穩(wěn)定表達PTEN、EGFR、EGFRvⅢ人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定.doc

穩(wěn)定表達pten、egfr、egfrv人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定穩(wěn)定表達 pten、egfr、egfrv人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定#董裕翠，任歡*51015（哈爾濱醫(yī)科大學免疫教研室，哈爾濱 150081）摘要：目的：分別建立穩(wěn)定表達抑癌基因 pten、表皮生長因子受體（egfr）及突變型 egfrv的惡性膠質瘤細胞系，從基因、蛋白及細胞水平驗證外源性 pten、egfr 和 egfrv基因對 u87mg 細胞的影響。方法：采用 pcr 方法擴增 pten 基因編碼區(qū)序列，構建重組表達載體 pcdna3.1 - /pten。分別將 pcdna3.1 - /pten 和 plwernl 轉染 u87mg 細胞，篩選后建立穩(wěn)定細胞系。應用 rt-pcr 和 western blotting 法檢測 pten、egfr 在不同抗性細胞克隆的表達。mtt 法檢測外源性 pten、egfr 和 egfrv基因對細胞增殖的影響。結果 ： 構 建 真 核 表 達 載 體 pcdna3.1 - /pten 及 穩(wěn) 定 表 達 細 胞 系 u87mg-pten 和u87mg-egfr，并經(jīng) rt-pcr 及 western blotting 驗證。轉染外源性 pten 抑制細胞增殖（p 0.05），轉染 egfrv促進細胞增殖（p 0.05），轉染 egfr 對細胞增殖無顯著影響（p 0.05）。結論：成功建立穩(wěn)定表達抑癌基因 pten、原癌基因 egfr 及其突變體 egfrv的人惡性膠質瘤細胞系。為進一步研究所轉染基因對相關下游細胞信號轉導通路的影響及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好基礎。關鍵詞：惡性膠質瘤；pten 基因；egfr 基因；egfrv基因；穩(wěn)定轉染中圖分類號：r20establishment and identification of human glioblastomacell line stably expressing pten/egfr /egfrvdong yucui, ren huan department of immunology, harbin medical university, harbin 150081 25303540abstract: objective：to establish human glioblastoma cell line u87mg-pten, u87mg-egfrand u87mg-egfr stably expressing pten, epidermal growth factor receptor egfr andegfrv, respectively. on gene expression, protein expression and cell proliferation levels toverify the effect of exogenous pten, egfr and egfrv gene on the u87mg cells. methods：the pten gene cds was amplified by pcr , then inserted into eukaryotic expression vectorpcdna3.1 - to construct recombinant vector pcdna3.1 - /pten. pcdna3.1 - /pten andplwernl were transfected into u87mg cells respectively. the expression of pten and egfrin different g418 resistant cell clones was detected by rt-pcr and western blotting. the effectof exogenous pten, egfr and egfrv gene on the cell proliferation was tested by mttassay. results：the eukaryotic expression vector pcdna3.1 - /pten was constructed. the stablecell lines u87mg-pten and u87mg-egfr were established and verified by rt-pcr andwestern blotting. stable expression of exogenous pten can suppress the growth of humanglioblastoma cell line u87mg p 0.05 , stable expression of exogenous egfrv can increasethe growth of u87mg p 0.05 , whereas stable expression of egfr has much less effect on theu87mg cells growth p 0.05 . conclusion ： we have successfully established humanglioblastoma cell line u87mg-pten, u87mg-egfr and u87mg-egfr stably expressingpten, egfr and egfrv, respectively. this will lay down a good basis to further study theeffect of transfected gene on the related downstream signaling pathways in glioblastoma and thedevelopment of gbm.keywords: glioblastoma; pten gene; egfr gene; egfrv gene; stable transfect基金項目：本課題受高等學校博士學科點專項科研基金資助（項目編號 20092307110006）作者簡介：董裕翠， 1982- ，女，講師，主要研究惡性腦膠質瘤信號轉導模式及靶向治療。通信聯(lián)系人：任歡， 1967- ，女，教授，主要研究惡性腫瘤的靶向治療及免疫逃逸機制。e-mail:huanren2009126-1-4550556065707580在惡性膠質瘤中，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，egfr）的過表達及突變占 45%1。egfr 基因擴增常伴隨結構的變異，其中第三類突變體（egfrv）是惡性膠質瘤中最常見的基因組突變體，該受體缺失 2-7 外顯子。抑癌基因 pten（humanphosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）在正常情況下通過調(diào)控原癌基因磷脂酰肌醇（pi）-3-激酶（pi3k）來抑制該信號通路的活化從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。惡性膠質瘤中 36% 的 pten 基因發(fā)生了缺失或突變1 。研究證實，egfr、pten 等基因的異常表達正是促進與之相關信號轉導通路網(wǎng)絡異?；钴S的重要因素。因此，egfr 下游區(qū)域密切相關的細胞信號轉導網(wǎng)絡可能是在維持惡性膠質瘤細胞基因表型及功能狀態(tài)中起關鍵作用的主效通路。人惡性膠質瘤細胞u87mg表達低水平egfr基因，不表達egfrv基因，pten基因發(fā)生剪接位點突變，第3外顯子缺失，因而不能發(fā)揮其功能。本實驗將建立分別表達pten和egfr的兩種人惡性膠質瘤細胞系，研究外源性pten、egfr和egfrv基因的表達及對u87mg細胞增殖的影響。1 材料與方法1.1 主要材料人惡性膠質瘤細胞 u87mg、ln229 和 u87mg-egfrv為本教研室保存，質粒載體pcdna3.1 - 由本校遺傳學教研室饋贈，含 egfr 基因的表達載體 plwernl 由 dr. frankfurnari ludwig institute, san diego, ca 惠贈，lipofectaminetm2000 購自 invitrogen 公司，dna marker、限制性內(nèi)切酶（ecor、kpn、sal和 nco）購自 takara 公司，t4 dna連接酶購自 neb 公司，g418 為 emd biosciences 公司產(chǎn)品，egfr 兔單克隆抗體、pten兔單克隆抗體、hrp 標記抗兔抗體購自 cell signaling 公司，-actin 一抗購自武漢博士德公司，四甲基偶氮唑藍 mtt 為 sigma 公司產(chǎn)品。1.2 重組質粒 pcdna3.1 - /pten 的構建0. 引物設計根據(jù) genebank 中 pten 的 cdna 序列，分別在引物 5端加上 ecor和 kpn酶切位點，設計引物 p1（上游引物: ccg gaa ttc ggc tcc cag aca tga cag，下游引物: cggggt acc aag ttt att ttc atg gtg ttt），用于擴增 pten 基因編碼區(qū)。根據(jù)包含pten 基因第三外顯子的原則設計引物 p2（上游引物：cat gac agc cat cat caa ag，下游引物：gtc aag atc ttc aca aaa gg），用于檢測突變型和野生型 pten 的表達。根據(jù) genebank中 egfr cdna 序列，設計引物 p3（上游引物: ctt cgg gga gca gcg atgcga c，下游引物：acc aat acc tat tcc gtt aca c），檢測 egfr 基因的表達。根據(jù) genebank 中 -actin cdna 序列，設計參照引物 p4（上游引物：att ggc aat gag cggttc cgc，下游引物：ctc ctg ctt gct gat cca cat c）。引物由上海英俊生物技術公司合成。. 人 pten cdna 的擴增按 trizol 試劑說明書提取 ln229 細胞（ln229 中含完整的 pten 基因，能表達內(nèi)源性的 pten 蛋白2,3 5min。以 ln229 cdna 為模板，p1 為引物，擴增 pten 編碼區(qū)序列。反應條件: 98變-2-性 10s，65退火 10s，72延伸 70s（30 個循環(huán)）。pcr 產(chǎn)物通過 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。85. 人 pten 真核表達載體的構建將回收純化的 pcr 產(chǎn)物及質粒 pcdna3. 1 - 分別用 ecor和 kpn雙酶切，低熔點瓊脂糖電泳分離、膠回收純化后，經(jīng) t4 dna 連接酶連接，轉化大腸桿菌 top10 感受態(tài)細胞，重組質粒分別經(jīng) sal和 nco酶切及基因測序鑒定。.g418 對 u87mg 細胞的毒性試驗9095u87mg 在 5% co2、37條件下培養(yǎng)于 dmem 培養(yǎng)基（含 10%胎牛血清、100u/ml 青霉素和 100g/ml 鏈霉素）。取生長狀態(tài)良好的細胞制成單細胞懸液，接種于 6 孔板中，待細胞貼壁后，更換含有 g418 的濃度分別為 100、200、300、400、500、600、700、800、900和 1000g/ml dmem 培養(yǎng)基，每種濃度設 2 個平行孔，每隔 3 天換藥 1 次，以 10-14 天細胞全部死亡的最低 g418 濃度為最佳篩選濃度。1.3 穩(wěn)定轉染細胞系的建立按照 lipofectaminetm2000 操作說明書，用表達載體 pcdna3.1 - /pten 和 plwernl分別轉染 u87mg 細胞。轉染約 48 小時后，在含 g418 的選擇性培養(yǎng)基中篩選細胞 2-3 周，獲得抗性細胞克隆，擴增培養(yǎng)、鑒定后，建立穩(wěn)定細胞系。1.4 穩(wěn)定細胞系的鑒定100.rt-pcr 法分別收集 pcdna3.1 - /pten 和 plwernl 轉染后挑取的細胞克隆，按 trizol 試劑說明書提取細胞總 rna，取 1g 進行反轉錄。以 p2 為引物的 pcr 反應條件：94預變性 3min，94變性 30s，58退火 30s，72延伸 45s（30 個循環(huán)），72延伸 10min。以 p3 為引物的 pcr 反應條件：94預變性 2min，94變性 30s，58退火 30s，72延伸 60s（30 個循105110115環(huán)），72延伸 10min。以 p4 為引物的 pcr 反應條件：98變性 10s，54退火 15s，72延伸 30s（28 個循環(huán)）。取 pcr 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。. western blotting 法分別收集 pcdna3.1 - /pten 和 plwernl 轉染后挑取的細胞克隆，經(jīng)裂解液裂解細胞，bradford 法測蛋白濃度。樣品于 100 水浴 5 min ,取等量蛋白上樣進行 sdas - page 電泳,電泳后將蛋白轉移至硝酸纖維膜上,5 %脫脂奶粉封閉,隨后與特異性一抗孵育 4過夜，次日與辣根過氧化物酶 hrp 標記的二抗室溫孵育 1 小時后，暗室中用 ecl 化學發(fā)光試劑作用雜交膜顯影成像于 x 膠片上。1.5 細胞增殖實驗分別取對數(shù)生長期 u87mg、u87mg-pten、u87mg-egfr 和 u87mg-egfrv細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，按每孔 4103 個細胞接種于 96 孔板中，每孔體積 100l。用含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 小時后，更換無血清培養(yǎng)液。以 u87mg 為對照組，u87mg-pten、 u87mg-egfr 和 u87mg-egfrv為試驗組，每組細胞設 4 個復孔，6 個時間檢測點，分別于第 1、2、3、4、5、6 天檢測。在指定時間點每孔加入 mtt 5mg/ml 20l，37孵育 4h 后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入 dmso 100l，室溫振蕩 10min，在酶聯(lián)免疫檢測-3-120125130儀 490nm 波長下測定其吸光度值，以細胞增殖百分率為縱坐標、時間為橫坐標繪制細胞生長曲線圖。1.6 統(tǒng)計學方法本實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（ x s）表示，采用 spss 軟件包進行統(tǒng)計學處理，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，以 p 0.05 作為有無顯著性差異的判斷標準。2 結果2.1 重組質粒的鑒定重組質粒 pcdna3.1 - /pten，經(jīng) sal酶切可得到長度 4480bp 和 2185bp 兩條片段，經(jīng)nco酶切可得到長度 3342bp、2588bp 和 735bp 三條片段，與預期片段一致（圖 1）。經(jīng)基因測序、blast 比對，重組質粒的插入片段序列與 genbank 數(shù)據(jù)庫中 pten 編碼區(qū)序列相符。圖1 pcdna3.1 - /pten酶切鑒定結果fig.1 restrictive endonuclease digestion of pcdna3.1 - /pten1352.2m:dna marker 1: sal酶切質粒 2: nco酶切質粒g418 最佳篩選濃度的確定800、900、1000g/ml 組于第 2 天， 500、600、700g/ml 組于第 3 天，300、400g/ml組于第 5 天開始出現(xiàn)抑制細胞生長現(xiàn)象，第 10 天，除 200、300g/ml 組有細胞存活外，其余各組細胞全部死亡。因此，可以認為在本實驗條件下 g418 最佳篩選濃度為 400g/ml。1402.3 穩(wěn)定細胞系的鑒定.rt-pcr 水平.（1）：用引物 p2 進行 pcr 擴增，在轉染 pcdna3.1 - /pten 的三株細胞克隆中可擴增出兩條條帶，即突變型 pten（283bp）和野生型 pten（328bp），而在 u87mg 細胞只能檢測到突變型 pten（283bp）的表達（圖 2）。下圖為相對應細胞內(nèi)參照基因 -actin145（336bp）的表達。-4-圖2 rt-pcr檢測pten mrna的穩(wěn)定表達fig.2 rt-pcr analysis of pten mrna stable expressionm: dna marker 1: u87mg細胞2：轉染pcdna3.1 - /pten的9號克隆1503: 轉染pcdna3.1 - /pten的10號克隆4: 轉染pcdna3.1 - /pten的14號克隆.（2）：以 p3 為引物，進行 pcr 擴增，在 u87mg 和 plwernl 轉染的 u87mg細胞 9 號克隆中可擴增出 egfr 的條帶（1044bp），且轉染 plwernl 的細胞中 egfr 基因表達更強（圖 3）。下圖為相對應細胞中內(nèi)參照基因 -actin（336bp）的表達。155圖3 rt-pcr檢測egfr mrna的穩(wěn)定表達fig.3 rt-pcr analysis of egfr mrna stable expressionm:代表dna marker 1: u87mg細胞2: 轉染plwernl的u87mg細胞9號克隆160165. western blotting 水平檢測. 1 圖 4 結果顯示，轉染 pcdna3.1 - /pten 的三株細胞克?。? 號，10 號和 14 號）表達 pten 蛋白（54kda），這表明 pten 在此三株細胞克隆中得到了穩(wěn)定表達，且 14 號的蛋白表達最強，故將其建立穩(wěn)定細胞系，即為 u87mg-pten。圖4 western blotting檢測pten蛋白的穩(wěn)定表達fig.4 western blotting analysis of pten protein stable expression1:u87mg細胞2：轉染pcdna3.1 - /pten的9號克隆3: 轉染pcdna3.1 - /pten的10號克隆 4: 轉染pcdna3.1 - /pten的14號克隆-5-. 2 圖 5 結果表明，轉染 plwernl 的 u87mg 細胞 9 號克隆表達 egfr 蛋白170175180（170kda），而在 u87mg 細胞和其余轉染 plwernl 后所挑取的細胞克隆中均沒有檢測到 egfr 蛋白的表達，這表明 egfr 蛋白在 9 號克隆中得到了穩(wěn)定表達，故將其建立穩(wěn)定細胞系，即為 u87mg-egfr。圖5 western blotting檢測egfr蛋白的穩(wěn)定表達fig.5 western blotting analysis of egfr protein stable expression1: u87mg 細胞 2: 轉染plwernl的u87mg細胞9號克隆2.4 細胞增殖實驗各組細胞生長曲線見圖 6。統(tǒng)計學分析表明，在無血清狀態(tài)下培養(yǎng) 6 天后，試驗組細胞u87mg-pten、u87mg-egfrv與對照組細胞 u87mg 相比，吸光度值都有顯著性差異（p 0.05）；而試驗組細胞 u87mg-egfr 與對照組細胞 u87mg 相比，吸光度值無顯著性差異（p 0.05）。這表明在無血清狀態(tài)下，外源性 pten 的表達能抑制 u87mg 細胞的增殖，egfrv能促進 u87mg 細胞的增殖，而野生型 egfr 對 u87mg 細胞增殖影響不顯著。185fig.6圖6 各組細胞生長曲線圖cell proliferation under serumfree conditions3 討論抑癌基因 pten 和原癌基因 egfr 功能狀態(tài)及其基因變異方式與惡性膠質瘤的發(fā)生發(fā)展190195等生物學行為有密切關系，并且影響膠質瘤的臨床治療效果和預后判定。pten 基因編碼的蛋白質具有雙特異性蛋白/脂質磷酸酶活性4，在誘導細胞周期阻滯和凋亡以及細胞的粘附、遷移、分化等多方面均起到了至關重要的作用5-7。研究表明，外源性 pten 在 pten 突變的惡性膠質瘤細胞中的表達，可誘導 g1 期阻滯，有效抑制腫瘤細胞生長。在惡性膠質瘤發(fā)生和發(fā)展過程中, egfr 常常出現(xiàn)基因擴增和重排，導致基因突變使腫瘤細胞表面的抗原表型發(fā)生變化，其中最常見的突變類型為 egfrv，其激活表現(xiàn)為配體非依賴性酪氨酸激酶組成性激活8。到目前為止，egfrv在將近 61 %惡性膠質瘤被檢測到，而在多種正常組織中未檢測到。許多研究表明，egfrv能促進細胞增殖，抑制細胞凋-6-亡，提高腫瘤細胞致瘤性9，egfrviii 還能提高細胞活力，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲10。因其只在腫瘤細胞中表達,而在正常細胞中不表達,具有腫瘤特異性,而成為腫瘤靶向治療的200205210215220225230235熱點。在本研究中，將重組真核表達載體 pcdna3.1 - /pten 和 plwernl 分別轉染人惡性膠質瘤細胞 u87mg，從基因和蛋白兩個水平驗證了轉染基因的穩(wěn)定表達，分別建立了穩(wěn)定表達外源性 pten、egfr 基因的細胞系 u87mg-pten 和 u87mg-egfr，并就外源性 pten、egfr 和 egfrv基因對細胞增殖的影響進行了研究。mtt 實驗 表明，pten 能抑制u87mg 細胞的增殖，egfrviii 能促進 u87mg 細胞的增殖，而 egfr 對 u87mg 細胞增殖影響不顯著。穩(wěn)定細胞系 u87mg-pten、u87mg-egfr 和 u87mg-egfrv的成功構建為進一步研究所轉染基因 pten、egfr 和 egfrv對相關下游細胞信號轉導通路的影響及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好的基礎，從而明確膠質瘤中不同分子亞型的細胞下游相關信號轉導通路的差別，有助于正確區(qū)分不同分子亞型不同作用靶點，提出有效的、有針對性的治療靶點，為臨床應用提供理論依據(jù)。4 結論本研究成功建立穩(wěn)定表達抑癌基因 pten、原癌基因 egfr 及其突變體 egfrv的人惡性膠質瘤細胞系。這為進一步研究所轉染基因對相關下游細胞信號轉導通路的影響及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用提供了良好的體外實驗模型。參考文獻 references 1 the cancer genome atlas research network. comprehensive genomic characterization defines humanglioblastoma genes and core pathways j.nature, 2008,455 7216 :1061-1068.2 li j, yen c, liaw d, et al. pten, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast,and prostate cancerj. science, 1997, 275 5308 :1943-1947.3 furnari fb, lin h, huang hs, et al. growth suppression of glioma cells by pten requires a functionalphosphatase catalytic domainj. proc natl acad sci u s a, 1997, 94 23 :12479-12484.4 myers mp, stolarov jp, eng c, et al. p-ten, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is adual-specificity phosphatasej. proc natl acad sci u s a, 1997, 94 17 : 9052-9057.5 li dm, sun h. pten/mmac1/te