（森林保護(hù)學(xué)專業(yè)論文）歐美楊108再生體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)天花粉蛋白基因的研究.pdf

摘要 歐美楊系列是中國林科院引進(jìn)的楊討新品種。因其品質(zhì)優(yōu)良，已通過圜家級技術(shù)鑒 定，被國家林業(yè)局列為我國西部及華北地區(qū)重點推廣樹種。但是，隨著歐美楊的廣泛栽 培，病蟲害的發(fā)生越來越嚴(yán)重，因此其抗性育種顯得尤為迫切。采用基因工程技術(shù)開展 轉(zhuǎn)基因楊樹的研究，是培育抗逆、抗蟲和抗病楊樹新品種的有效途徑。 本研究以歐美楊1 0 8 無菌苗為材料，通過對基本培養(yǎng)基的篩選、激素種類和濃度的 調(diào)整，培養(yǎng)條件的選擇等優(yōu)化了歐美楊1 0 8 再生體系的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。在此基礎(chǔ) 上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，進(jìn)行抗病蟲天花粉蛋白( n i c h o s a n f h i n ，t c s ) 基因的遺 傳轉(zhuǎn)化研究。探討了影響轉(zhuǎn)化效率的若干因子，首次建立了以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 ( h p t ) 為選擇標(biāo)記基因的歐美楊1 0 8 遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并獲得了抗性愈傷和抗性芽，經(jīng) p c r 和p c r s o u t h e r n 檢測證明目的基兇已經(jīng)整合到歐美楊1 0 8 基因組中，為進(jìn)一步 開展歐美楊1 0 8 遺傳轉(zhuǎn)化打下了理論基礎(chǔ)。主要研兔結(jié)果如下： 通過篩選得到了優(yōu)化的n 1 片分化再牛培養(yǎng)基、莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽生 根培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。葉片分化時，采用m s 培養(yǎng)基附加o 6 m g | 16 一b a 和o 2 m gl ， n a a ，在光照條件下培養(yǎng)；莖段愈傷組織誘導(dǎo)時，采用w p m 培養(yǎng)基附加1 5m gl 。12 ， 4 一d 和0 7 5m g l 1k t ，在光照條件下培養(yǎng)：不定芽牛根和繼代生根時，均采用w p m 培養(yǎng)基附加一定量的i b a ，在光照條件下培養(yǎng)。在這些培養(yǎng)基上外植體的分化率、誘導(dǎo) 愈傷率以及生根率均達(dá)到了1 0 0 ，而且生睦狀況優(yōu)良。 確定了篩選歐美楊1 0 8 轉(zhuǎn)化體及選擇牛根培養(yǎng)時的抗生素濃度。潮霉素抑制葉片分 化的濃度為2m gl ；生根培養(yǎng)時的選擇濃度為o 2m g l 。比較了頭孢唑啉鈉和羧卞 青霉素抑菌效果及對葉片分化和苗水牛根的影響，結(jié)果表明頭孢唑啉鈉和羧卞青霉素濃 度分別為6 0 0m g l 。1 和4 0 0m g l 1 時，可完全抑制農(nóng)桿菌l b a 4 4 0 4 的生長：在此濃度 下頭孢唑啉鈉對葉片的分化影響較羧卞青霉素大，而對苗術(shù)的生根影響較羧卞青霉素 小。因此，在葉片分化時，采用4 0 0m g l 1 的羧卞青霉素抑菌：在生根時，采用6 0 0 m g l 的頭孢唑啉鈉抑菌。 最后，探討了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，首次建立了以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶( h p t ) 為選擇標(biāo)記基因的歐美楊1 0 8 的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化歐美楊1 0 8 葉片外植體，芡得到1 8 個潮霉素抗性愈傷和抗性芽，轉(zhuǎn)化效率為4 3 ?？剐泽w經(jīng)p c r 和p c r s o u i h e m 檢測，證實t c s 基因已經(jīng)整合到歐美楊1 0 8 的基因組中。 關(guān)鍵詞歐美楊1 0 8 ；再生體系；t c s 基因；根癌農(nóng)桿菌：遺傳轉(zhuǎn)化 a b s t r a c t p o p 】a r i so n eo fl h ei m p o n a n ls y l v i 吼1 1 t u r a la n dc o m m e r c i a li f e e ；i tj sv e r yp o p u l a r t h r o u 曲o u tt h ew o n d ，e s p e c i a l l yi nc h i n a f 坳礎(chǔ)g f r 口m 口咖n 1 0 8i sak j n do f h y b n ds c r a i n f m m j 口9 p l f 嵋以i g ma n dp 叩d z 盯如f 加脅i ti st h em a i ns l r a i nw h i c hh a sb e e np o p u l a r j z e df o r i t s 1 1 i g hv a l u e s 吼1 c ha sg r o w i n gf a s t ，h i 曲r e s i s f a n c e ，l o n gf i b 陀e t c _ b y 【h es t a t ef o r e s i r y a d m i l l i s 【r a t i o n w i t ht h em o s tw i d e l yc u l t i v a t i o no fp i 印“缸se “r n 小e r i c l l1 0 8 ，t h ea r i s i n go f p i a n ld i s e a s e sa n dp e s t sw e r em o r ea n dm o r ef r e q u e n i t h er e s e a f c ho fg e n et r a n s f o r m a c i o no n p o p l a rb yg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n i q u ei sae f f e c t i v ew a yf o rt h es e l e c “o no fn e ws p e c i e so f p o p l a rw i i ht o l e r a n c e ，i n s e c t r e s i s c a n 【a n dd i s e a s e - r e s i s n t ， i nf 1 1 i ss t u d y ， l e a fa n ds t e mo f 月n p “厶f sp r 口州盯j c 盯“1 0 8w e r eu s e da se x p e m e n t m a t e t i a l ，t h r o u g ht h es c r e e n i n gt ot h eb a s i cc u l 【u r em e d i u m ， c h ea d j u s c m e n lo fb o r m o n ek i n d a n dp r o p o r t i on ic h o i c eo fi h ec u l t u r ec o n d i t i o n ，t h em e d i u ma n dt h ec u i t u r ec o n d i t i o no f f 3 印“厶f ，已f ，p r i c 口甩1 0 8r e g e n e r a c i o ns y s t e mw e r eo p t i m i z e d o nt h eb a s i so ft h ee s t a b n s h m e n to fh i g hf r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e m ，a d a p “n gt o a g r o b a c t e r i u m m e ( i i a t e dt oc o d u c tl r a l l s f 0 唧a t i o no fi n s e c t r e s i s t a n c ea n dd i s e a s e r e s i s t a n c e g e n e so ft c sg e n e t h f o u g he x p l o r i n gt h ef a c t o r sa f f e c l i n g 【h 。g e n e t i ct r a n s f o r m a c i o n ，t h e t r a n s g e n i cs y s t e 巾，w h i c hs e l e c f sh p ta st h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ，w a se s t a b l j s h e da n dt h e r e s i s t a n ls h o o tw e f ea l c a i n e df o rl h ef i r s tt i m e t h er e s i s t a n ts h o o i sw e r ei d e n l i f i e db yp c ra n d p c r s o u t h e ma n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt c sg e n eh a db e e ni n t e g r a t e di n i op f 甲“z h s e “陽州e 廣記n n n1 0 8g e n o m e t h em a i nc o n d u s i o no ft h i se x p e f i m e n tw a sa sf 0 i l o w i n g ： t h m u 曲t h es c r e e n i n g i o t h r o u 曲t h es c r e e n i n g t ot h eb a s i cc u l t u r em e d i u m ， t h e a d j u s l m e n to f h o f n l o n ek i n da n dp f o p o r t i o na n dc h o i c eo ft h ec u l t u r ec o n d i t i o n ， t h eo p t i m a l m e d i u ma n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o nw e r ea t t a i n e d t h eo p t i m a lm e d i u mf o rd i f f e r e n t i a i i o nf r o ml e a fd e v e df r o mi nv “r 0c u l l u r e dw a sm s + 6 一 b ao 6m g l 一1 + n a a0 2 m g l i h eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o nf m ms c e ma n d k a f s t a l kw a sw p m + 2 ，4 一d1 5m g l 1 + k to 7 5 m g l 一t h eo p t i m a lm e d i u mf o rr o 。t i n d u c t i o nw a sw p m + 0 4m 2 li b at h e yw e r ec u l t u r e du n d e rt h e c o n l r 0 1 l e dc o n d i t i o no f 2 5 1 w i t h2 0 0 01 xo fs u c c e s s i v el i 曲t d i f f e f e n l i a t i o nr a t e ，c a l l u si n d u c t i o nr a t ea n da n d r o o ti n d u c t i o nr a t ci n d i v i d u a lw a su pt o1 0 0 t h e a p p r o p f i a t e c o c e n t r a t i o no f h y gf o r s e l e c t i o nc u l t u r ew a sd e t e r m i n e d t h e d i f f e r e n t j a l i o o fl e a fe x p l a n l sw a si n h a b i t e do nd i f f e r e n l i a i i o nm e d i u mc o n t a j n i n g2 m lh y g ； a l ls h o o t st h a tw e r ci r a n s f e r f e dt or o o t i n gm e d j u mc o n i a i n i n g0 2 m g lh y gw e r ei n h i b i t e d c o m p l e t e l yt om 0 i ， t h ee f f e c to fc e f o l a x i m ea n d ( 、a f b e n i c i ni nd i f | k r e n ic o n c e 口t r a “o nw a se v a l u a t e do n i n h i b i l i n ga g r o b a c t e r i u ml b a 4 4 0 4g f o w t h ，t h ei e a fd i f 艷r e n i i a t i o na n df o o t i ts h o w e dt h a t a g r o b a c t e r i u m l b a 4 4 0 4c u l t u r e do ns o l i dd i f f b r e n t i a t i o nm e d i u m c o n i a i n i n g6 0 0 m l c e f o t a x i m eo r4 0 0 m g l 1 c a r b e n i c i l l i nw a sk i l l e d ；i n 【h ec o n c e n t r a t i o nt h ee f f e c to fc e f o t a x i m e t ol e a fe x p l a n t sw a so b s e r v e dt h a nh i 曲e ft h a to fc a r b e n i c i l l i na n dl h ee f f e c io fc e f o t a x i m et o s h o o tm o t i n gw a so b s e e dc h a i l1 e s st h a to fc a r b e n i c i l l i n s ot h ep r o p e ri n h i b “a g r o b a c t e r i u m l b a 4 4 0 4c o n c e n t r a t i o nw a s4 0 0 m lc a r b e n i c i l l i ni nl e a fd i f 托r c n t i a t i o na n d6 0 0 m l c e f o t a x i m ej ns h o o tr o o t i n g a tl a s t ，t h m u g he x p l o r i n gt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h eg e n e l i ct r a n s f o 呻a t i o n ，t h et r a n s g e n i c s y s t e m ，w h i c hs e l e c l sh p ta st h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ，w a se s t a b l i s h e d a d a p t i n gt o a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt ot r a n s f o r l l lt h e1 e a fe x p l a n l s ，1 8r e s i s t a n ts h o o t sw e r co b t a i n e da n d t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yw a s4 t 3 1 1 】er e s i s t a n ts h o o t sw e r ei d e n t i f i e db yp c ra n dp c r s o u m e r na n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt c sg e n eh a db e e n i n t e g r a t e di n t o 腳“a 5 d 盯m 甜f c n h n1 0 8g e n o m e k e y w o r d s 尸印“覷s 出f 陽卅p r l c 口以n1 0 8 ；r e g e n e r a t i o ns y s t e m ；t ( 1 sg e n e ；a 矽_ d 6 口c 盯m 小 t u m e f a c i e n s ；g e n e t i ct m n s f o r m a t i o n i i i 中英文對照表 吾二_ 石i 面麗面i 忑一 乙酰丁香酮 6 b a6 一b e n z v l a d e n i n e 6 一二常基嘌呤 c a r b e a r b e n i c i i i i n羧卞青霉索 c e f c e f o l a x i m e頭孢毒素 i b ai n d o l 曲u t v r i ca c i d 吲哚一3 一丁酸 k a nk a n a m v c i n 卡那毒素 m s m u r a s h i 譬ea n ds k o o gm e d i u m m s 培養(yǎng)基 n a a d n a d h t h a l e n a c e l i ca c i d奈乙酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c rp o l v m e r a s ec h a i nr e a c c j o n 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) r m p r o u n dp e rm i n u t e轉(zhuǎn)每分 2 ，4 d2 ，4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e “ca c i d 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 k t k i n e t i n激動素 z tz e a t i n 玉米素 t d zt h i d i a z u r a 噻苯隆 g ag i b b e r e l i i n s 赤毒素 h y g ( h p t ) h y g r o m y c i n 潮礴素 e d t ae c l l l e n e d i a m i n ed i s o d i u mt e t r aa c e t a l o 乙二胺四乙酸 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基黃酸鈉 s f r e ps t r e p t o m y c i n 鏈霉素 r i fr i f a m d i c i n 利碣平 e b e 山i d i u mb r o m i d e溴化乙錠 c r a b c e t v l t r i m e c h y la m m o n i u mb r o m i d e 溴化十j 六烷基三甲翠胺 g u s 0 一g l u c u r o n i d a s e 葡萄糖醛酸糖苷酶 t c st r i c h o s a n t h i n 天花粉蛋白 r i p r i p b o s o m ej n a c t i v a l i n gp m t e i n 核糖體失活蛋白 ! 坐竺堡! 塑! ! ! ：竺! 生! ! ! 竺! ! ! 竺竺! ! ! ! 三鱉莖氫墨! 壁 - v i l 緒論 1 緒論 楊樹隸屬于楊柳科( s a l i c a c e a e ) 楊屬( 腫舢 ) ，是多年牛水本植物，是世界上三 大速生樹種之一，泛分布在北半球。它不僅是重要的經(jīng)濟(jì)物種，可用于生產(chǎn)木材、纖 維及能源，還在水土保持和維護(hù)生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)形態(tài)學(xué)、地理位置 及雜交模式，楊屬可分為五大派系：白楊派、黑楊派、青楊派、胡楊派及大葉楊派。 據(jù) 止界糧農(nóng)組織( f a o ) 統(tǒng)計，歐洲不少人工林部是由楊樹組成，楊樹已成為這些 國家彌補森林資源缺乏，解決水材急需的豐要樹種和商業(yè)速生林的標(biāo)準(zhǔn)材料。我國大部 分地區(qū)處于溫帶地區(qū)，楊、柳、榆、槐、椿等被譽稱為“黃河流域5 大造林樹種”，其 中以楊樹資源最為豐富，現(xiàn)已成為世界上楊樹人工林面積最大的國家i z j 。 目前中國楊樹人工林占全國人工林面積的1 ，5 ，是世界其它各國楊樹人工林總面積 ( 1 4 0 萬h m 2 ) 的四倍( 6 6 7 萬h m 2 ) 。但是，隨著楊樹的廣泛栽培，病蟲害的發(fā)生越來 越嚴(yán)重，楊樹抗：眭育種顯得更加迫切，歐美楊也面l 臨著同樣的問題。到目前為止，我國 有記載的楊樹害蟲有3 2 0 余種，主要：扁害約5 0 余種。隨著農(nóng)藥的濫用，一些病蟲的抗 藥性增強(qiáng)，致使楊樹病蟲害更加嚴(yán)重p “，桔葉病、潰瘍病、楊扇舟蛾、楊小舟蛾、天 牛等病蟲害已嚴(yán)重威脅著包括歐美楊在內(nèi)的許多楊樹的生長與術(shù)材質(zhì)量。單純依靠常規(guī) 育種和噴灑農(nóng)藥的方法不僅不能從根本上解決問題，而| = i 會給環(huán)境帶來更嚴(yán)重的污染。 隨著分子牛物學(xué)的發(fā)展和楊樹組織培養(yǎng)技術(shù)的口趨成熟，人們紛紛把目光轉(zhuǎn)向基因 工程，希望在短期內(nèi)達(dá)到改良品種的目的。況且隨著世界人口迅速增長，牛態(tài)環(huán)境破壞 的 1 益加刷，以及地理和氣候條件的限制，楊樹抗性育種顯得更加迫切，已引起國內(nèi)外 林水研究者的普遍關(guān)注。因此查明楊樹抗性的生理生化機(jī)制及其遺傳因素，尋找提高抗 性措施，尤其是利用基因工程技術(shù)進(jìn)行楊樹抗肚育種( 包括抗病蟲、抗寒凍、抗旱、抗 鹽堿等) ，是當(dāng)代林木分子生物學(xué)研究的重要課題之一。它不僅在基礎(chǔ)理論上具有重要 意義，在解決生產(chǎn)實際問題上也具有廣泛的應(yīng)用價值【6 j 。 1 1 楊樹組織培養(yǎng)。 早期楊樹的組織培養(yǎng)主要是進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)，這是由于愈傷組織易獲得且易保 存【7 1 。但從愈傷的誘導(dǎo)到獲得完整植株所需時間長，培養(yǎng)程序復(fù)雜，易發(fā)生變異，影響 楊樹組織培養(yǎng)研究的有關(guān)因子不利于保持親本性狀也不利于擴(kuò)大繁殖。為了大量繁殖優(yōu) 良樹種，愈傷培養(yǎng)逐漸被器官培養(yǎng)所替代。通過器官培養(yǎng)不僅對幼嫩植株還對成熟林水 實現(xiàn)了擴(kuò)繁，其中芽的組織培養(yǎng)比較穩(wěn)定，變異率低，在楊 對的組織培養(yǎng)中較為常用。 至今楊樹已成為林術(shù)組織培養(yǎng)中研究最為廣泛的樹種之一。 1 1 。1 影響楊樹組織培養(yǎng)的因素 影響?zhàn)h樹組織培養(yǎng)的因素有很多，最為主要的有外植體材料、培養(yǎng)基種類、外源激 求北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位滄文 素以及培養(yǎng)條件等。 1 1 1 1 外植體材料 理論上每一個植物細(xì)胞都具有再生成完整植株的能力，即細(xì)胞全能性。但在實際應(yīng) 用中，組織的再生受植株遺傳因素、基因型和外植體本身的生理生化狀態(tài)等多種因素的 影響l 。 ( 1 ) 外植體種類及其基因型：外植體的遺傳因素即外植體來源的植株種類及其基 因型是影響芽、苗再生及其植抹再牛的重要因素。c o l e m a n 等將1 6 種不同基因型的美 洲黑揚僻如加脅s ) 莖段接種在附加o 5m g i 。“z t 的培養(yǎng)基中，有6 種難誘導(dǎo)，4 種 誘導(dǎo)率達(dá)5 n 以上，其條6 種則介于3 至2 3 之間【j j 。 ( 2 ) 外植體c 體植株和外植體本身的生理生化狀態(tài)：這兩者的差異主要是由供體 植物的年齡、發(fā)育階段、生氏環(huán)境和外植體取材的部位等引起的。 植物個體發(fā)育經(jīng)歷幼態(tài)期、成熟期和衰老期，植物的營養(yǎng)繁殖能力于幼態(tài)因素有 關(guān)，一般材料愈年幼營養(yǎng)繁殖就愈容易。但林木不同于草本植物，生長周期長，幼苗成 年后的性狀不易預(yù)測，有時不得不從成年的優(yōu)良大樹上直接選取幼嫩部分或先復(fù)幼再取 外植體i l 。 外植體供體植株生長環(huán)境影響它的牛理狀態(tài)。因此即使使用相同類型的外植體，其 苗水再生能力也會有差異。1 9 9 5 午鄭均寶等用乍根和未生根試籬植株的葉片進(jìn)行芽的誘 導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)字長條件一一致時1 ：限試管植詐的葉片分化情況較好，產(chǎn)牛的不定芽數(shù)量多且 粗劃1 “。 同一植株上不同器官的再生能力有所不同。如白楊及白楊雜交系的實生苗，其下胚 軸和莖尖分化芽的能力高于子時和葉片舊。即使同一器官的不同部位。再生能力也有差 異。1 9 8 0 年陳維倫等對山新楊( 尸如刪冊p 6 d 胎l d u c n e ) 葉外植體分化的研究 表明，帶有葉柄的下段( 極易在葉柄的切口上形成芽) 分化成芽的頻率最高，達(dá)7 0 左 右，而中、上段( 芽從葉脈上產(chǎn)生) 的分化頻率極低l l “。 ( 3 ) 外植體的大小及其性別也會影響苗木的再生能力：如緣毛楊( 尸c f ，i 口船) 的雌 株再牛能力比雄株高。不過這種差異不是絕對的，白楊及其雜交系的雄株和雌株( 1 6 3 0 ：i i ) 上的芽的再牛能力就沒有顯著差別【l 。 ( 4 ) 外植體的極性：植物的極性現(xiàn)象有著j 泛的作用和影響，造成極性原因之一 是植物組織中某些化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出梯度的存在。這種極性效應(yīng)當(dāng)然也會反映到外植體 上。芽、苗形成的位置有時取決于外植體接觸培養(yǎng)基的位置。當(dāng)外植體以它形態(tài)學(xué)的基 部放在培養(yǎng)基上，從遠(yuǎn)離基部的表面誘導(dǎo)出芽、苗數(shù)目較多。 有些植物的極性表現(xiàn)并不如上述例子那么明顯，尤其是使用了植物激素之后，極性 效應(yīng)將會受到影響【8 j 。 1 1 1 2 培養(yǎng)基種類及外源激素 培養(yǎng)基和外源激素是影響楊樹組織培養(yǎng)的重要因素，適宜的培養(yǎng)基和濃度是楊樹組 培成功的關(guān)鍵， 1 緒論 ( 1 ) 培養(yǎng)基：楊樹組織培養(yǎng)中，m s 和w p m 培養(yǎng)基較為常用。它們富含植物所 需的鹽類，其中m s 又可按鹽濃度分為1 4 m s 、l 2 m s 和m s 。1 4 m s 和1 2 m s 在 誘導(dǎo)楊樹試管苗生根時常用。這是由于高鹽濃度對某些楊樹的生根不利。此外還有一種 大量元素減半的1 2 m s 培養(yǎng)基，豐要用于芽的誘導(dǎo)。雖然m s 和w p m 在楊擗的組 織培養(yǎng)中常用，但都含較高濃度的銨離子。在有些楊樹如雜交楊( p n f b p f 陀川f l f n j 和雜 交楊僻打i 拍。c 印“p c 據(jù)加i b j 的組織培養(yǎng)過程中，銨離子會富集在葉或莖段內(nèi)，不利 予愈傷組織的誘導(dǎo)【1 ”。因此應(yīng)根據(jù)材料來源、實驗?zāi)康膩磉x擇培養(yǎng)基。 ( 2 ) 碳水化合物：碳水化合物既是重要的能源物質(zhì)，還在組織培養(yǎng)中起著滲透勢 調(diào)聲的作用。一般植物細(xì)胞內(nèi)的滲透勢是通過無機(jī)離子和有機(jī)分子調(diào)節(jié)的，其中包括有 機(jī)酸、糖和糖醇。由于細(xì)胞質(zhì)的無機(jī)離子濃度保持相對穩(wěn)定，因此，細(xì)胞質(zhì)的滲透適應(yīng) 性主要靠無毒的有機(jī)分子的積累來完成，楊樹組培中通常使用蔗糖便是其中之一，用量 一般為2 0 4 0 9 l 1 。為了促進(jìn)毛白楊休眠芽牛長，也有使用糶糖作碳源的。 ( 3 ) 植物生長潿節(jié)物質(zhì)：在組織培養(yǎng)中較常用的植物生長凋節(jié)物質(zhì)有植物生長素 和細(xì)胞分裂素。植物生長索是啟動細(xì)胞分裂素的重要激素，換句話說，生長素在植物細(xì) 胞脫分化、形成愈傷組織或胚性細(xì)胞團(tuán)的過程中是不可缺少的物質(zhì)。植物牛長素作為細(xì) 胞分裂素的啟動劑最先對其產(chǎn)牛影響，它與含精氨酸高的組蛋白結(jié)合，使部分受阻遏 的基因解除抑制：狀態(tài)而活化，從而恢復(fù)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，最終形成酶和蛋白質(zhì)。細(xì)胞分裂素 能使已經(jīng)脫分化的細(xì)胞保持持續(xù)的有絲分裂，從而使細(xì)胞團(tuán)能夠進(jìn)行繼代培養(yǎng)。進(jìn)一步 標(biāo)記化合物研究細(xì)胞分裂素的作用時，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期中細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)作用發(fā)牛在 有絲分裂的準(zhǔn)備期。 在楊樹上常用的植物生長生長素有：奈乙酸( n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ，n a a ) 、吲哚 一3 一丁酸( i n d o l e b u t v r i ca c i d ，i b a ) 和2 ，4 一二氯苯氧乙酸( 2 ，4 一 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d ，2 ，4 一d ) 。n a a 和l b a 廣泛用于楊樹的生根，并能與細(xì)胞 分裂素q ：作促進(jìn)芽的增殖。2 ，4 一d 對楊樹愈傷組織的誘導(dǎo)有效，但對器官的分化不 利。楊樹上常用的細(xì)胞分裂素有激動素( k i n e t i n ，k t ) 、6 芐基嘌呤( 6 一 b e n z v l a d e n i n e ，6 一b a ) 和玉米素( z e a t i n ，z t ) 等。6 一b a 在楊樹芽的誘導(dǎo)方面應(yīng)用 很廣，己誘導(dǎo)十余種楊樹成苗，但電有報道認(rèn)為它不利于某些楊再生芽的形成i l ”。此 外類細(xì)胞分裂素t d z 也正被用于楊樹的組織培養(yǎng)，它促進(jìn)腋芽增殖和不定芽分化， 阻礙芽的伸長【l ，在楊樹組織培養(yǎng)中應(yīng)用潛力很大，極低濃度時就可誘導(dǎo)毛白楊葉外植 體產(chǎn)生大量的芽。與6 一b a ( 0 2 5 m 2 l _ 1 ) 混合使用誘導(dǎo)芽分化時，用低濃度的噻苯隆 f r h i d j a z u m ，t d z ) ( 0 0 0 5m g - l 。) 代替價格昂貴的玉米索( o 2 5m g l 1 ) ，可達(dá)到或超 過玉米素的效果i l 。除生長素與細(xì)胞分裂素外，其它生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物的生長也有一 定影響：如赤霉素( g j b b e r e l l i n s g a ) ，盡管它不促進(jìn)楊樹芽的分化，但可促進(jìn)芽的仲 長生長。 1 1 1 3 培養(yǎng)條件及其它因素 影響楊樹組織培養(yǎng)的條件有兩方面：一是光照和溫度。光照和溫度對植物的形態(tài)建 東北輛也丈學(xué)碩士j 主位論文 成有著重要的調(diào)控作用，而且光、溫度二因素往往是連在一起相互作用。植物組織培養(yǎng) 一般是在日光燈( 光強(qiáng)1 0 0 0 一5 0 0 0 l x ) 1 6 h 光照下進(jìn)行。光強(qiáng)影響某些楊樹的形態(tài)發(fā) 生。有時弱光或全黑，會促進(jìn)愈傷組織分化和根的再生l z 。還有研究報道，光質(zhì)對茁的 再生也有影響，其最有利的光譜成分是藍(lán)光區(qū)，而對根的發(fā)生則是紅光區(qū)較有利。大部 分組織培養(yǎng)的溫度為2 5 。過高的溫度會導(dǎo)致分化芽出現(xiàn)玻璃化苗，低則使苗乍長緩 慢。 二是季節(jié)性變化。外界環(huán)境對植物中命有著廣泛而深刻的影響，植物體通過適虛環(huán) 境發(fā)展出一套接受環(huán)境信號( 包括季節(jié)變化) ，并可通過傳遞和放大變成各種代謝“語 言”，是植物體作出靜種反應(yīng)機(jī)制，季節(jié)性變化對組織培養(yǎng)中器官發(fā)生的影響是明顯 的，大多數(shù)植物應(yīng)在其生長開始的季節(jié)采樣較好，在生長末期或己進(jìn)入休眠期，則采樣 的外植體在培養(yǎng)中反應(yīng)遲鈍或不能培養(yǎng)成功心j 。 1 1 2 楊樹組織培養(yǎng)的意義 目前，組織培養(yǎng)在楊樹上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：第，難生根樹種的擴(kuò) 大繁殖，如白楊系，因根蘗繁殖率低、扦插生根困難而難以運用傳統(tǒng)方法大量繁殖。若 用組織培養(yǎng)的方法，通過改變外植體的牛長條件則可在短期內(nèi)獲得大量組培茁。第 二，種質(zhì)保存。運用組織培養(yǎng)的方法，控制植株的生長速度，不僅能避免種質(zhì)資源受病 蟲害的侵襲，邁能節(jié)省人力和空間。此外，楊紂組織培養(yǎng)系統(tǒng)司作為一種模式體系，來 分析基圈轉(zhuǎn)移，體細(xì)胞變異等方面存在的問題，研究林，l 二生長、分化及幼嫩、成熟和復(fù) 幼的分子機(jī)制等。j 。 1 2 楊樹抗病蟲基因工程研究進(jìn)展 自從1 9 8 6 年p a r s o n 等人證實了楊樹可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和外源基因在高等植物細(xì)胞 中的表達(dá)以來，林木基因工程得到了迅速的發(fā)展，尤其是以楊樹的基因工程進(jìn)展最為迅 速【2 0 】。 1 9 8 7 年，f i l l a t t i 從沙門氏桿菌中提取了抗除草劑的d n a ，用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到楊 樹雜種無性系( 尸印“n u 口f 6 日xp 咖h 脅m ) 中，獲得一批能抗除草劑草甘膦的楊樹植 株【2 “。j 9 8 7 年，美國首次報道成功地將抗除草劑基因?qū)脬y白楊大齒楊的雜種無性 系中并進(jìn)入田問試驗，隨后又成功地：i 哿抗除草劑的基因轉(zhuǎn)入美洲黑楊。目前，轉(zhuǎn)基因的 美洲黑楊已在密西西比河流域的一些地區(qū)栽培1 2 2 1 。1 9 8 8 1 9 8 9 年，美國依阿華大學(xué)成 功地將b t 基闋和蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)到楊樹雜種中，獲得了楊樹抗蟲轉(zhuǎn)基因植株1 2 “= 其作用機(jī)理是b t 基因在芽孢形成過程中，產(chǎn)生伴胞晶體，其中含有高度特異殺蟲活性 的結(jié)晶蛋白，能使昆蟲幼蟲的腸道內(nèi)蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化為毒性多肽分子。 楊樹基因工程研究進(jìn)展較快一方面是因為楊樹在全世界栽培面積廣；另一方面是 因為楊樹組織培養(yǎng)l 作較為系統(tǒng)成熟，一旦獲得轉(zhuǎn)化植株即可迅速推廣，供進(jìn)一步研究 乃至生產(chǎn)應(yīng)用。楊樹甚至可被看作是林水轉(zhuǎn)基因研究的模式植物。到目前為止，人們利 用各種轉(zhuǎn)化方法已獲得了抗除草劑、抗蟲、抗病等一系列轉(zhuǎn)基因植株。 緒滄 1 2 1 楊樹抗病基因工程 楊樹的抗病基因工程研究是從8 0 年代開展的，目前克隆的抗病基因主要分兩類： 即抗病毒基因和抗菌基因?？共《净虻难芯恐饕强寺〔《就鈿さ鞍谆?，通過外殼 蛋白基因的導(dǎo)入，并借助交叉保護(hù)作用機(jī)理，達(dá)到降低病毒侵染的目的。1 9 9 3 年英國牛 津大學(xué)c o o p e r 研究小組克隆了楊樹花葉病毒( p m v ) 的外殼蛋白( c p ) 基因，目的是 ：烙編碼p m v c p 基因?qū)霔顦?，在楊樹體內(nèi)產(chǎn)生c p 蛋白，對楊樹p m v 的侵染起到 一種類似于免疫學(xué)的交叉保護(hù)作用【“】。奧地利農(nóng)林大學(xué)的科研人員把歐洲和整個地中海 地區(qū)核果類樹易感染的洋李痘病毒( p p v ) 的c p 基因?qū)О肆诵訕洹?幾丁質(zhì)酶基因和角質(zhì)酶基因是目前克隆的林小抗真菌病的二種主要基因，幾丁質(zhì)酶 具有降解幾r 質(zhì)的作用，許多病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之就是幾丁質(zhì)，而植物中尚 未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的底物。1 9 8 6 年s c h l l l m b a u m 首次報道提純的菜豆幾丁質(zhì)酶具有抗真菌 活性。 1 9 8 7 年h an t e v 研究小組對刨傷反應(yīng)基因在毛果楊美洲黑楊無性系中的表達(dá)進(jìn)行了 研究，發(fā)現(xiàn)楊樹受到機(jī)械損傷后，在楊樹的上部產(chǎn)生了許多新的m r n a ，克隆這些 m r n a 的c d n a 并進(jìn)行序列分析，其中兩個轉(zhuǎn)錄物w i n 6 和w i n 8 編碼幾丁質(zhì)酶，可降 解侵染楊樹的細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁，w i n 3 轉(zhuǎn)錄子所編碼的多耿與豆科種子的蛋白酶抑 相擠u 相似，具有抑制昆蟲的功能。他們將w i n 6 基因與g u s 報告基因融合構(gòu)建表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化楊樹，進(jìn)行抗病基吲的遺f 專轉(zhuǎn)化研究?，F(xiàn)已證明，從煙草、馬鈴薯、黃瓜、菜 豆、豌豆、鷹嘴豆、甜菜、水稻、小麥、大麥、玉米等中提純的幾丁質(zhì)酶，刺立枯絲核 菌( 尺 如d c f d n 面印脅 j ) 等2 0 多種真菌的菌絲牛長或孢子萌發(fā)有抑制作用【2 ”。 有些幾丁質(zhì)酶可分解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，從而對細(xì)菌產(chǎn)生影響。從芥菜中克隆到 的一個幾丁質(zhì)酶基因( b i c h i i ) ，該基因編碼的酶具有兩個幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域，已證實對大 腸桿菌有毒害作用【。1 9 9 9 年趙世民等將兔防御素n p 一1 基因?qū)朊讞睿Y(jié)果發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)基因植株組織提取液對枯草桿菌、農(nóng)桿菌和立枯病原菌等多種微生物的生氏均有不同 程度的抑制作用 2 9 j 。2 0 0 4 年孟亮等將幾丁質(zhì)酶基因和0 1 ，3 一葡聚糖酶基因依次轉(zhuǎn) 入黑楊中，轉(zhuǎn)基因黑楊的細(xì)胞粗提液在體外可以有效的抑制楊樹病原真菌的生長1 3 。同 年，鄒維華：| 哿反義磷脂酶d t ( a n t i p l 腳) 基因和幾丁質(zhì)酶( c h 5 b ) 基因轉(zhuǎn)入美洲黑 楊g 2 中，獲得了耐鹽及抗病 生均顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株口“。 1 2 2 楊樹抗蟲基因工程 2 0 世紀(jì)8 0 年代以來，植物牛物技術(shù)的迅速發(fā)展和各種殺蟲蛋白基因的發(fā)現(xiàn)和克 隆，激發(fā)了人們開始用基因工程手段進(jìn)行抗蟲育種的研究，通過這一方法獲得的抗蟲轉(zhuǎn) 箍因植物，可以一定方式( 組成型、誘導(dǎo)型、發(fā)育調(diào)控型或組織特異型等) 表達(dá)抗蟲基 因，這類抗蟲植物的應(yīng)用可避免反復(fù)噴灑農(nóng)藥，及植物某些部位不易噴藥和有的生物殺 蟲劑在自然界不穩(wěn)定等缺點【3 2 】。 抗植物害蟲的基因有幾十種，目前在植物基因工程研究中常用的外源抗蟲基因有從 東北林業(yè)、學(xué)顧l 學(xué)位滄文 微生物蘇云金芽孢桿菌中分離出的蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因，簡稱b t 基因；從植 物中分離出的昆蟲蛋白酶抑制劑基因，其中應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因 ( c p t i ) ；植物凝集素基因( 1 e c t i ng e n e ) ；淀粉酶抑制劑基因：核糖體失活蛋白基因等 。楊樹抗蟲基因工程研究工作的熱點主要集中在蘇云金芽孢桿菌( 肋c i 池sf 砌r m p h s 括) 晶體毒蛋白基因( b t ) 和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因( c p t i ) 的應(yīng)用。 ( 1 ) 蘇云金芽孢桿菌晶體毒蛋白基因( b t ) 蘇云金桿菌毒蛋白( 或內(nèi)毒素b t t o x i n ) 基因是世界范圍內(nèi)廣泛使用的抗蟲基因， 它是蘇云金桿菌在芽孢形成過程中產(chǎn)牛伴抱晶體最主要的蛋白。b t 毒蛋白被鱗翅目等昆 蟲攝食之后，在昆蟲幼蟲的【 i 腸道內(nèi)經(jīng)蛋白酶水職，轉(zhuǎn)變成為帶有n 一末端的具有殺蟲 活性的毒性多肽分子?；罨说亩舅乜梢耘c敏感昆蟲中腸道上皮的微絨毛上的特異受體 結(jié)臺，隨之插人到細(xì)胞膜上并形成穿孔，使細(xì)胞膜周質(zhì)和中膜腔之間的離子平衡被破 壞，引起細(xì)胞腫脹甚至裂解，從而導(dǎo)致昆蟲幼蟲停止進(jìn)食而最終死亡【3 4 】。 轉(zhuǎn)蘇云金芽他桿菌毒蛋白基因的棉花、煙草，通過對棉鈴蟲和煙青蟲等室內(nèi)生物毒 力測定和大田試驗，已經(jīng)獲得了抗蟲效果比較好的轉(zhuǎn)基因植物并在大田推廣應(yīng)用。1 9 9 0 年c o o p e 等成功地將b t 基因和從馬鈴薯中提取的蛋白酶抑制基因( ，n ) 導(dǎo)入楊樹雜種 中獲得了抗鱗翅目和鞘翅目：a 蟲的轉(zhuǎn)基因植株1 3 ”。1 9 9 1 年m c c o w n 等利用電激法將b t 基因?qū)脬y白楊大齒楊和歐洲黑揚毛果楊雜種中，均獲得抗舞毒蛾和天幕毛蟲的轉(zhuǎn)基 因值株，對舞毒蛾致死率達(dá)：4 天幕毛蟲致死；季達(dá)6 0 ，這是首次獲得抗蟲效果明顯 的轉(zhuǎn)b l 基因樹木自研究”“。 1 9 9 1 年伍寧豐等以歐洲黑暢( p n 堙) 為研究對象，將b t 殺蟲蛋白基因?qū)肴~片 獲得再生植株，并經(jīng)s o u f h e r n 雜交證明確有外源基因插入，在國內(nèi)首次報導(dǎo)了b t 殺蟲 蛋白基因?qū)霔顦洳@得再生的轉(zhuǎn)基因植株【“。同年，中國林科院林研所同中科院微生 物所在我國首次成功地利用將n 一端缺失不同長度的c r v l 氣c 基因轉(zhuǎn)化歐洲黑楊 ( 尸n i ) ，獲得了歐洲黑楊( p 月洄。) 轉(zhuǎn)b t 毒蛋白基因植株，對舞毒蛾和楊尺蠖的抗蟲 率達(dá)5 0 1 0 0 1 3 7 】。 2 0 0 0 年田穎川等又將含b t 基因和蛋白酶抑制劑( a p l ) 基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化白楊 雜種無性系7 4 l 成功，得到了3 株高抗楊樹( 蟲試死c 二率7 l 以上) 和一批對昆蟲中等 抗性的植株。s o u l h e m 雜交分析結(jié)果表明兩種犟困均已單拷貝整合入3 個植株。這是國 內(nèi)外首次報道用雙抗蟲基因獲得的抗蟲7 4 l 毛白楊植株，目前已進(jìn)入中試階段1 3 8 ”】。 2 0 0 0 年李明亮等將含b t 基因和蛋自酶抑制劑纂因的雙元表達(dá)載體導(dǎo)入黑楊，經(jīng)p c r 檢 測和s o u t h e m 雜交分析證明，最終獲得既含b t 基因又含蛋白酶抑制劑基因的對舞毒蛾 有顯著殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因楊塒植株，殺蟲效果明顯高于僅含單一b c 基因的植株 4 。 2 0 0 1 年r a o 等將b t c r v i a 和c p t i 基因?qū)牒跅顭o性系n l 一8 0 1 0 6 中，結(jié)糶表明轉(zhuǎn)雙 價基因的株系比轉(zhuǎn)單價基因的株系抗蟲效果更為顯著h “。 2 0 f ) 3 年王永芳等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對青楊進(jìn)行含部分改造的b t c r y a c 基因( b t 基 因) 和慈姑蛋白酶抑制劑( a p i ) 基因a 的雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)化，確定了適于青楊的遺傳轉(zhuǎn)化 緒淪 系統(tǒng)。并獲得了青餳轉(zhuǎn)基因植株【4 2 】。2 0 0 4 年東北林業(yè)大學(xué)常玉廣等將b t 基因c 末端肽 和蜘蛛神經(jīng)毒肽組成的融合基因成功地導(dǎo)入了小黑楊花粉植株，抗蟲試驗表明，轉(zhuǎn)基因 株系其有明顯的抗蟲效果【4 3 】。 ( 2 ) 豇豆胰蛋白酶抑制劑摹因( c p t i ) 蛋白酶抑制劑( p i ) 是自然界含量最為豐富的蛋白種類之一，存在于所有生命體 內(nèi)，它能與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶相瓦作用，形成酶抑制劑復(fù)合物( e i ) ，阻斷 或減弱消化酶的蛋白水解作用，從而影口同外來蛋白的正常消化。同時它刺激消化酶的過 量分泌，通過神經(jīng)系統(tǒng)反饋，使昆蟲產(chǎn)：生厭食反應(yīng)，最終致昆蟲非正常發(fā)育或死亡 。 按其作用特異性，蛋白酶抑制劑可被劃分為4 類：絲氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白 酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑。目前，已有多種蛋自酶抑 制劑基因或c d n a 被克隆，并得到一批轉(zhuǎn)基因植株【4 ”。用于轉(zhuǎn)化楊樹的蛋白酶抑制劑基 因豐要有絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因。 1 9 9 1 年k 1 0 p f e n s c e i n 等首先利用馬鈴薯的蛋白酶抑制劑與n p t i i 構(gòu)成嵌合基因?qū)?楊樹，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其中1 個轉(zhuǎn)基因無性系t 6 6 5 的食i i f 量與對照存在顯著的差 異一。1 9 9 6 年w a n g 等將從b t 毒素中分離出的i c p s 摹因分別導(dǎo)入山楊和黑楊中，均獲 得寸分理想的抗蟲效果。1 9 9 5 年，法國森林育種實驗站g i l 】sp i l a t e 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將切 割蛋白( p r o l c i n c u t j n g ) 酶基因轉(zhuǎn)化湯樹，所得轉(zhuǎn)化株可使食其葉片的害蟲致死率達(dá) 4 0 。1 9 9 8 年c o n f a l o n i e r i 等及2 0 0 1 年d e l l e d o n n 等，將不同的蛋白酶抑制劑基因?qū)?入楊樹，均獲得具有較強(qiáng)抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植株【4 8 t4 ”。1 9 9 9 年郝貴霞等利用根癌土壤桿 菌介導(dǎo)法將廣譜抗蟲基因豇豆胰蛋白酶抑制劑( c p r r d 基因?qū)朊讞? 只即