（植物學(xué)專業(yè)論文）喜樹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生理特性的初步研究.pdf

摘要 喜樹堿是一種色氨酸一萜類生物堿，具有抗癌、清熱、殺蟲功能，是繼紫杉 醉之后的第二個(gè)從植物提取的衍生抗癌藥物，具有積極的丌發(fā)前景。但目前的 研究情況和國(guó)內(nèi)外的研究趨勢(shì)來看，喜樹堿及類似物主要是從喜樹中分離獲 得，其產(chǎn)量必受到喜樹生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境因素的影響，因此通過高等植物細(xì)胞培 養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)喜樹堿將是一個(gè)很好的選擇。本文以喜樹( 凸印捌 e f a a c 一，一抬d e c s n ec p a ) 愈傷組織為材料，比較系統(tǒng)的研究了懸浮培養(yǎng)條件下光 照、激素以及多種理化因子喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)、生理生化特性的影響，使 喜樹細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)速度有明顯提高，為迸一步研究積累了資料。 1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 不同種類、不同濃度的激素及其組合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)不相同。n a a 濃度為 0 5 m g l 時(shí)最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；在n 從與k t 組合中，以n 從o 5 m g l + k t o 1 m g 1 的效果最佳，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快。 2 生理生化特性的研究 在光照條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)周期為3 0 天；而在黑暗條件下，生長(zhǎng)周期為2 7 天，細(xì)胞增殖曲線均呈“s ”型，可大致分為延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期和靜止期： 在兩種光照條件下，其培養(yǎng)液的p h 先下降后都呈上升趨勢(shì)；培養(yǎng)細(xì)胞中可溶 性蛋白質(zhì)含量變化曲線相似，在1 2 天和2 l 天出現(xiàn)兩個(gè)高峰，黑暗條件下的含 量低于光照條件下的含量：培養(yǎng)細(xì)胞的過氧化物酶活性變化曲線相似，均出現(xiàn) 兩個(gè)高峰，第一個(gè)高峰均出現(xiàn)在第3 天，光照條件下的第二個(gè)高峰出現(xiàn)在1 5 天，而黑暗條件下出現(xiàn)在1 8 天；培養(yǎng)細(xì)胞超氧化物歧化酶活性變化曲線相似， 均出現(xiàn)兩個(gè)峰值，光照條件下的第一個(gè)高峰出現(xiàn)在1 8 天，而黑暗條件f 出現(xiàn) 在2 l 天，兩種情況下的第二個(gè)高峰均出現(xiàn)在第2 7 天。 3 不同理化因子的影響 在喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，b 5 培養(yǎng)基和w h i t e 培養(yǎng)基較有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)； 適宜的接種量為3 4 9 鮮重1 0 0 m 1 培養(yǎng)基：隨著蔗糖和葡萄糖濃度的升高，細(xì) 胞生長(zhǎng)速度呈上升趨勢(shì)，且在濃度為3 乃4 g l 時(shí)最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)：添 加適宜的瓊脂糖能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)：n 0 ；和n 。+ 的比例不同，細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)也不同。 最后，對(duì)作為藥用資源的植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 的丌發(fā)，出現(xiàn)的問題以及對(duì)這些問題的探索進(jìn)行了討論。同時(shí)對(duì)今后的研究方 向也作了展望。 關(guān)鍵詞：光照激素化學(xué)因子細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)喜樹 a b s t r a c t c a n l d t o t h e c i ni s ak i n d o fa n t i c a n c e rm e d i c i n eh a v i n gg o o dp r o s p e c to f ：x p l o i t a t i o n ，c p ta n da n a l o g u ea r eg e tf r o mc p a a t t h em o m e n t ， o u t p u to fc p t 、v a se f k c t e db yt h eg r o 、v t ha n de n v i m n m e n to fc p a s op r o d u c t i o no fc p tb y c e l ic u l t u r e m a yb e a p r o m i s i n g c h o i c ei nt h e p a p e r ，b a s e d o nc a l l u so f ( 力療卿，d ，拋c 口口c “m f 門口幻d e c s n e ，t h ei n n u e n c e so fl i g h t 、h o n n o n e sa n ds e v e r a l r a c t o r so nt h e 掣o 、v t h 、 p h y s i 0 1 0 9 i c a l 、 b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r so fs u s p e n s i o n ( ，u l t u r e o f ( 勿一鮮，o f 向e c 日口c “，”f d f 口d e c s n e w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d ，c e l l g r o 、v t hs p e e d w a so b v i o u s l yi m p r o v e d ，i tw o u l d g i v er e f e r e n c e sf o rf u t u r es t u d i e s 1 e f f e c t so fh o r m o n e s d i 仃宅r e n tk i n d s 、d i m r e n tc o n c e m r a t i o na n dc o m b i n a t i o n so fh o r m o n e sh a d ( 1 i 腑r e n te 腩c t so nc e l lg r o 州h o 5 m g ln a aw a so p t i m a lf o rt h ec e l lg r o 叭h ； a m o n g t h ec o m b i n a t i o no f n a aa n dk t ，o 5 m g l n a a + 0 1 m g l k tw a so p t i m a lf o r i h ec e l lg r o w t h 2 s t u d yo fp h y s i o l o g i c a i a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s w h e nc p aw a sc u l t u r ei nt h el i g h ta n di nt h ed a r k ，b o t ho ft h e i rc e l lg r o w t h c u r v e sw e r el i k e “s ”， b u tt h e i r g r o 、v t h c i r c l e sw e r ea b o u t3 0a n d2 7d a y s t e s p e c t i v e l y ，i tc o u l db ed i v i d e di n t ol a gp h a s e 、e x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s ea n d s t a t i o n a l _ yp h a s e t h ec e l lg r e wm o r er a p i d l yi nt h ew h i t el i g h tt h a ni nt h ed a r k ；t h e p hv a l u e so fc u l t u r em e d i u m sl o w e r e da n dt h e ns h o w e du p g r a d u a l l y ；1 w op e a k so f s o l u b l ep r o t e i nc o n t e n t sa n dp e r o x i d e sa n d s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t i e s o f c u l t u r ec e l l w e r es h o w e du p ，b u tt h e yw e r eo nt h ed i 舒；r e n t d a y s ；t h e s o l u b l e p m t e i n c o n t e n tw a s h i g h e r i nt h ew h i t e l i 曲t 3 e f k c t so fd i f f e r e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r s i nt h es u s p e n s i o nc u l t u r e ，b 5 m e d i u ma n dw h i t em e d i u mw e r eo p t i m a lf o rc e l l 酎。蚍h；t h e i n o c u l u r l l s q u a n t i t y o f 3 4 9 f w l 0 0 1w a sb e t t e rf o r t h ec e i i i i i 碩士學(xué)位論文 m a s t r st i i e s i s g r o w t h ；t h eg r o w t hr a t e i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e m r a t i o n so fs u c r o s e a n dg l u c o s e ；t h em e d i u mw i t hc e r t a i nc o n c e n t r a t i o no f a g a r o s ec o u l di n c r e a s et h e g r o w t hr a t e ；e f f e c to f c u l t u r a lc e l lg r o w t hw a s d i f k r e n tw i t hd i f r e r e n tp r o p o r t i o no f n 0 3 a n dn h 4 + f i n a l l y ，t h ec o n d i t i o n si nc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r eo fs o m e m e d i c i n ep l a n t sw e r e a n a l y z e d ；r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t 、 p r o b l e m sa n dr e s o l u t i o n sw e r ed i s c u s s e d ； p r o s p e c t so ff m u r e r e s e a r c h e sw e r ea l s og i v e n ， k e yw o r d s ：l i g h t 、h o r m o n e 、p h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r 、 c e l is u s p e n s i o n c u l n l r e 、c e l lg r o w t h 、c 白，妒f o ，向p c 口口c “，”f 門d f 口【) e c s n e 第一章前言 喜樹( 國(guó)印f o f 廳e c aa c 伽加a d e c s n e ) 屬珙桐科( n y s s a c e a e ) 旱蓮屬植 物。落葉喬木。分郝于我國(guó)長(zhǎng)江流域及西南各省和印度部分地區(qū)，臺(tái)灣、廣西 等也有栽培。1 9 6 6 年美國(guó)的m o n r o ee w a l l 等從喜樹的樹皮中分離出喜樹堿 ( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) ，并確定了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)腫瘤試驗(yàn)證明這種色氨酸萜 烯類生物堿具有抗癌活性，從而引起人們的廣泛關(guān)注”1 。7 0 年代初用c p r 進(jìn)行 人體胃腸癌的實(shí)驗(yàn)性治療，對(duì)部分病人的癥狀有所緩解。由于c p t 的毒性和令 人難以忍受的副作用如惡心、嘔吐，以及制成水溶液的鈉鹽后抗癌活性有所降 低等原因，使試驗(yàn)受阻，c p t 的研究由此進(jìn)入低潮階段”。1 9 8 5 年，y 1 ls a n g “ 等發(fā)現(xiàn)c p t 能阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ，t o p oi ) 的合成。t o p of 是一種與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的一種酶，阻斷這種酶的產(chǎn)生即可阻止癌細(xì)胞的生 長(zhǎng)，說明c p t 作用靶是t o p oi 而不是拓?fù)洚悩?gòu)酶i i ( t o p o i i ) ，這i f 是c p t 獨(dú)特 的抗癌機(jī)理。這一發(fā)現(xiàn)掀起了喜樹與c p t 研究的新高潮。自1 9 8 j 年以來，尤 其是進(jìn)入9 0 年代后，美國(guó)、只本、加拿大和英囤等國(guó)家積極投入大量的人力、 物力進(jìn)行喜樹研究與c p t 的開發(fā)，使喜樹成為紅豆杉之后第二個(gè)重要的木本抗 癌藥用植物，已成為世界性熱門研究課題。 喜樹體外培養(yǎng)始于7 0 年代初?！? 7 3 年m i s a w a 等”1 進(jìn)行了喜樹的組釤 培養(yǎng)。 他們從喜樹莖、時(shí)等得到的愈傷組織及培養(yǎng)細(xì)胞。分別培養(yǎng)1 月和1 5 天后能 積累c p t ，但含量低，僅為原始植物的十分之。s a k a t o ”“”等于1 9 7 4 年報(bào)道 了喜樹愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中分離年1 1 鑒 定c p t 的方法。1 9 9 2 年a r j o n 1 又試驗(yàn)了不同培養(yǎng)基上喜樹愈傷組織誘導(dǎo)和細(xì) 胞懸浮培養(yǎng)的情況。1 9 9 6 年a s h o k 等“”又成功地通過項(xiàng)芽培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了喜樹的 克隆繁殖，且移栽成活率超過9 0 。 近年來關(guān)于喜樹細(xì)胞培養(yǎng)的研究主要在以下幾個(gè)方面。 碩士學(xué)位論文 m a s t e r st i 怔s i s 1 喜樹化學(xué)成分及藥理學(xué)的研究 1 1 喜樹堿及其衍生物 喜樹堿( c a m p t o t h e c in ，簡(jiǎn)稱c p t ) 是從廣泛分布在我國(guó)南方和印度的喜樹 的根、皮、莖和種子中分得的生物堿。1 9 6 6 年美國(guó)北卡羅來納大學(xué)、伊利諾伊 大學(xué)和n c i 的研究人員首次從喜樹莖中提取分離得該生物堿并確定了它的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。由于該生物堿在體外對(duì)h e l a 細(xì)胞和。細(xì)胞及嚙齒類動(dòng)物顯示較強(qiáng)的 抗癌活性，引起人們的極大關(guān)注。7 0 年代進(jìn)入臨床應(yīng)用后，出于其對(duì)消化系統(tǒng) 和泌尿系統(tǒng)的毒性和副作用太大，幾乎使其臨床研究陷于停頓。1 9 8 5 年美國(guó) h is a n g 等發(fā)現(xiàn)喜樹堿抗癌機(jī)制是抑制拓樸異構(gòu)酶i ( t o p oi ) ，這一重大發(fā)現(xiàn)使 它又重新受到廣泛的重視。此后幾年中，美、閂、英、加拿大等國(guó)合成了數(shù)百 個(gè)喜樹堿的衍生物，有的已經(jīng)或者即將進(jìn)入臨床研究。喜樹堿終于成為繼紫杉 醇之后的第二個(gè)從植物提取衍生的抗癌藥物，成為又一個(gè)世界性的熱門課 題。 依蓮洛特肯( i r i n o t e c a n ，c p t 1 1 ) 為喜樹堿的半合成品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為7 乙基一l o ( 哌啶基一1 一哌啶基) 羧氧喜樹堿，其水溶性優(yōu)于喜樹堿。由同本 y a k u l t d a i i c h i 公司丌發(fā)，對(duì)小鼠s 。，、l e w 】s 肺癌、胰癌o 。、黑色素瘤、 結(jié)腸癌3 8 及多種人癌裸鼠移植瘤均有效。用量1 0 0m g m j 周或3 j om g m 3 崩， 臨床上對(duì)非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、淋巴癌等有效。 拓樸特肯( t o p o t e c a n ，t p t ) ，又一一喜樹堿的半合成品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為( s ) 一9 ：二甲氨基一1 0 羥基喜樹堿鹽酸鹽。對(duì)一系列小鼠腫瘤均有明顯抗癌作用。對(duì)。 白血病、l e w i s 肺癌能治愈。對(duì)小鼠結(jié)腸癌3 8 及5 l 、5 0 7 6 網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、乳 癌1 6 c 及人結(jié)腸癌裸鼠移植h t 2 9 等均很有效。用量1 5m g ( m 。d ) 5 ，靜滴。 臨床上對(duì)非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌有效。 美國(guó)超基因公司( s u p e rg e n ) 最近又從中國(guó)喜樹中新獲得一種抗癌有效成 分( 類似c p t1 1 和t p t ) ，命名為r f s 一2 0 0 0 ，也是拓樸異構(gòu)酶i 抑制劑，據(jù)說 這是又一個(gè)紫杉醇，用它治療胰腺癌( 一種死亡率極高的癌癥) ，確診后存活時(shí) 問平均為4 5 個(gè)月。目前r f s 一2 0 0 0 已給6 0 名胰腺癌患者使用，結(jié)果較為樂 觀，存活率提高了1 倍，該藥口服副作用很小。該公司還對(duì)4 2 名各種固體瘤 患者進(jìn)行試用，認(rèn)為該藥將全面超過紫杉醇，預(yù)測(cè)2 年內(nèi)將r f s 一2 0 0 0 推向市 場(chǎng)1 。 1 2c p t 及類似物的應(yīng)用 國(guó)內(nèi)外對(duì)喜樹堿及其類似物的藥理作用進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果表明這類 藥物具有抗腫瘤、抗病毒和治療皮膚病_ 三方面的作用。 1 21 抗腫瘤作用 c p t 及其類似物抗惡性腫瘤研究從7 0 年代丌始，雖然中間有所停頓，仍 取得了巨大的成就。動(dòng)物試驗(yàn)表明c p t 對(duì)小鼠l 6 15 白血病、吉田肉瘤、肉瘤 j 8 0 、肉瘤3 7 及艾氏腹水癌等腫瘤均有一定的抑制作用，其中對(duì)小鼠白血病及 大鼠吉嗣肉瘤的療效較為顯著。前期臨床試驗(yàn)表明，c p t 及其類似物對(duì)膀胱癌、 腦癌、乳癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)腹質(zhì)瘤、何杰金氏病( 淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞瘤) 、 白血病、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、兒科癌瘤、前列腺癌 u 肝癌等部有不同程度的療效”“，周軍等對(duì)c p t 和1 0 一o hc p t 抗腫瘤活性和毒性 進(jìn)行比較，認(rèn)為l o o hc p t 較c p t 的毒性小、“等毒性”抗腫瘤活性強(qiáng)。林國(guó) 礎(chǔ)等對(duì)這種經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的羥基c p t 進(jìn)行了臨床應(yīng)用，現(xiàn)其在治療涎腺腫瘤上與 天然羥基c p t 的療效及副作用相似”。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)c p t 及其類似物的抗 腫瘤活性及作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)、臨床應(yīng)用、與其它抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用、 毒性反應(yīng)和使用方法都進(jìn)行了大量研究。 碩士學(xué)位論文 m a s t e r s t i 正s i s 1 22 抗病毒作用 作為t o p oi 抑制劑的c p t 及其類似物的研究已經(jīng)完成或即將完成，科學(xué)家 們的注意力已逐步轉(zhuǎn)向這些物質(zhì)的抗病毒性能，特別是與h i v 有關(guān)的艾滋病領(lǐng) 域“。以色列b e ng u r i o n 大學(xué)的p r i e l 和其他同事發(fā)現(xiàn)d n a 拓?fù)洚悩?gòu)酶i 在 h i v 復(fù)制中非?；钴S“，低劑量的c p t 能阻斷被感染細(xì)胞h i vi 的復(fù)制。c p t 類藥物不僅對(duì)h i v1 有效“，而且對(duì)其它與義滋病有關(guān)的病毒也有效。 1 23 對(duì)其它疾病治療作用 喜樹堿的二甲基砜溶液治療銀屑病，療效快、使用方便，且無副作用“。 針劑治療的有效率達(dá)7 5 7 ，但有些頭暈、膀胱炎等副作用。i 臨床應(yīng)用表明， c p t 有希望成為一種抑制青光眼濾過性手術(shù)后瘢痕形成的藥物”“。其它應(yīng)用c p t 被認(rèn)為是一種光化學(xué)活性成分。濃度為1 l o m o l 兒的c p t 溶液能阻礙煙草和 玉米的生產(chǎn)，但對(duì)大豆和高粱生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出影響o ”。 1 3 c p t 的人工合成與藥物開發(fā) 自喜樹堿被證實(shí)具有抗腫瘤活性以來，便丌始了喜樹堿及其類似物人工合 成的研究工作。美國(guó)北卡州三角研究所以w a ll 博士為首的研究組，近3 0 年來 一直從事喜樹堿及其類似物的合成、結(jié)構(gòu)與活性等方面的研究，對(duì)喜樹堿的丌 發(fā)研究起著重要的作用”“。早在7 0 年代初期，s t o r k 和t a n g 根據(jù)喜樹堿具有 扛元環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別以吡咯烷酮和比環(huán)酮酸為原料，先通過經(jīng)典的 f r 沁d l a n d e r 縮合反應(yīng)建立a 、b 環(huán)，然后在現(xiàn)成的d 環(huán)位置上連接構(gòu)造e 環(huán)的 適當(dāng)原子，經(jīng)環(huán)合、氧化兩步，制得( ) 一喜樹堿。w a n i 等對(duì)喜樹a 、c 、d 、 e 環(huán)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步修飾，提出e 環(huán)的d 羥基內(nèi)酯部分是保持抗腫瘤活性的 必需結(jié)構(gòu)”“。這樣以吡啶酮為原料先合成d 、e 壞，得到重要的三環(huán)衍生物， 再與n ( o 氨基卞叉基) p 甲苯進(jìn)行f r j e n d l a n d e r 的縮合反應(yīng)，生成2 0 支氧喜 樹堿，再進(jìn)一步氧化成喜樹堿。在喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，a 、b 環(huán)的平面性是抑 制d 局部異構(gòu)酶i 的重要因素，e 內(nèi)酯環(huán)是活性的必需基因，c 1 4 位上的空 碩士學(xué)位論文 m a s | r e r st 王e s i s 問要求也直接影響內(nèi)在活性”。因此在合成上不僅要考慮引入的取代基，同時(shí) 要考慮環(huán)系與取代基之間的關(guān)系，并注意取代基的性質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)與治療效果 之間的關(guān)系有待于今后進(jìn)一步研究。 由于喜樹堿的毒副作用，人們開發(fā)出了許多喜樹堿的類似物或衍生物， 以及這些衍生物的衍生物。美國(guó)r t i 的研究人員將其分為3 代。第一代為喜樹 中天然的8 種喜樹堿類似物。目前正在研究和有限制的臨床應(yīng)用的為第2 代， 第三代是r t i 聲稱要開發(fā)的新產(chǎn)品。我國(guó)在6 0 7 0 年代曾對(duì)許多種類的中草藥 進(jìn)行篩選，于7 0 年代成立了全國(guó)的喜樹研究協(xié)作組，在湖北黃石市召丌了“抗 癌藥物羥基喜樹堿鑒定會(huì)”( 1 9 7 5 ) ，也進(jìn)行了大量的藥理和臨床研究，證實(shí)喜 樹堿對(duì)肝癌、腸癌、膀胱癌和白血病等有一定療效，但也有較大副作用”“，此 后由于種種原因無論是喜樹堿還是l o o hc p t 的研究都沒得到進(jìn)一步的發(fā)展。 近年來，在藥理、臨床和栽培上開始有少量報(bào)道，但與國(guó)際形勢(shì)相比，速度非 常緩慢，在中國(guó)專利中僅檢索出3 5 條與喜樹堿有關(guān)的內(nèi)容，且許多專利權(quán)人 不是中國(guó)人。 2 喜樹組織培養(yǎng)的研究 2 1 喜樹愈傷組織的誘導(dǎo) 一般而言，植物組織培養(yǎng)可分為細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)兩大類。其中，細(xì)胞 培養(yǎng)法因具有相對(duì)快速的繁殖率，培養(yǎng)條件易于優(yōu)化和控制，產(chǎn)物分離較容易 等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的關(guān)注。 用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)喜樹堿的一般步驟為：誘導(dǎo)愈傷組織一繼代培養(yǎng)一建立 懸浮培養(yǎng)一擴(kuò)大培養(yǎng)。生產(chǎn)喜樹堿由于珙桐科植物本身所具有的特殊性質(zhì)，如 為木本，被子植物等，因此誘導(dǎo)喜樹植物的愈傷組織是比較困難的。不同種屬 或不同器官、組織及生長(zhǎng)部位，外殖體內(nèi)喜樹堿含量不等，對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)愈傷組 織的培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)條件均對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同程度的影響。 碩士學(xué)位論文 m a s t e r s l h e s i s 2 1 1 外殖體 由于細(xì)胞系的生長(zhǎng)和喜樹堿的生產(chǎn)受到多種因素的影響，各外殖體的誘導(dǎo) 能力存在很大的差異，而且誘導(dǎo)出的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)及生產(chǎn)次生代謝物的能力 砟i 盡相同。 喜樹各器官中c p t 的含量存在著較大差異”“。近年來的研究結(jié)果表明組織 越幼嫩，c p t 的含量越高；枝( 葉) 齡越小，含量越高；皮部較木質(zhì)含量高”。 喜樹的幼葉、莖、芽等部分誘導(dǎo)愈傷組織都取得了成功。 2 1 2 培養(yǎng)基 喜樹組織培養(yǎng)中愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最適培養(yǎng) 基都是m s ( 鹽類) + b 5 ( 有機(jī)類) 。喜樹克隆繁殖中試管苗的最適培養(yǎng)基 是b 5 “。 2 1 3 植物激素 n a a 和2 、4 一d 是喜樹組織培養(yǎng)中必要的激素因子。以葉片作為外殖體，當(dāng) 2 、4d 為2 m g 1 葉片脫分化效果最好，其次為4 、1 、o 5 m g l 。以莖為外殖體 誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合為2 、4 一d o 1 m g l + k t o 1 m g 1 + n a a o 1 m g 】1 。在 喜樹的克隆繁殖中，認(rèn)為最適生芽培養(yǎng)基中的植物激素是b a ，最適生根培養(yǎng)基 中的植物激素是i b 。 2 1 4 培養(yǎng)條件 在喜樹組織培養(yǎng)中，光照和溫度對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)和發(fā)育、不定芽和不定 根的產(chǎn)生、代謝物的積累等都有不同程度的促進(jìn)或抑制作用。喜樹葉片在離體 培養(yǎng)過程中，最適宜的光質(zhì)為藍(lán)光和黃光，其次為綠光和黑暗。紅光與白光條 件下的脫分化率最低：同時(shí)發(fā)現(xiàn)藍(lán)光有利于促進(jìn)p o d 和s o d 活性的提高。最適 葉片脫分化溫度為2 5 一2 7 。r 照時(shí)間1 4 1 0 h 。固體培養(yǎng)基d h 6 ，5 ，而懸 浮培養(yǎng)中最佳p h 為4 ，3 。 6 碩士學(xué)位論文 m s 1 e r st i e s i s 2 2 愈傷組織繼代培養(yǎng) 由外殖體誘導(dǎo)形成的愈傷組織開始比較緊密，只有經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的多次繼 代培養(yǎng)，愈傷組織變得較疏松時(shí)，j 唷進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。并非愈傷組織形成越快 越好，其早期生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)培養(yǎng)將產(chǎn)生顯著的影響。g i b s o n 在研究短葉紅豆杉細(xì) 胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，較早期形成( 2 周內(nèi)) 的愈傷組織在繼代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞并不增殖， 組織發(fā)生褐化以至壞死。而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上4 周一4 個(gè)月形成的愈傷組織，以 卜2 個(gè)月的間隔進(jìn)行繼帶培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織可以持續(xù)生長(zhǎng)。 23 喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是工業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)步驟。它的特點(diǎn)是培養(yǎng)規(guī)模較大， 細(xì)胞增殖速度快和能提供較大量均勻一致的培養(yǎng)物”“。 s a k a t o 和a r j o n 分別于1 9 7 4 年和1 9 9 2 年報(bào)道了喜樹細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。 s a k a t o “”1 研究表明外殖體的大小是決定懸浮培養(yǎng)細(xì)胞開始生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，但 提高接種細(xì)胞量并不一定能提高最終的產(chǎn)物。接種量以2 m g l ( 以細(xì)胞于重計(jì)) 為佳，分別用o 1 1 5 m m o l l 的色氨酸和苯丙氨酸可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。o 0 5 的 酶水解酪蛋白較其它氨基酸混合物如胨、酵母提取物和酸水解酪蛋白能更好促 進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，并確認(rèn)懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)基的最佳p h 為4 3 0 ，對(duì)于初始的p | 1 較高的培養(yǎng)基，細(xì)胞很難生長(zhǎng)，最終培養(yǎng)基的p h 向酸性方向降低。培養(yǎng)過程 q t 波長(zhǎng)為5 2 0 4 0 n m 的紅光對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有極大的促進(jìn)作用。a r j o n 研究表 明液體培養(yǎng)基中蔗糖含量限制細(xì)胞的生長(zhǎng)和c p t 的產(chǎn)量，蔗糖用完時(shí)細(xì)胞停止 生長(zhǎng)，及時(shí)加入蔗糖，細(xì)胞生長(zhǎng)可恢復(fù)。 通過t l c 和h p l c 提取和分析，喜樹莖干中含有的c p t 相當(dāng)于細(xì)胞干重的 o5 9 細(xì)胞干重最大時(shí)，c p t 含量不可能最大7 。c p t 是在細(xì)胞內(nèi)積累的，所 以培養(yǎng)基中也不含c p t ，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中測(cè)得c p t 最高含量是細(xì)胞干重的 o0 0 4 ，比外殖體中少l o o 倍。s h a k a t o ”發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素沒有促進(jìn)c p t 的生產(chǎn)。 然而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)定性或定量的改變或許能提高產(chǎn)量。因而，加入n a a 可 以提高c p t 的含量。另外用m s ( 鹽類) 加b 5 ( 有機(jī)類) 也有類似的效果。c p t 的含量隨培養(yǎng)時(shí)間而變化，并決定于所用培養(yǎng)基。c p t 含量與細(xì)胞生長(zhǎng)f 相關(guān)， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢時(shí)，c p t 的含量隨著降低，但是a r j o n 3 提出在3 0 天額外增加 蔗糖不僅可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以提高c p t 的產(chǎn)量。另外，通過其它一些方 法也可以提高c p t 的產(chǎn)量，例如：利用生物反應(yīng)器、選擇最適培養(yǎng)基、加入代 謝中問物或者通過細(xì)胞轉(zhuǎn)基因( 如毛狀根培養(yǎng)) 。 懸浮培養(yǎng)中喜樹堿分離與純化方法是利用m ir a c l o l h 過濾器從培養(yǎng)基中將 細(xì)胞分離出來，用足量的去離子水洗凈后進(jìn)行真空冷凍干燥，再經(jīng)9 5 乙醇【叫 流、超速離心、最后經(jīng)硅膠柱層析，得到的白色小顆粒即為純化的喜樹堿。 24 喜樹堿的提取與分析 c p t 及其類似物的提取與分離主要是利用這些物質(zhì)不溶于水而溶于乙醇、 氯仿等有機(jī)溶劑方面的特性，通過滲透使其溶于這些溶劑中。此后回收溶劑、 結(jié)晶即可得到最終產(chǎn)品。 滲透提取與萃耿分離提取是常用的提取方法。首先是將經(jīng)粉碎過的原料用 乙醇或石油滲透，然后將滲透液減壓濃縮，再用氯仿提取，蒸干氯仿即可得到 c p t 的粗提物。卡h 提物用甲醇氯仿( 1 ：l v v ) 混合液溶解后，在水浴上進(jìn)行 凹流；此后回收甲醇氯仿混合液至結(jié)晶析出為止，將結(jié)晶濾出、干燥即可得 到c p r 精致品“1 。 此外還有兩種方法可以提取c p t ：柱層析提取與分離”1 和樹脂吸附提取。 相比而苦，這兩種方法所得產(chǎn)品的純度高，得；車稍低，步驟煩瑣。而重結(jié)晶法 所得產(chǎn)品的純度稍低，顏色較深，但步驟簡(jiǎn)單，回收率高，后處理方便。 目前對(duì)c p t 生產(chǎn)的工藝研究較少，其成品的主要質(zhì)量指標(biāo)有：c p t 含量 9 2 ，干燥失重 o 5 ，熔點(diǎn)2 5 9 2 6 3 其中最主要的指標(biāo)是含量。c p t 含量的測(cè)定方法有分光光度計(jì)法”o3 、熒光法、紅外法、高效液相色譜法( p l c ) ?！? 四種。以高效液相色譜法先進(jìn)、方便、準(zhǔn)確，它是目前公認(rèn)的c p t 及類似物 碩士學(xué)位論文 m a s t e r s1 i l e s i s 的分析方法。 3研究進(jìn)展與工業(yè)化生產(chǎn) 從目前的研究情況和國(guó)內(nèi)外的研究趨勢(shì)來看，c p t 及類似物主要是靠從喜 樹中分離獲得，而喜樹堿是喜樹中一種天然次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量必將受到喜 樹生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境因素的影響。而過去人們一直著力于提取和產(chǎn)品的丌發(fā)，隨 著以c p t 市場(chǎng)的擴(kuò)大，生產(chǎn)c p t 及其類似物所需的原料將成為這一產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。 今后應(yīng)以c p t 及其類似物的代謝為核心，開展如下幾方面的研究工作，為c p l 的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)“。( 1 ) 喜樹基礎(chǔ)生產(chǎn)代謝研究。主要包括光和、呼吸及 水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)代謝的基本規(guī)律，特別是與c p t 代謝有關(guān)的n 代謝研究。( 2 ) 環(huán)境因子對(duì)喜樹生長(zhǎng)發(fā)育、基礎(chǔ)生理代謝的影響及相互關(guān)系。因?yàn)閏 p t 是一種 吲哚生物堿，為喜樹的次生代謝產(chǎn)物，一般認(rèn)為它的作用是植物抵御不良環(huán)境 條件的產(chǎn)物。因此開展脅迫生理的研究，將有助于為獲得高含量的原料提供理 論基礎(chǔ)。( 3 ) 以c p t 為核心的系數(shù)次生代謗 規(guī)律及其與基礎(chǔ)生理代謝之間的關(guān) 系。從目前植物生理研究的情況來看，次生代謝生理的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于基礎(chǔ)生 理代謝之問的關(guān)系。因此對(duì)喜樹堿合成的途徑、調(diào)控、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移和積累與分 解有待進(jìn)行深入的研究。( 4 ) 高喜樹堿含量無性系和種源選育。喜樹堿廣泛分 布于長(zhǎng)江流域，近年來各地都有引種，廣在種源選擇的基礎(chǔ)上進(jìn)行無性系選擇， 盡快為生產(chǎn)提高喜樹堿含量的優(yōu)良喜樹種源或無性系。 喜樹的工廠化技術(shù)研究方面的報(bào)道較少，應(yīng)借鑒其它物種的細(xì)胞工程技術(shù)， 進(jìn)一一步丌展喜樹的愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)、高含量細(xì)胞系篩選和喜樹堿 分離提純技術(shù)研究。 總之，通過喜樹細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)喜樹堿的研究雖然已經(jīng)取得進(jìn)展，但喜樹堿 的生產(chǎn)率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此如果結(jié)合基因工程、酶工程、 碩士學(xué)位論文 m a s t e r st 王e s i s 發(fā)酵j 程，在加上生物反應(yīng)器的使用，將會(huì)取得更大的突破。 本文以喜樹幼葉為材料，通過光照、激素以及多種理化因子對(duì)喜樹細(xì)胞懸浮 培養(yǎng)影響的研究，對(duì)其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量、生理生化特性進(jìn)行了比較系統(tǒng) 的眼，為獲得高水平的喜樹細(xì)胞生物量打下一些基礎(chǔ)。 碩士學(xué)位論文 m a s t e r s 咖s l s 第二章不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì) 喜樹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 1 材料與方法 1 。1 實(shí)驗(yàn)材料 供試植物材料喜樹( 國(guó)印 d 拍e c aa c 啪j 門a ad e c s n e ) 屬珙桐科旱蓮屬植 物，取自華中師范大學(xué)校園內(nèi)春天初發(fā)的幼嫩葉片。 l 2 愈傷組織的誘導(dǎo) 取春天3 月份初發(fā)的喜樹幼嫩葉片，清水沖洗干凈后，濾紙吸干，7 0 乙 醇浸泡3 0 秒后用o 1 升汞溶液消毒5 分鐘，無菌水沖洗數(shù)遍，切成4 4 m m ? 的小方塊，接種于含n 從1 0 m g l + 2 、4 一d o 5 m g l + k t o 5 m g 1 的b 5 培養(yǎng)基上 ( p h 5 8 ，高壓滅菌) ，于黑暗條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織，培養(yǎng)溫度為2 5 2 。 1 3 愈傷組織的篩選及細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于含2 0 m 1 固體培養(yǎng)基的5 0 m 1 三角瓶中，每瓶接種 量約為2 9 ，愈傷組織每3 0 天繼代一次，經(jīng)3 5 次繼代后，選擇生長(zhǎng)均一、質(zhì) 地疏松、分散性好的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2 5 0 m l 三角瓶中分裝 1 0 0 m l 液體培養(yǎng)基( 同上的固體培養(yǎng)基去掉瓊脂，以下實(shí)驗(yàn)沒有特別既明的都 用的是該種培養(yǎng)基) ，每瓶接種量約為2 9 ，懸浮培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為 1 2 0 r m i n ，置于光照條件下培養(yǎng)，每日光照1 0 一1 2 小時(shí)，光強(qiáng)為1 0 0 0 r u x ，溫 度為2 5 2 。 1 4 細(xì)胞干鮮重及生長(zhǎng)速率的測(cè)定 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)周期為3 0 天，培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)減壓過濾后測(cè)其鮮重，然后 將收集培養(yǎng)物置于6 0 的烘箱中烘干至恒重，稱其干重，換算成每天每升培養(yǎng) 基增加的細(xì)胞干重毫克數(shù)，即m g 1 ，表示細(xì)胞生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次 取其平均值計(jì)算結(jié)果。 2 結(jié)果 不同種類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)是不同的，即使同一 種激豢的不同濃度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)效應(yīng)也是不同的。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了單獨(dú)使用 n 從、k t 、2 、4 一d 、6 一b a 四種激素以及激素組合對(duì)喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)( 培養(yǎng)基 為b 5 液體培養(yǎng)基) 中細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)的影響。結(jié)果如下： 2 1n 從對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了七種不同的n a a 單因子濃度，其對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 結(jié)果如下： 表1 ：n a a 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) t a b l el ：e f f e c to fn a ao nc u lt u r a lc e ll g r o w t h n a a 濃度 oo 1o 2o 51 o2 o5 0 ( m g 1 1 ) 干重增加 2 1 78 4 51 0 6 52 3 0 01 1 6 41 0 3 09 8 4 ( m g d w 1 。1 ) 生長(zhǎng)速度 7 22 8 23 5 59 0 o3 8 83 4 33 2 8 ( m g d w 1 1 ) 由表l 可以看出，在選擇的濃度范圍內(nèi)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的n 從適宜濃度 為o 5 m g 1 ，而在0 5 m g l 以上時(shí)，隨著濃度的增加，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度卻趨于 f 降。這可能是因?yàn)楦邼舛萵 a a 促進(jìn)了細(xì)胞的分裂而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)所造成 的。 2 26 一b a 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了七種不同的6 一b a 單因子濃度，其對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響結(jié)果如下： 1 2 表2 ：6 一b a 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) t a b l e2 ：e f f e c to f6b ao nc u l t u r a lc e l lg r o w t h 6 一隊(duì)濃度 0o 1o 2o 51 0 2 05 o ( m g 1 。) 干重增加 2 1 71 4 2 99 4 19 7 39 7 35 5 54 2 l ( m g d w 1 1 ) 生長(zhǎng)速 7 24 7 63 1 33 2 43 0 11 8 51 7 3 ( m g d w 1 。) 由表2 可以看出，不同濃度6 一b a 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)不同，其中以6 一b a o 1 m g 1 最有利于培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 2 3k t 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了七種不同的k t 單因子濃度，其對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 結(jié)果如下： 表3 ：k t 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 t a b l e3 ：e f f e c to fk to nc u l t u r a lc e l lg r o w t h k t 濃度( m g 1 1 ) o0 1o 2 10 51 o2 05 0 干重增加 2 1 72 0 2 81 0 4 8l8 4 88 5 68 3 28 1 9 n g d w 1 1 ) 生長(zhǎng)速度 7 27 4 23 4 9l2 8 22 8 42 7 72 7 3 m g d w 1 1 ) 從表3 可以看出，k t 的濃度為o 1 m g l 時(shí)，最有利于喜樹細(xì)胞的生長(zhǎng)。而 在0 1 m g 1 時(shí)以上時(shí)，隨著濃度的增加，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度卻趨于下降。這可能 是因?yàn)榈蜐舛鹊膋 t 促進(jìn)了細(xì)胞分裂，從而增加生長(zhǎng)量，而高濃度k t 因?yàn)榧?xì)胞 分裂過于頻繁而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過大反而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)量的增加。 2 42 、4 一d 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了七種不同的2 、4 一d 。單因子濃度，其對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的 影響結(jié)果如下： 表4 ：2 、4d 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) t a b l e4 ：e f f e c to f2 、4 一do nc u l t u r a lc e l lg r o w t h 2 、4 一d 濃度 oo 10 2o 5 1 o2 o5 0 ( m g 一) 干重增加 2 1 71 0 1 86 8 95 6 8 8 4 45 3 l4 9 1 ( m g d w 1 1 ) 生長(zhǎng)速度 7 23 3 92 2 91 8 92 8 11 7 7 1 6 4 ( m g 1 ) w 一) 從表4 可知，在所選擇范圍內(nèi)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的2 、4 一d 適宜濃度為 0 1 m g 1 。在大于o 1 m g 1 濃度時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度都降低。造成這種現(xiàn)象可 能是因?yàn)楦邼舛? 、4 一d 促進(jìn)了細(xì)胞的分化而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)所造成的。 2 5n 從與k t 組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表5 ：n a a 與k t 組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) t a b l e5 ：e f f e c to fn a aa n dk to nc u lt u r a lc e l1 g r o w t h n a a ( o 5 ) + k t xo 0 50 1o 2o 30 51 o2 0 ( m g 1 1 ) 干重增加 4 9 77 8 79 6 41 2 5 02 5 4 03 1 0 01 5 3 2 ( m g d w 1 。) 生長(zhǎng)速度 1 5 62 6 23 2 14 1 78 4 71 0 3 35 0 1 ( m g d w 1 1 ) 從表5 可以看出，當(dāng)組合中k t 濃度在o 0 5 一1 o m g 1 范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速 度隨著濃度增加而增加；在k t l o m g l 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快；而在大于 1 o m g 1 時(shí)，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低。同時(shí)我們可以看出，n a a 和k t 組合使用比 單獨(dú)使用更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中以n 從0 5 m g 1 + k t l o m g 1 最有利于細(xì)胞 的生長(zhǎng)。 2 6n 從與6 一b 組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表6 ：n 從與6 一b a 組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 碩士學(xué)位論文 m s t e r s t 璐f 5 t a b l e6 ：e f f e c to fn a aa n d6 一b ao nc u lt u r a lc e l1 g r o w t h n a a ( o 5 ) + 6 一b a x0 0 5o 1o 20 3o 51 o2 o ( 雌1 1 。) 干重增加7 5 0 9 0 31 5 5 11 8 6 82 7 0 01 2 7 07 6 4 ( m 出d w 1 1 ) 生長(zhǎng)速度2 53 0 15 1 76 0 39 0 o4 2 32 5 5 ( m g d w 1 - 。) 由表6 可以得知，當(dāng)組合中6 一b a 濃度在o 0 5o 5 m g l 范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng) 速度隨著濃度的增加而增加：在6 一b a 濃度為o 5 m g 1 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快； 而在6 一b a 為o 5 m g 卜2 o m g l 時(shí)，隨著6 一b a 濃度的增加，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度不 斷下降，同時(shí)也可以看出，n a a 與6 一b a 組合也比單獨(dú)使用效果更好。 3 討論 從以上實(shí)驗(yàn)部分可以看出，不同化學(xué)因子對(duì)喜樹培養(yǎng)細(xì)胞有很大的影響 其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)起著重要而明 顯的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也得到了驗(yàn)證，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類以及濃 度對(duì)不同的植物有不同的效果。在喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中單因子以n a a 的效果最 好，其中n a a 最佳濃度為o 5 m g 1 組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)， 以n a a 0 5 m g 1 + k t 0 1 m g l 的效果最佳，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快。從結(jié)果可以看出， 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)并不是濃度越高，種類越多效果就越明顯，對(duì)不同的植物應(yīng) 選擇相應(yīng)的種類和適宜的濃度。 外源激素的添加對(duì)于植物組織生長(zhǎng)、分化及次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控具有重要 作用。目前，對(duì)于激素作用機(jī)理的研究不太少，不過通過添加不同種類和濃度 外源激素來調(diào)控生長(zhǎng)、分化和代謝已取得了一定規(guī)律性認(rèn)識(shí)“。一般來講，低 濃度的生長(zhǎng)素有利于次生代謝，而2 、4 d 則會(huì)抑制次生代謝，赤霉素很少用 于培養(yǎng)基，但其對(duì)于某些萜類的產(chǎn)生確實(shí)必要，青蒿毛狀根培養(yǎng)基添加適量的 赤霉素可明顯的促進(jìn)發(fā)根生長(zhǎng)和青蒿素的產(chǎn)生。細(xì)胞激動(dòng)素的作用也不明確， 碩士學(xué)位論文 m a s t e r s 1 【e s i s 但秋水仙堿在未分化的培養(yǎng)物中可導(dǎo)致多倍體生成，細(xì)胞體積增大，使香葉天 竺葵中單萜的產(chǎn)量明顯提高。除生長(zhǎng)素和激動(dòng)素外，乙烯對(duì)歐亞唐松草培養(yǎng)中 小蘗堿的積累起明顯促進(jìn)作用，而且通過調(diào)節(jié)4 一氫小蘗堿氫化酶的活性來達(dá) 到。隨著人們對(duì)激素作用機(jī)理的深入了解i 在應(yīng)用激素進(jìn)行生長(zhǎng)、代謝的調(diào)控 上將逐步走向必然。 1 6 碩士舉住論文 m s t e r st l 怔s i s 第三章不同光照對(duì)喜樹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 生長(zhǎng)效應(yīng)及生理生化特性的效應(yīng) l材料與方法 1 1 喜樹愈傷組織的誘導(dǎo) 供試植物材料喜樹( ( 1 a 印f d e c aa c 啪j 加招d e c s n e ) 取自華中師范 大學(xué)校園。取喜樹幼嫩葉片，清水洗凈后，濾紙吸干，7 0 酒精浸泡3 0 秒后用 0 1 升汞消毒5 分鐘，無菌水沖洗數(shù)遍，切成o 5 0 5 c m 2 的小塊，接種于含 n 從1 0 m g 1 、2 、4 一d o 5