第三代測序技術(shù)（單分子實時DNA測序）與第二代測序技術(shù)（高通量測序技術(shù)）簡介

1 第三代測序技術(shù)（單分子實時 DNA測序）與第二代測序技術(shù)（高通量測序技術(shù)） 簡介 第三代測序技術(shù)簡介 如果有人告訴你用顯微鏡實時觀測單分子 DNA 聚合酶復(fù)制 DNA，并用它來測序，你一定會認(rèn)為他異想天開，沒有一點生物的 sense。 我最初就是這樣認(rèn)為的，然而它不僅可以實現(xiàn)，而且已經(jīng)實現(xiàn)了！這個就是被稱為第三代的測序技術(shù)， Pacific Biosciences公司推出的 “Single Molecule Real Time (SMRT) DNA Sequencing”（單分子實時 DNA測序）。 我有幸在 NIH聽到 了這個技術(shù)發(fā)明人 Stephen Turner博士的講座，根據(jù)自己粗淺的理解記錄整理一下。 要實現(xiàn)單分子實時測序，有三個關(guān)鍵的技術(shù)。 第一個是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實時看到 “單分子 ”。但是它可以實時記錄熒光的強度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在 DNA鏈上探測到。當(dāng)它與 DNA鏈形成化學(xué)鍵的時候，它的熒光基團就被 DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響 DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的 DNA鏈和天然的 DNA鏈完全一 樣。 第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄 DNA鏈上的熒光的時候， DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。 Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔 zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的 DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)， DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于 A， T， C， G 這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定 的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到 DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團被 DNA聚合酶切除為止（見圖）。 2 第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進行記 錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而 Pacific Biosciences公司又沒有非常強調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進一步探討。 他們還對這一技術(shù)進行進一步的優(yōu)化。 第一個是把雙鏈 DNA 環(huán)化反復(fù)測序。人們可以在雙鏈 DNA 的兩頭連上發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 DNA adaptor，從而使 DNA環(huán)化。而 DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的 DNA作為模板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測一段 DNA序列。這種反復(fù)測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯誤，從而使測序精度非常高。 第二個是激發(fā)光中斷測序法。 DNA 聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強大的激發(fā)光作用下酶也是有一定壽命的。 如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內(nèi) DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制 DNA，當(dāng)激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長 DNA鏈后面的序列。 第三代測序技術(shù)非?？膳?。 1、它實現(xiàn)了 DNA 聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測 10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的 2萬倍。 2、它實現(xiàn)了 DNA聚合酶內(nèi)在自身的 processivity（延續(xù)性，也就是 DNA聚合酶一次可以合成很長的片 3 段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。 3、它的 精度非常高，達到 99.9999%。 此外，它還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的。 第一個是直接測 RNA的序列。既然 DNA聚合酶能夠?qū)崟r觀測，那么以 RNA為模板復(fù)制 DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。 RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。 第二個是直接測甲基化的 DNA序列。實際上 DNA聚合酶復(fù)制 A、 T、 C、 G的速度是不一樣的。正常的 C 或者甲基化的 C 為模板， DNA聚合酶停頓的時間不同。根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的 C 是否甲基化。 Pacific Biosciences公司預(yù)計 2010年或者 2011年就 會推出商業(yè)化的測序儀器。在不遠(yuǎn)的將來，如果他們能和二代測序一樣集成 100萬個納米微孔，那么一臺儀器15 分鐘就能夠準(zhǔn)確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序成本將變成 100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資 30億美元，費時十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大?。?高通量測序技術(shù) 第二代測序技術(shù) 高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù) (next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序 (deep sequencing)。 自從 2005年 454 Life Sciences公司（ 2007年該公司被 Roche正式收購）推出了454 FLX 焦磷酸測序平臺（ 454 FLX pyrosequencing platform）以來，曾推出過 4 3730xl DNA 測序儀（ 3730xl DNA Analyzer）的 Applied BioSystem（ ABI）這家一直占據(jù)著測序市場最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開始動搖了，因為他們的拳頭產(chǎn) 品 毛 細(xì) 管 陣 列 電 泳 測 序 儀 系 列（ series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個強有力的競爭對手，一個就是羅氏公司 (Roche)的 454 測序儀 (Roch GS FLX sequencer)，另一個就是 2006 年美國 Illumina 公司推出的 Solexa 基因組分析平臺（ Genome Analyzer platform），為此， 2007年 ABI公司推出了自主研發(fā)的 SOLiD 測序儀 (ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平臺即為目前高通量測序平臺的代表。（見表一） 公司名稱 技術(shù)原理 技術(shù)開發(fā)者 商業(yè)模式 Apply Biosystems(ABI) 基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測序法 美國 Agencourt 私人基因組學(xué)公司（ APG） 上市公司： 銷售設(shè)備和試劑獲取利潤 Illumina 合成測序法 英國 Solexa公司首席科學(xué)家 David Bentley 上市公司： 銷售設(shè)備和試劑獲取利潤 Roche 大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法 美國 454 Life Sciences公司的創(chuàng)始人 Jonathan Rothberg 上市公司： 銷售設(shè)備和試劑獲取利潤 Helicos 大規(guī)模并行單分子合成測序法 美國斯坦福大學(xué)生物工程學(xué)家 Stephen Quake 上市公司： 2007年 5月首次公開募股（ IPO） Complete Genomics DNA 納米陣列與組合探針錨定 連接測序法 美國 Complete Genomics公司首席科學(xué)家 radoje drmanac 私人公司：投資額為4650萬美元 表一：主流測序平臺一覽 這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對于傳統(tǒng)測序的 96 道毛細(xì)管測序，高通量測序一次實驗可以讀取 40萬到 400萬條序列。讀取長度根據(jù)平臺不同從 5 25bp到 450bp，不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取 1G到 14G不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。盡管如此，在這項新的劃時代的測序技術(shù)剛出現(xiàn)的時候，科學(xué)界對這項新技術(shù)卻并不熱衷。許多 習(xí)慣用桑格技術(shù)的科學(xué)家懷疑新技術(shù)的準(zhǔn)確度、閱讀能力、成本消費、實用性。代理 Sanger型測序硬件的經(jīng)銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。 圖一：在芯片上進行的測序： Illumina測序平臺 然而大多數(shù)人卻忽略了一個事實，即桑格 技術(shù)的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術(shù)剛開發(fā)出來時，閱讀能力很難超過 25bp，即使在 Fred Sanger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達到 80bp，如今卻達到了 750bp；而新發(fā)展的合成測序技術(shù)，應(yīng)用焦磷酸測序方法，其閱讀能力最初只有 100bp，推向市場 16個月后增加至 250bp，隨著技術(shù)的不斷完善，目前已達到了 400bp，很快就接近桑格技術(shù)目前的水平。除了閱讀能力外，能否以有限的成本用一臺儀器產(chǎn)生足夠數(shù)量的序列標(biāo)記也是另一個需要改善的重要問題。這個問題已經(jīng)被 Roche公司解決了，應(yīng)用他們的系統(tǒng)，僅花費閱讀 35bp或者更小片段的成本就能產(chǎn)生比 35bp多 10倍的序列標(biāo)記。 6 圖二： GS FLX 高通量測序方法原理示意圖 一、高通量測序的應(yīng)用 高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。 依靠后期強大的生物信息學(xué)分析能力，對照一個參比基因組 (reference genome)高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序 (re-sequence)， 2007 年van Orsouw等人結(jié)合改進的 AFLP 技術(shù)和 454 測序技術(shù)對玉米基因組進行了重測序，該重測序?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)的超過 75%的 SNP位點能夠用 SNPWave技術(shù)驗證，提供了一條對復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。 2008年 Hillier對線蟲 CB4858 品系進行 Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的 SNP 位 點和單位點的缺失或擴增。但是也應(yīng)該看到，由于高通量測序讀取長度的限制，使其在對未知基因組進行從頭測序 (novo sequencing)的應(yīng)用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測序 (讀取長度達到 850 堿基 )的協(xié)助。但是這并不影響高通量測序技術(shù)在全基因組 mRNA 表達譜， microRNA 表達譜，ChIP-chip以及 DNA甲基化等方面的應(yīng)用。 2008年 Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了 RNA 深度測序，這項工作展示了深度測序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進展，表達計數(shù)和序列分析。對測得的每條序列進行計 數(shù)獲得每個特定轉(zhuǎn)錄本的表達量，是一種數(shù)碼化的表達譜檢測，能檢測到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本。分析測得的序列，有大于 90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道過的 RNA剪切形式， 3端非翻譯區(qū)，變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小 RNA 前體，發(fā)現(xiàn)至少有 3500 個基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息無論使用芯 7 片技術(shù)還是 SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。 高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子 RNA 或非編碼 RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇 到的技術(shù)難題 (短序列，高度同源 )， 而且小分子 RNA 的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù) “不浪費 ”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子 RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子 RNA。在線蟲中獲得了 40 萬個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了 18個新的小 RNA分子和一類全新的小分子 RNA。 在 DNA蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀 深度測序 (ChIP-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的 DNA 直接進行測序，對比 ref seq可以直接獲得蛋白與 DNA結(jié)合的位點信息，相比 ChIP-chip， ChIP-seq可以檢測更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點、結(jié)合位點內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。 圖 三 : Independent Flow Cells（ SoLidTM System） 二、高通量測序的前景 目前，大多分析家都無法相信新一代測序技術(shù)能完全取代目前的芯片測序技術(shù)。不過，有些分析家也的確認(rèn)為芯片測序技術(shù)正面臨著挑戰(zhàn)，他們認(rèn)為到了 2012年新一代的測序技術(shù)將會帶來高達 2。 15億美元的產(chǎn)值。 2006 年，整個芯片測序市場大概價值 8 億美元，其中 65%的市場份額都是有關(guān)基因表達譜分析產(chǎn)品的，剩下 35%的市場份額則由基因型分析芯片占據(jù)。不過美國哈佛大學(xué)（ Harvard University）遺傳學(xué)教授 George Church認(rèn)為，這部分市場 8 也會受到新一代測序技術(shù)的沖擊。 重測序芯片（ resequencing arrays）、單核苷酸多態(tài)性分析芯片以及基因拷貝數(shù)目變異分析芯（ copy number variant array）市場也會受到影響。也有分析家不贊同這個觀點，他們認(rèn)為即使新一代測序技術(shù)很便宜，還是有不少人會選擇傳統(tǒng)的測序儀的。 新一代測序技術(shù)相對傳統(tǒng)芯片測序技術(shù)的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。去年夏天，由 Frost & Sullivan 公司對學(xué)術(shù)科研機構(gòu)和私人研究團體進行的一項調(diào)查研究結(jié)果表明，在實際應(yīng)用領(lǐng)域，例如進行表達譜分析時，人 們還是傾向于選擇傳統(tǒng)的芯片產(chǎn)品，而并非青睞新一代的測序產(chǎn)品。 新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導(dǎo)致。平均采購一臺新一代測序儀大約要花費 50萬美元，除非該實驗室測序的工作量非常大，否則是不會考慮購買的。即使像 Polonator這樣的新一代測序儀也需要花費 15萬美元左右，這筆費用對于一個小實驗室來說是無法承受的。這時，只需要 150美元一塊的芯片就非常有競爭力了。以基因芯片產(chǎn)品享譽業(yè)界的美國 Affymetrix 公司市場部副總裁 Jay Kaufman認(rèn)為，新一代測序技術(shù)對于芯片市場來說的確會帶來一定的沖擊，不過要完全取代表達譜分析芯片還需要一定的時間。 但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個 “封閉系統(tǒng) ”，它只能檢測人們已知序列的特征 (或有限的變異 )。而高通量測序的強項， 就在于它是一個 “開放系統(tǒng) ”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。 研究者可以充分享受這兩個平臺的比較優(yōu)勢，在獲取新信息的基礎(chǔ)上，利用芯片的強項， 即對已知信息的高通量、低成本 (相對 )的檢測能力， 對大量樣品進行快速檢測，短時間內(nèi)獲得有大量有效的數(shù)據(jù)。 作為兩個高通量的基因組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面存在重疊和競爭， 但是在更多方面是優(yōu)勢互補，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術(shù)難以解決的問題。 三、結(jié)語 新一代測序已顯示出巨大的潛力。也正是因為科學(xué)的不斷進步，在給測序技術(shù)提出新要求的時候，也給這項技術(shù)帶來了新的增長點： 9 2008年 4月 Helico BioScience公司的 Timothy等人在 Science上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù)，也被稱為第三代測序技術(shù)，并利用該技術(shù)對一個 M13病毒基因組進行重測序。這項技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序，是因為它完全跨過了上述 3 種高通量測序依賴的基于 PCR 擴增的信號 放大過程，真正達到了讀取單個熒光分子的能力，向 1000 美元測定一個人類基因組的目標(biāo)邁出了一大步。 基于半導(dǎo)體技術(shù)的納米孔測序技術(shù) 技術(shù)在新型測序技術(shù)中的重要作用。 新一代測序技術(shù)，即第三代測序技術(shù)，不同于前兩代測序，第一代測序技術(shù)是雙脫氧鏈末端終止法 根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A， T， C， G 四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的 PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得 DNA序列。第二代測序技術(shù)是焦磷酸測序法 由 4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適 于對已知的短序列的測序分析。 而第三代測序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有望大大降低測序成本，改變個人醫(yī)療的前景。這一技術(shù)的研發(fā)是系統(tǒng)工程，涉 10 及生物、半導(dǎo)體、計算機、化學(xué)、光學(xué)等多個領(lǐng)域，需要不同學(xué)科 頂尖力量的合作。 Science文章重點提到了其中的半導(dǎo)體技術(shù)，離子激流公司（ Ion Torrent）的測序儀就是一種硅芯片，是利用與半導(dǎo)體一樣的方式構(gòu)建的，利用這種技術(shù)，科學(xué)家們在 Science雜志上公布了三個低成本的完整人類基因組序列。 這種高質(zhì)量，低成本（文章還報道了不同樣本的測序成本，包括了從 $8,005（ 87x coverage）到 $1,726（ 45x coverage）的范圍）的基因組測序方法能幫助研究人員對成千上百個某種疾病患者的完整基因組序列進行分析，從而獲得對這種疾病的深入了解，最終找出預(yù) 防和治療的方法。 基于半導(dǎo)體技術(shù)的納米孔測序技術(shù)， DNA 分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質(zhì)以