表達水平存在相關(guān)性，p d i 表達水平提高2 4 倍，甜蛋白產(chǎn)量提高5 倍；i n a n 等【4 3 】發(fā)現(xiàn)共表達p d i 能使n a - s p l 在畢赤酵母中的表達量顯著提高。 1 4 立題背景及研究內(nèi)容 1 4 1 立題背景及目的 為了改善h i f n p 分子量小，易被腎小球濾過，半衰期短等缺陷，本研究室利用基因 融合技術(shù)將i f n l 3 與h s a 基因融合，并成功在畢赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ，k m 7 1 ) 中表達， 經(jīng)檢測融合蛋白i f n l 3 h s a 分子量約為9 0k d a ，具有h s a 及i f n d 抗原性。該融合蛋白 保留了i f n l 3 的生物學(xué)活性，同時提高了藥物蛋白的分子量，從而延長蛋白藥物的半衰 期，降低用藥劑量及用藥頻率，改善了蛋白藥物的藥學(xué)性質(zhì)，提高患者的耐受性，具有 良好的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用前景。但是其表達量不高，為后期的蛋白分離純化帶來很大的限 制，影響了i f n l 3 h s a 做為藥品的臨床前研究進程。 很多研究表明，當(dāng)外源蛋白大量表達時，酵母分泌途徑的超載導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工具酶量 的減少，造成蛋白錯誤的裝配折疊，這是蛋白表達量達到瓶頸的原因之一。而在酵母中 共表達能夠輔助蛋白質(zhì)正確折疊裝配的分子伴侶能改善這一狀況。因此，我們選擇了被 廣泛用于酵母輔助表達的p d i 來初步探索分子伴侶對i f n p h s a 表達效率的影響，期望 表達量能夠進一步提高。 另外，將對i f n l 3 h s a 融合蛋白的微量分析檢測進行優(yōu)化，為后續(xù)的發(fā)酵工藝，蛋 白分離純化及藥代動力學(xué)研究做準備。 1 4 2 研究內(nèi)容 本論文主要研究內(nèi)容是從畢赤酵母基因組d n a 中克隆p d i 基因；將p d i 基因插入 到表達載體p p i c z a a 中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母k m 7 1 p p i c 9 k i f n d h s a ；利用z e o c i n 抗性篩 選高拷貝整合重組子，并對這些重組子誘導(dǎo)表達，進一步篩選i f n p h s a 表達量相對較 高的重組畢赤酵母；優(yōu)化建立i f n l 3 h s a 的檢測方法，提高靈敏度，降低定量限，并對 其進行方法學(xué)考核，完善健全性數(shù)據(jù)。具體研究分為以下幾部分： ( 1 ) p d i 基因的克隆及表達載體p p i c z a a p d i 的構(gòu)建 ( 2 ) x 2 重重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及p d i 對i f n 3 h s a 產(chǎn)量影響 ( 3 ) 融合蛋白i f n i b h s a 酶聯(lián)免疫分析方法的優(yōu)化建立及考核 6 第二章p d i 基因的克隆及表選載體p p i c z aa - p d i 的構(gòu)建 第- - 章p d i 基因的克隆及表達載體p p i c z a a - p d i 的構(gòu)建 半胱氨酸( c y s t e i n e ，c y s ) 壩i 鏈巰基( 一s h ) 共價交聯(lián)形成的二硫鍵，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折 疊構(gòu)象起著關(guān)鍵的作用，二硫鍵的正確形成是許多蛋白折疊途徑中的限速步驟j 。在蛋 白折疊早期二硫鍵的形成足經(jīng)常發(fā)生錯誤的，錯誤的空間構(gòu)象抑制進一步的折疊，進 而影響蛋白質(zhì)形成的效率。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶( p d i ) 是一種分子量5 7 k d a 的蛋白質(zhì)，它催化蛋白形成二硫鍵( 氧化活性) 和催化錯誤配對二硫鍵的重排( 異構(gòu)酶活 性) ，并具有分子伴侶活性。雖然p d i 是組成型表達的蛋白質(zhì)，但當(dāng)外源蛋白過量表達 時，會引起該工具酶的相對減少，使外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生擁堵，導(dǎo)致蛋白形成錯誤 的空間構(gòu)象。而構(gòu)象錯誤的蛋白會被分解，無法分泌到細胞外，使得外源蛋白表達量產(chǎn) 生瓶頸。研究表明，過量表達p d i 能改善這一現(xiàn)象，在中國倉鼠卵巢細胞( c l i o ) ，大腸 埃希氏桿菌慨c o l i ) ，巴斯德畢喬酵母僻p a s t o r i s ) 等多個不同的表達系統(tǒng)中共表達p d i 均 能提高外源蛋白的分泌量1 4 5 1 。因此，我們克隆了畢赤酵母本身的p d i 基因，構(gòu)建畢赤酵 母表達質(zhì)粒p p i c z t la - p d i ，為基凼工程菌過量表達p d i 做準備。 2 1 材料 2 1 1 菌種、質(zhì)粒 大腸桿菌宿主菌株為e s c h e r i c h i a c o l ij m l 0 9 ，本實驗室保存；克隆載體p m d l 9 一t ， 用于p d i 的克隆，購于大連寶生物工程公司。畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒p p i c z c t - a ，用 于p d i 基因的表達，其物理圖譜見圖2 一1 圖2 - 1 表達載體p p i c z o a 結(jié)構(gòu)示意圖 f i g2 - 1t h ep h y s i c a l m a p o f p l a _ s m i dp p i c z a a 2 1 2 培養(yǎng)基 l b 培養(yǎng)基( 1l ) ：胰蛋白胨1 0 9 酵母提取物5g ，氧化鈉1 0g ，p h7 0 。需要時使 用前加入1 0 0g g m l a m p ，固體培養(yǎng)基添加15 瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。 l l b 培養(yǎng)基( 1 l ) ：胰蛋白胨1 0g ，酵母提取物5g ，氯化鈉5g ，p h7 0 。需要時使 用前加入2 5l _ t g m lz e o c i n ，固體培養(yǎng)基添加15 瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。 s o c 培養(yǎng)基( 1l ) ：胰蛋白胨2 0g ，酵母提取物5g ，氯化鈉1 0 m m o l l ，氯化鉀25 m m o l l ，氯化鎂1 0n l m o i l ，硫酸鎂2 0n u n o l l ，葡萄糖2 0m m o i l ，p h7 0 。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 1 3 工具酶 d n a 聚合酶高保真酶p f u ，t a qp o l y m e r a s e ，限制性內(nèi)切酶s a c i ，t 4 連接酶購自 上海生工生物工程服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶e c o r i ，限制性內(nèi)切酶b s p t l 0 4 i ，購白 大連寶生物工程公司。 2 1 4 試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒，d n a 片段快速膠回收試劑盒，高效感受態(tài)細胞制備試劑盒， 異丙基一p d 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y l - d d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ，i p t g ) 、5 一溴- 4 一氯- 3 一吲哚 - p - d 一半乳糖苷( b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 i n d o l y l - d - d - g a l a c t o s i d e ，x g a l ) 購自上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司；抗生素z e o c i n ( 1m g m l ) 購自美國i n v i t r o g e n 公司。 酵母基因組d n a 提取試劑： 酚氯仿異戊醇：2 4 ：2 5 ：1 s t e s 緩沖液 o 2m o l lt r i s - c i ( p h7 6 ) 0 5m o l ln a c l o 1 ( m v 1s d s 0 0 1m o l le d t a 室溫保存 2 1 5 主要儀器 d y y - 1 l 型電腦三恒多用電泳儀 d k 8 d 電熱恒溫水槽 高速臺式離心機t g l 1 6 b 低速度離心機t g l 一5 p c r 儀p t c l 0 0 恒溫搖床 凝膠成像系統(tǒng) 2 2 方法 2 2 1 酵母基因組d n a 的提取 北京六一儀器廠 上海躍進醫(yī)療器械廠 上海安亭科學(xué)儀器廠 上海安亭科學(xué)儀器廠 美國m j 公司 江蘇太倉試驗設(shè)備廠產(chǎn)品 s y n g e n e 公司產(chǎn)品 ( 1 ) 從y p d 平板上挑取畢赤酵母菌落接種至5m ly p d 培養(yǎng)基中，于3 0 c ，2 2 0r m i n 振 搖培養(yǎng)過夜。 ( 2 ) 取1 5m l 過夜培養(yǎng)的酵母細胞轉(zhuǎn)移至1 5m le p 管中，1 2 0 0 0r m i n 離心5m i n ，收集 沉淀。 ( 3 ) 棄上清，加入1m l 超純水重懸細胞，1 2 0 0 0r m i n 離心1m i n ，棄上清，在渦旋混合 器上快速振蕩以分散菌體沉淀。 ( 4 ) 將細胞重懸于1 0 0 止s t e s 緩沖液中，加入1 0 0l a l 酚氯仿異戊醇，振蕩1m i n ，使 有機相和水相充分混合。 8 第二章p d i 基因的克隆及表達載體p p i c z aa - p d i 的構(gòu)建 ( 5 ) 于1 5 0 0 0r m i n 離心5r a i n ，將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的e p 管中，加入兩倍體積的乙 醇，顛倒混勻。 ( 6 ) 于1 5 0 0 0r m i n 離心1 0 m i n ，收集核酸沉淀。 ( 7 ) 棄上清，用2 0 0 肛l7 0 乙醇洗滌沉淀兩次，于1 5 0 0 0r m i n