（農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程專業(yè)論文）高純度兒茶素單體EGCG和ECG分離及純化工藝研究.pdf

高純度兒茶素單體e g c g 和e c g 分離及純化工藝研究 摘要 兒茶素是茶葉中的重要成分，由于其具有重要的生物活性、抗氧化性及清除自由 基的能力而日益受到人們的重視。已鑒定出的兒茶素單體主要有八種，可分為酯型與 非酯型兩類，其中的酯型兒茶素表沒食子兒茶素沒食子酸酯e g c g 和表兒茶素沒食子酸 酯e c g 藥理活性最強(qiáng)，需求量較大。 本文以茶多酚粗品為原料，采用正交試驗(yàn)系統(tǒng)研究了兒茶素e g c g 和e c g 在葡聚糖 凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 柱上的分離及純化條件。預(yù)分離試驗(yàn)采用無水乙醇為洗脫劑( 柱 高5 0 c m ，洗脫流速0 7 5 m l m i n ) ，實(shí)現(xiàn)了原料茶多酚中兒茶素單體e c g 與e g c g ( 含沒 食子兒茶素酸酯g c g ) 的有效分離。e c g 單體洗脫率9 7 6 4 ，純度達(dá)9 7 6 2 ，提取率 ( 8 5 6 7 ) ；e g c g ( 含g c g ) 單體洗脫率9 8 4 5 ，純度達(dá)8 8 6 6 。預(yù)分離所得e g c g ( g c g ) 組分適度濃縮后，再經(jīng)s e p h a d e xl h 一2 0 純化( 洗脫劑為4 0 乙醇水溶液，柱高5 0 c m ， 洗脫流速0 6 0 m l m i n ) ，可制備得到高純度e g c g 單體( 色譜純度9 9 9 ) ，提取率 ( 8 5 3 1 ) 和色譜純度( 9 9 ) 均接近或高于目前國內(nèi)外報(bào)道的兒茶素分離提取方法。 本文研究的方法大大簡化了兒茶索單體分離純化設(shè)備，只需經(jīng)過常規(guī)的兩次柱層 析系統(tǒng)即可完成單體e g c g 的分離提純，實(shí)現(xiàn)了e g c g 和e c g 柱分離與柱純化步驟的連 續(xù)操作，方法簡便，成本低廉，溶劑無毒，單體提取率及產(chǎn)品純度均較高，并可實(shí)現(xiàn) e g c g 一次性克量級以上的制各。對分離純化后的產(chǎn)品e c g 及e g c g 采用紫外光譜( u v ) 、 紅外光譜( i r ) 、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用( l c m s ) 及核磁共振( h n m r ) 四譜分析技術(shù)鑒定，驗(yàn) 證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。 本文初步探討得出，兒茶素單體在s e p h a d e xl h 一2 0 上的分離機(jī)理是分子篩作用、 吸附作用及分配作用的共同效應(yīng)。 關(guān)鍵詞：兒茶素 e g c ge c gg c g 葡聚糖凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 s t u d i e so nt h e s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fh i g hc o n t e n tt e a c a t e e h i n se g c ga n de c g a b s t r a c t t e ac a t e c h i n sa r et h ei m p o r t a n ti n g r e d i e n t si ng r e e nt e a s d u et ot h e i rw i d e s p r e a d b i o l o g i c a la c t i v i t y , a n t i o x i d a n ta b i l i t ya n d t h ec a p a b i l i t yt or e m o v ef r e er a d i c a l s ，m o r ea n d m o r ei m p o r t a n c ea r ea t t a c h e dt ot h e m c u r r e n t l yt h e r ea r em a i n e i g h tk i n d so f c a t e c h i n s m o n o m e r st h a th a v eb e e ni d e n t i f i e da n dt h e yc a nb ed i v i d e di n t ot w o g r o u p s ，o n ei se s t e r t y p ea n dt h eo t h e ri sn o n - e s t e rt y p e t h em o s tu s e f u la n dd e m a n d e dm o n o m e r sa r et w o e s t e rt y p em o n o m e r s - - e g c ga n de c g r a wt pw a se m p l o y e da sm a t e r i a la n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tm e t h o dw a su s e dt o s y s t e m a t i c a l l ys t u d yt h ep r e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so fe g c g a n de c g b y g e lc h r o m a t o g r a p h y t o o ks e p h a d e xl h - 2 0a ss t u f f i n gw i t ht h eh e i g h to f5 0c ma n d e t h a n o la se l u t i o na g e n tw i t ht h ee l u t i o ns p e e do f0 7 5 m l m i ni nt h ep r e s e p a r a t i o n p r o c e s s ， w ee f f e c t i v e l ys e p a r a t e de g c g ( i n c l u d i n gg c g ) a n de c g f o re c gt h ee l u t i o nr a t ew a s 9 7 6 4 a n dt h er a t eo fp u r i t yw a s9 7 6 2 ，a b s t r a c tr a t ew a s8 5 6 7 ；f o re g c gt h e e l u t i o nr a t i ow a s9 8 4 5 a n dt h er a t eo f p u r i t yw a s 8 8 6 6 1 1 1 ee g c g ( i n c l u d i n gg c g 、 f r a c t i o no b t a i n e di nt h ep r e s e p a r a t i o np r o c e s sw a s p r o p e r l ye n r i c h e da n de m p l o y e da sr a w s t u f fi np u r i f i c a t i o np r o c e s s a f t e r p u r i f i c a t i o np r o c e s s a l s oc a r r i e do u t b ys e p h a d e xl h - 2 0 w i t ht h eh e i g h to f5 0 c mu n d e rt h ec o n d i t i o no f4 0 e t h a n o la se l u t i o na g e n tw i t ht h e e l u t i o n s p e e d o f 0 6 0 m l m i n ，h i g h p u r i t y e g c gm o n o m e r sw e r e o b t a i n e d ( t h e c h r o m a t o g r a mp u r i t yo fo b t a i n e de g c g m o n o m e r sw a sa b o v e9 9 、a n dt h ee l u t i o nr a t e w a sa b o v e9 8 a b s t r a c tr a t ew a s8 5 1 3l ，c o n t i n u o u s o p e r a t i o n so fp r e s e p a r a t i o np r o c e s s a n dp u r i f i c a t i o np r o c e s sw e r ea c h i e v e db yt h i sm e t h o da n di tw a se a s i l ym a n i p u l a t e d b e s i d e s ，i tn e e d e dl o wc o s t ，p r o d u c e dn op o i s o n sa n dh a dh i g he x t r a c t i o nr o t ea n dp u r i t y m o r e o v e r , t h ep r e p a r a t i o na c h i e v e dg r a mm a g n i t u d ef o ro n c et i m e t h e i rm o l e c u l a r s t r u c t u r ew e r ei d e n t i f i e do rv e r f i e db yu v ，i r ，l c - m s ，h - n m ri n s t r u m e n t a lt e c h n i q u e s i na d d i t i o n ，e l e m e n t a r yc o n c l u s i o nf o rt h em e c h a n i s mo ft h es e p a r a t i o np r o c e s so f c a t e c h i n sw i t hs e p h a d e xl h - 2 0w a so b t a i n e dt h a tt h es e p a r a t i o nw a sa c h i e v e db yt h e c o m b i n e da c t i o no f m o l e c u l a rf i l t e re f f e c t s ，a d s o r p t i o ne f f e c t sa n dd i s t r i b u t i o n a le f f e c t s k e y w o r d s ：t e ac a t e c h i a se g c ge c gg c g s e p h a d e x l h - 2 0 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指婚下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成裂。據(jù) 我所知，除了文中特剮加以標(biāo)志和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究成果，也不包含為獲褥焱g 王冀纛堂藏其他教蠢機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書面使髑過的榜 料。與我- - n ：i ：作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已襁論文中作了明確的說明并寢示謝 意。 學(xué)位論文作贛簽字i * 噸簽字b 期如海二月墨 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者寵全了解金自l 薹驥友堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留 并向國家有關(guān)部f 1 或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印 牛和磁盤。允許論文被套潤或借閱。本人授粳金 世點(diǎn)業(yè)去堂可以將學(xué)位論文的全部域部分論文內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影 印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 編學(xué)位論文。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書) 學(xué)位論文者撼名：薌、叱導(dǎo)師簽名： 簽字日期：函坼年占月f 日 墨稆紐 麓字日翌如中年古月口日 堿；爭p 哪 鰓爭p “黼 致落 我的碩士畢業(yè)論文熊夠順利完成，首先凄感謝導(dǎo)孌荽姜紹避教授，從 論文躲避怒、 舞究方寨設(shè)計(jì)、論文 舞究進(jìn)震裂論文撰鷥的每個琢節(jié)，譬 霧季都傾注了大麓戇，玉巍。導(dǎo)鎏器嚴(yán)謹(jǐn)憋治學(xué)態(tài)度、開放豹學(xué)術(shù)思想秘求實(shí) 麓工俸俸風(fēng)也使我受燕霉摹淺，閼露程我也要感謝灌露軍教授對我論文期 閬靜關(guān)，翻指簿。 本試驗(yàn)是在合月巴王監(jiān)大學(xué)生物與食晶工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成憋，論文 躲避褥過稷褥到了實(shí)驗(yàn)窒綴多豢爨瀲及毫鼙究生粕靜熱心幫助秘支持，在 此一薺表示我贏摯的謝意。 最話我要慧謝我的家人在我求學(xué)生涯中給予酶默默支持和毽解 第一章緒論 茶葉是倍受人類喜愛的保健飲料之一，與人們的生活息息相關(guān)，其中存在 多種有效活性成分，如具有保健、藥效功能的茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ) 和咖 啡因( c a f f e i n e ) 等。自從1 9 2 9 年日本人首次從茶葉中提取分離出兒茶素以來， 許多學(xué)者對兒茶素進(jìn)行了深入的研究。研究表明茶多酚的主體化合物兒茶素既 是理想的天然抗氧化劑，又是一類極有價值的天然藥物原料，它具有抗腫瘤、 降血壓、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等多種獨(dú)特功效”_ 5 1 。 近十年來，世界發(fā)達(dá)國家積極推進(jìn)兒茶素應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)，以其作為天然抗氧 化劑和自由基清除劑，已廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健和日用化工等領(lǐng)域”， 尤其是f d a 確認(rèn)兒茶素具有藥效功能后，國際市場對其需求量日增。研究各利， 兒茶素的藥理活性和協(xié)同作用以及其在體內(nèi)的代謝情況，開發(fā)兒茶素類新藥， 均需大量高純度的各類兒茶素單體。我國是產(chǎn)茶大國，茶葉資源十分豐富，由 于對茶樹修剪葉及茶葉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量茶末，甚至滯銷的低檔茶，全部 當(dāng)作廢料處理，造成茶葉資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，深入開展茶葉的深加工，研 究茶葉兒茶素單體的提取純化方法和生產(chǎn)工藝具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 1 1 兒茶素的組成和結(jié)構(gòu) 茶葉中的化學(xué)成分已分離和鑒定的有近5 0 0 種，分為1 2 類，主要的有茶色 素、咖啡因和茶多酚。其中茶多酚( t e a p o l y p h e n o l s ，t p ) ，又名茶單寧或茶鞣 質(zhì)，是一類存在于茶葉中的多羥基酚類化合物的簡稱，其在茶葉中的含量最高， 約占干茶重的2 0 一5 0 ，茶多酚的結(jié)構(gòu)通式見圖1 - 1 。茶多酚主要包括兒茶素類 ( 黃烷醇) 類、黃酮醇類、花青素類、花白素類和酚酸及縮酚酸類。3 ，這些化合 物都具有2 一苯基苯并吡喃的基本結(jié)構(gòu)，故統(tǒng)稱為類黃酮物質(zhì)。其中兒茶素類是 茶多酚的主體，約占茶多酚總最的8 0 0 左右，屬于黃烷醇類化合物。兒茶素的基 本結(jié)構(gòu)見圖卜2 。 d r 3 圈卜1 茶多酚結(jié)構(gòu)通式 f i g u r e1 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so ft e a p o l y p h e n o l s 0 h e c ： r = r 2 - - - - h e g c ： r 1 = o h ，r 2 = h e c g ： r 1 _ h ，r 2 = 2 田。g ：r 1 2 0 h 警 麟：r | 2 c h 警 恨洲 c = o o h 峨囟“ c = o 圖卜2 兒茶素結(jié)構(gòu)通式 f i g u r e1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f t e a - c a t e e h i n s 理論上分析兒茶素應(yīng)有十六種同系物及其同分異構(gòu)體。1 ，但在新鮮茶葉中僅 鑒定出七種，而在成品茶葉中也只鑒定出十種，這是加工過程產(chǎn)生化學(xué)變化的 結(jié)果。不同兒茶素因其結(jié)構(gòu)的不同而導(dǎo)致它們的理化性質(zhì)及其某些藥理功效也 各異“1 。到目前為止研究較多的兒茶素單體主要有8 種，它們分別是： o 、l 一兒茶素( d 、l _ c ) ， l 一表兒茶素( l _ e c ) ， l 一表沒食子兒茶素( l e g c ) ， d 、l 一沒食子兒茶素( d 、l g c ) ， l 一表兒茶素沒食子酸酯( l _ e c g ) ， l 一表沒食子兒茶素沒食子酸酯( l e g c g ) ， l 一沒食子兒茶素酸酯( 卜g c g ) ， l 一兒茶素酸酯( l c g ) 其結(jié)構(gòu)式見圖1 - 3 0 1 。 由于c g 、e c g 、g c g 、和e g c g 中發(fā)生了兒茶素與沒食子酸的酯化作用，故 稱其為酯型兒茶素：而沒有發(fā)生酯化作用的c 、e c 、g c 、e g c 稱為非酯型兒茶素， 各兒茶素的結(jié)構(gòu)較為相似，有些為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于羥基取代 的數(shù)量和位置不同。各種單體的含量也因茶葉品質(zhì)不同各異，一般來說e g c g 和 e c g 的含量較大，也是研究的重點(diǎn)。 左1 旋l - 一e 裹c(diǎn) ( j e e 寨巢錳疑左旋一裹兒荼索d 廈式) h 0 2l c ( c a t e c h l n ) 左旋一兒茶素c 匣式) 0 h 3 d - c ( = l t l c h i a ) 右旋一兒荼素c 魘式) 左4 旋l - 一e 表g c 沒( e 告p i 子5 l l 兒。荼c a 索t e c a h 匝i 式a ) )5 篆箍j 攫警莩， 纂豢磕式)右5 旋d - 一沒g c 警享兒l o 茶c a 素t e c ( h 反i 式n ) ) h 0 左9 旋l - 一e 裴疑翟擎咒槳巢淀窯；稚碥檣妥)左搖二襄薤譬鞘璨檗蓮警擎酷l a c 反t e 式) 圖卜3 綠茶中八種主要兒茶素單體的結(jié)構(gòu) f ig u r e1 3s t r u c t u r e so fe i g h tm a j o rc a t e c h i n sf r o mg r e e nt e a 4 h h h 洲妒 噼 明白二 h-t月 0 v 刺洲 6 薔道 旺。 焱掣j 火 q 。 焱。 幾 一 咄 1 2 兒茶素的生物活性 茶兒茶素具有廣泛的生物活性，其抗氧化性及清除自由基的能力在治療多 種疾病的試驗(yàn)性研究中起了重要作用。近年來國內(nèi)外諸多研究證明，兒茶素具 有抗腫瘤。1 ”、抗突變、降血壓、降糖、降血脂“、抗動脈粥樣硬化、抗菌消炎、 抗病毒、降低齲菌的蝕斑、保護(hù)肝細(xì)胞“、治療病風(fēng)“、預(yù)防癲癇“、參與抗 過敏反應(yīng)“、對抗輻射作用“7 1 及抑制h i v 逆轉(zhuǎn)錄酶“8 1 等多種功效。 1 2 i 兒茶素的抗氧化性 兒茶素結(jié)構(gòu)中有多個酚羥基，易被氧化成醌類而提供h + ，有顯著的抗氧化作 用“”2 。研究表明，不同兒茶素按等摩爾濃度的抗氧化活性秩序是?！埃?l - e g c g l e c g l e g c l e c ；按等重量的抗氧化活性秩序是：l - e g c l e c l e c g l e g c g 。另有體外研究表明。2 “，茶多酚及l(fā) - e g c g 對o 。一的清除能力強(qiáng)于v 。和 v 。，并在一定范圍內(nèi)隨濃度增加而加強(qiáng)，且與v c 及有機(jī)酸等具有協(xié)同作用。 1 2 2 兒茶素清除自由基作用機(jī)理 兒茶素類的抗氧化作用多指其清除自由基的作用。自由基是指含有未成對 電子的原子、原子團(tuán)或分子。生物體內(nèi)自由基的生成途徑主要有三條：( 1 ) 分 子氧的單電子還原途徑，這一過程產(chǎn)生0 2 ，。0 2 ，0 h 和h ：o 。；( 2 ) 酶促催化產(chǎn)生自 由基：( 3 ) 某些生物物質(zhì)的自動氧化生成自由基?！?。生物體內(nèi)自由基處于生物 生成體系與生物防護(hù)體系的平衡之中。一旦平衡被破壞，就會危害機(jī)體，產(chǎn)生 疾病，所以需要外源的抗氧化劑清除自由基，保護(hù)機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)。 由兒茶素基本結(jié)構(gòu)可知它們都含有兩個以上互為鄰位的羥基，較易氧化而 提供質(zhì)子h + ，具有酚類抗氧化劑的通性。研究結(jié)果表明兒茶素的抗氧化機(jī)理是由 于其b 環(huán)上的鄰位羥基或連位酚羥基易發(fā)生氧化生成成鄰醌類物質(zhì)。2 ”，而提 供的h + 與自由基結(jié)合，可使之還原為惰性化合物或較穩(wěn)定的自由基，從而可直 接清除自由基，避免機(jī)體氧化損傷“”1 。 1 。3 ，k 萘豢麴應(yīng)翅 茶多黲磷究發(fā)鼴始予8 0 年代，進(jìn)入年代彤成離潮積熱門，修為黲贛 型熬天然攘鱖純賽 l ，筏強(qiáng)予1 9 9 1 年姆莢列入食鑫瓣家標(biāo)溱 4 s 】。幸箬斃茶多瓣主 體殘分熬j l 茶素瘦建磅突，囂蘩融綴_ 開涉及翔健妝翳、夔舞、糖爨純學(xué)麓、傈 穩(wěn)赫簿各個領(lǐng)域。尤獒是e g c g 擎俸，蕊在已寢弼為 孛潛程軀抗癔藥物在中美 等國被深滅磷究?！?。，l 茶豢幫效袋分麴撬純鞠應(yīng)麓磷究仍照予方興來艾階段。 1 3 。1 醫(yī)蓊保健律鷹 g c g 麴生物警效應(yīng)，主溪宥抗突變、抗萎孛癟澎袋、消炎等 乍霜洳。磅蠢表 嚼，綠茶戲其組分兒茶索對脾瘤的形成的各個階段郝有預(yù)防葶b 搏剿捧用”“。 e g c g 縫秘涮憊牲擻糠鑫巍瘸( a m l ) 綴濺熬攮藏，可艇怒逶；窶瓣刳綦些壤熬囂子瑟 起饞怒5 “。凡耱j k 茶豢摹摶掘e g c g 、e c g 秘e g c 黲誘發(fā)漤巴纓照牲邀彀瘸m o l t4 r 綱施瓣撼亡8 “。努黔，b 蕊豢憩弓| 怒一l o s 、e m y c 、c - r a f 幫e h - r a s 等多稀 癌蕊溺表達(dá)懿歡變腳3 ，馥癸，l 蓉蠢述髓攘潮蛋鑫酪熬遺瞧。 憨練j l 荼素靜主要蓊遴功能主要有8 ”1 ：( 1 ) 消除蠢由藻，調(diào)憋弓 發(fā)物的 代 囊 過程：( 2 捧秘島氨酸囂莞羧酶( o d c ) 滔往和勰甄訖酶滔鏈：( 3 ) 瓣翻燕基 因和d n a 的菇價結(jié)合；( 4 ) 抑制駐消佬過程；( 5 ) 抑制細(xì)胞增穗過猩；( 6 ) 提 鑫i 褥髓甘款一s 一轉(zhuǎn)移酶、避戴識驁、n a p p ( h ) 、囅還琢酶( 毽r ) ，超歧氯純酶( s o d ) 等有懿酶的瀨性。 1 3 2 食赫工照上翡液爝 ，l 茶素在食菇領(lǐng)域的寢翊主要崧雙下凡方面： 許多食物均爨有較高的脂肪禽筮，如色摭油、豬油等備種食用油；禽脊攝 入人髂內(nèi)魏許多藏瓣虢食瀛，魏瓷禽魚褒及菠制菇秘高l 罄糕嶷。這魍離g 簿食晶 在光、漫、激環(huán)蟪中攝易輟化變威，會成抗畿化劑二t 基羥攥苯( b h t ) 釉丁羥 綦裁露醚( b h a ) 在食熬中豹黢蘧，蠖褥遮黧含l 冀黲食熬氧純酸效遂菠大大下辯， 遐閹孵也繁采了一令安壘瞧黲逮鼷。男耪上棗驄臺成食品捷氧化剡維生豢e 東食瀑安全縫上襞顯羧善，毽宙予它燕一類l 鏊溶髏鎂二食茲，蠢拳棗甏中a 乎不滾， 逡戲巍瘸菠麓上戇麓羧蛙。j l 茶素穆為譙楚懿撬氧純裁，其虢氧純穗強(qiáng)予b h t 、 8 h a 、v 。v 。，出于，l 茶素楚多羥蘩的強(qiáng)裰往純舍耪，它易溶予7 k 、酸蔣極健溶 液中，使麓越來黎露方便。 6 勇?lián)蔷堪l(fā)囂，b 茶素箕鴦綴強(qiáng)豹抗菌、撩菌淫髓，露予莛然霧中1 9 類群鶼 近酉種細(xì)菌均有優(yōu)異的抗菌活性，駐示出抗菌的廣譜性，其抗菌活性比黃芩素 強(qiáng)，抗菌廣譜性也磁黃芩素廣潮。 兒茶素述對a 一淀粉酶，蔗糖酶均有良好的抑制能力，拶為理想的保鮮剡， 可以減緩采摘后的水果、蔬菜、飲料、畜牧、水產(chǎn)晶深加工等的腐敗；且兒茶 素具有較強(qiáng)鼴還原性，霹防止上述鍛索氧化褪色，僳持其色澤鱗憨穩(wěn)定娜3 。 同時兒茶索還可有效去除肉類、糧、油作物及其制品的異味，如大豆制品 蕊豆艟妹，小麥異昧，添熬，b 茶素霹起蕊蘩去臭終耀濰1 。 1 3 3 日化產(chǎn)晶中的應(yīng)用 兒茶素程日化產(chǎn)品上可作特殊功能的保質(zhì)劑，護(hù)膚劑和香煙解毒劑。 在霉瀑下， 磊濃溲下j b 茶素其有綴強(qiáng)懿揀氧證、灣驤蠡囪基、基螢、去髯 味等功能，因此添加少量的兒茶素即可防止化妝品的變質(zhì)。兒茶素在化妝晶中 靜俸爝狡捂翔下：( 1 ) 抗衰老作焉； 9 8 ) ，( 購于美國s i g m a 公司) ； 甲醇，乙酸乙脂，乙腈，( 色譜純) 上海振興化工一廠生產(chǎn)。 2 1 2 主要設(shè)備 w a t e r s 515 2 4 8 7 ，一2 9 9 6 高效液相色譜儀( 包括體積2 0 微升進(jìn)樣器溫控系 統(tǒng)) ，美國w a t e r s 公司：超聲波脫氣器，濾膜過濾器等，w s c 5 0 色譜工作站( 大 連化物所) 2 z 試驗(yàn)方法 l 、準(zhǔn)確稱取茶多酚o 1 9 ，重蒸水溶解于l o o m l 容量瓶中，經(jīng)微孔濾膜( 巾0 4 5 pm ) 過濾 睪表褥測繕鑫。 2 、高效液相色譜條件：色譜分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) ；檢測器：2 4 8 7 雙波長紫努檢測器；檢測波長：x = 2 8 01 3 m ；流動檣：重蒸求乙虢乙酸乙 酯：8 6 1 2 2 ( 體積比) ；流速：1 o m l m i n ：a u f s = 2 0 0 0 。 2 3 結(jié)果與分析 2 3 1 定性測定 離效液楣色譜主要是采用保豫值比較法定性，即當(dāng)未知峰的保留值( t 。) 與 菜一己知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時，則未知峰可能與此融知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。 在2 2 所述魏譜條轉(zhuǎn)下，分別注入l o hl 各玉辯l 茶素標(biāo)壤溶渡及蜘蹲因 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并測定各組分的保留時間，然后注入它們的混合溶液，得到五種 j l 茶素及秘蹲因瓣撂攀憊港圈( 藏匿2 - 1 ) ，繯蘩瓣閹冕裘2 - 1 。采爰穩(wěn)麓色落 袈件測定原料茶多酚中各組分，液相色譜圖見圖2 2 。 824881 0 21 4 61 b 痢 渡：橫坐標(biāo)表示色譜峰傈窩俊t 一( m i n ) ，綴坐標(biāo)表示梭測器的儲號響應(yīng)鐨( m v ) 鷲2 - i 五秘j k 蒺素器攘瑟與魏礤因混臺物熬h p l c 分離圈 f i g 2 - 1h p l cc h r o m a t o g r a m s o f 伽es t a n d a r dc a t e c h i n sa n dc a f 1 6 黼讎 瀚 啪黜 榔霎 貓 b 枷 表2 一l 兒茶素標(biāo)品、咖啡因混合液h p l c 測定結(jié)果 t a b l e2 1d t e t e r m i n a t i o nr e s u l t so fh p l co f f 萱v es t a n d a r de a t e c h i n sa n dc a f 1 c a f2 c3 e c4 e g c g5 g c g6 e c g 圖2 2 原料茶多酚( t p ) 的h p l c 分離圖 f i g 2 - 2 h p l c c h r o m a t o g r a m s o f t h es a m p l et p 從圖2 - 1 看出咖啡因及五種兒茶素單體( c 、e c 、e g c g 、g c g 、e c g ) 分離 效果較好，峰形尖銳，基線平穩(wěn)，分離度均大于1 5 ，且檢測可在2 0 分鐘之內(nèi) 完成，解決了過去一些研究報(bào)道中。1 c 與e c 不能很好分離的問題。 2 3 2 定量測定 色譜中常用的定量方法有歸一化法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法1 。 按測量參數(shù)分，又可將上述四種定量方法分為峰面積法和峰高法。本文采用實(shí) 驗(yàn)室較為常用的標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，并以峰面積作為定量參數(shù)。 州如 咖 瑚 拋 御伽 卯。 勛 2 3 2 1 椽溱工摻蘸線 標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或贏接比色法，是h p l c 定嫩分析中比較常用的方 法，也是一耱籬餒、茯遮的絕對定量方法。具體骰法是：靂標(biāo)穩(wěn)樣品醞成不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與預(yù)測組分相同的條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測量峰的 峰面積，蠲峰面積對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后利用此該曲線測定待鍘 組分的含魅。標(biāo)凇曲線一般要求網(wǎng)歸系數(shù)大于0 9 9 本試驗(yàn)將各標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)凇溶液，精密移取0 5 m l ，混合均勻后得到混合 標(biāo)櫸，剝爝外標(biāo)滋雩# 出各標(biāo)準(zhǔn)品熟工 乍鰒綾見表2 - 2 。 表2 - 2 兒茶素標(biāo)鼯、咖啡閣混合液標(biāo)準(zhǔn)品：e 作曲線 t a b l e2 0s t a n d a r dc n r v e so f 鞠秘c h i n sa n do a f 結(jié)暴表疆，程給定靜濃度范豳肉，線往關(guān)系蓬盎手，輛稚因及羞種，l 茶素葷 體( c 、e c 、e g c g 、g c g 、e c g ) 的相關(guān)系數(shù)均大于0 9 9 。 2 ，3 2 2 方法精密度考察 穗對檬疆編熬r s d 怒耀寒譯徐定量分凝結(jié)暴耱密愛鶼量度，趨懟嗣一櫸晶 多次測定結(jié)果的熏復(fù)性和再現(xiàn)性的評價，r s d 越接近零，襲明方法精密度越好。 一般要求應(yīng)在5 驤疼。為考察本文建立懿色譜定囊方法懿精確觳與穩(wěn)定鑲，對 各標(biāo)準(zhǔn)品煎復(fù)進(jìn)行5 次h p l c 的測定，以峰面積作為考察參數(shù)。結(jié)果見表2 - 3 。 簌2 3 方法鬻塞凄 f a b l e2 - 3d e t e r m i n a t i o nr e s u l t so ft h ep r e c i s i o no fc a t e c h i n s 結(jié)榮表甓該方潼精密凄較好，套綴分熬搖對櫥臻糠差在 2 l 婚一3 0 9 之鯔。 2 。3 。2 。3 最小梭溺黻溺霆 最小檢測限又稱敏感魔，定義為響應(yīng)值為2 倍噪聲所需要的樣品量，即是 蠢在曝聲鷙疑上蟄熊產(chǎn)空霹蒺囊靛蘩號對，雀單譴髂稷或革愛辯灝露霞囪捻濺 器邀入的樣晶量。w 辨別的信號一般規(guī)定受大于或簿于2 倍噪聲。最小檢測限 越小，該稔潞方法靜敏感壤越高。 本試驗(yàn)以信噪比( s n ) 等于2 測得c 毪f 、c 、尊e 、e g c g 、g c 6 、e c g 駒最 小稔測限為分跗為7 5 n g 、1 8 0n g 、1 7 8 n g 、2 4 2n g 、2 4 9 n g 、2 8 7n g 。 2 ；3 。2 ，4 霞牧率實(shí)驗(yàn) 回收察是用來評價色譜定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的指標(biāo)，其方法媲將被測樣品 分為兩費(fèi)，其中一份攘天矗黯量氆辯霰濺短分，然后饜同樣靜方法分橇速褥鎊 樣潞，得到鞭份結(jié)果；a ( 加入欲測組分櫸赧豹測定結(jié)果) ，m7 ( 米加入欲測組 分樣品的測定結(jié)采) 。色譜璃論認(rèn)為理論縭祭應(yīng)為b ( m 喲，雨氈為實(shí)測值， 則隧故率。定義為；實(shí)測毯與理論值豹攏值?；厥詹煸浇渝錿 0 0 ，定量分析結(jié) 果的準(zhǔn)確就越高。 試驗(yàn)巾精密稼取茶多酚櫸鑫5 0 m g ，重蒸承落髂囂定容至5 0 m l 容量甄中攙為 底液，分別移取該底液l m l 予5 個l o m l 容髓瓶中。分別穆教e g c g ( 0 5m g m 1 ) 蠶準(zhǔn)港滾稻e c g ( 0 2 窶g 內(nèi)i ) 標(biāo)箍溶滾各0 5 蕊 、t 。0 m l 、t 5 鞴i 、2 ，0 m l 、 1 9 2 5m l 于前述l om l 容量瓶中，重蒸水定容至刻度。以e g c g 和e c g 為指標(biāo)進(jìn)行 h p i c 回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表2 4 。 表2 4 方法回收率 注：a ：n 量值b ：理論值；c ：回收率 n o r ：a ：t e s t e dv a l u e ；b ：a c t u a lv a l u e ；c ：r e c o v e r yr a t e 從表2 - 4 看出，各該h p l c 方法對兒茶素中e g c g 和e c g 的回收率在 9 5 0 一1 0 4 3 范圍內(nèi)，效果良好。 2 3 2 5 定量測定結(jié)果 采用上述h p l c 檢測方法，配置一定濃度的標(biāo)品，測定得到原料t p 中各 成分質(zhì)量百分含量，見表2 5 。 表2 - 5 原料茶多酚中兒茶索含量 t a b l e2 5c o n t e n t so fc a t e c h i n si nm a t e r i a l ( t p ) 2 4 奪結(jié) 建立了茶葉中咖啡因及c 、e c 、e g c g 、g g c 、e c g 幾種兒茶素單體的等梯度 流袋h p l c 色譜分離方法。 梭測條件：色譜分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) ： 檢測器：2 4 8 7 雙波長紫外檢溯器：檢測波長：x = 2 8 0n m ： 流動捆：重蒸水乙膪乙酸硝= 8 6 1 2 2 ( 體積比) ： 流速：1 o m l m i n ： a u f s = 2 0 0 0 。 檢測結(jié)果表明：咖啡因、c 、e c 、e g c g 、g g c 、e c g 的分離度效果滿意，器單 俸標(biāo)準(zhǔn)曲線戮霆系數(shù)r o 。9 9 ，方法穗密度及方法國浚攀均較麓，定量結(jié)栗準(zhǔn)確可 靠，是一種簡便、穩(wěn)定、可靠的兒茶素檢測方法。 2 1 第三章j 乙茶素單缽預(yù)分離條件羲暑究 兒茶索單體的提取制柱，一般是利用粗制茶多酚( t p ) 為原料，經(jīng)柱層析 軔步分離成為翡型，l 茶素( e g c g 、g c g 、e c g 、c g ) 黟j 醮黧j l 茶素( e 、e c 、g c 、 e g c ) 兩部分后，弭采用半制備h p l c 儀器方法進(jìn)行單體的分離。而初分離方法 中溪采羈麴柱層耩填辯、洗麓裁、洗魏鼓集滾豹娃理方法等都會瓣磊續(xù)纂薅麴 分離純化產(chǎn)l 重要影響。目前報(bào)邋的兒茶索初分離方法如s a i j or y o y s u “、照 邊文久等9 “、王漾掰等、藏淘雨等“”部是班葡聚耱凝黢s e p h a d e xl h 一2 0 作 為桂層析介質(zhì)，在沈脫劑種類方面稍有差鼯，它們均主要存在以下幾方面問題： ( 1 ) 分離效率不離，經(jīng)裁聚糖凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 層豐斤后，一般只能將原料 茶多酚中的兒茶素分為酯型和非醞型兒茶索兩類，麗占主要含量的e g c g 及e c g 單體并未分離，e g c 6 的同分異構(gòu)體g c g 覓是無法分離，需進(jìn)一步純化，對后續(xù) 技術(shù)要求較高；( 2 ) 多采蠲攆度浚殘方式，澇洗灝易產(chǎn)生氣遣，操 乍條 警不易 控制，結(jié)聚重現(xiàn)。隴羞：( 3 ) 洗脫劑種類繁多，分離效果欠佳，研究尚不臻統(tǒng)。 文黻援遵8 6 。”主要蹩采弱涎酮東溶液終燕洗魏裁，也毒少藿掇邀袋羥l 乙黲或者 越其它多元混合溶劑作為洗脫劑的“，存在洗脫周期長或溶劑毒性等缺點(diǎn)，并 雖來冕較為系統(tǒng)豹疆究：( 4 ) 評價指標(biāo)不統(tǒng)一，絞乏逶翻往。王浚耨等采蘑 每個收集瓶中所臺的各兒茶素的色譜檢測峰面積除以收集到的各瓶中該兒茶素 的蜂面積憨和褥到黯百分院作為魄較指標(biāo)，戚向陽等船鉑用收集液靜紫夕 吸競 發(fā)作為比較，缺乏一定的囊觀性牟可比性。 本章應(yīng)用正交試驗(yàn)方法，系統(tǒng)研究了實(shí)現(xiàn)粗制茶多酚中兒茶索單體預(yù)分離 的冬季申條件因素，以期獲褥麓單、易行、籠毒的e g c g ( 食有g(shù) c g ) 與e c g 單體 的次性分離條件，并建立一套科學(xué)、直觀的評價系統(tǒng)。 3 1 層拆介質(zhì)豹確定 3 11 方法比較 柱層析的關(guān)鍵是柱填料及洗脫粼的選擇。目前，國內(nèi)步卜掇道的用于預(yù)分離 制餐兒茶綮單體的柱填料主要有三大類；( 1 ) 吸附型柱：纖維素，硅膠，三氧 化= 鋁，聚酰胺等；( 2 ) 離子交換柱：x a o - 2 ：( 3 ) 凝膠柱：t o y o p e a r lh w - 4 0 及s e p h a d e xh 一2 0 。文歙報(bào)道“”使臻吸附型及離子交換型糖月罄分離j l 蕊素單 體效萊欠佳，顯步驟頹琰，產(chǎn)品蘸痰不離。t 0 z a w a t 4 6 愛t o y o p e a r l # 弘4 防震 析柱分離兒茶索單體。以丙酮為洗脫劑按濃度梯度進(jìn)行洗脫，淋洗時易出現(xiàn)氣 泡，澎蛹分離效采，并且操作不荔控翻，使瀚普及牽不高。 大量試驗(yàn)證明藏聚糖凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 在分離兒茶索方面有著十分明顯 的優(yōu)勢，旱在1 9 6 9 年d j m i l l i n 等應(yīng)用s e p h a d e xl 一2 0 柱層祈分離提絨茶 鮮塒“中五秘j l 茶素“3 。近年來國內(nèi)也在這方蹶也進(jìn)行了較為深入約研究：戚向陽 ”使用s e p h a d e xl h 一2 0 分離得到酯型兒茶素；王洪新，戴軍等。7 也使用s e p h a d e x l h 一2 0 及半剁冬色譜褥到j(luò) l 茶素單錈。數(shù)凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 可饞為分離j l 茶 索單體的優(yōu)良層析介質(zhì)。但凝膠層析至今仍未獲得較好的單體分離效果，麒主 要藪因是j l 裝素魏歹l 耪攀缽熬穗對分子量魄較接遙，蘑莓聚糖凝駿分子薅俸蘧 主要是根據(jù)相對分予質(zhì)量大小來分離的，用葡聚糖凝膠層析可大致把酯型兒茶 素霸饕酪登，k 茶素分離開，舔占主蘩含量豹e g c g 及e c g 荸缽并未分離。 3 1 2 蘧聚糖凝膠s e p h a d e xl h 一2 0 的結(jié)構(gòu)及性質(zhì) s e p h a d e xl h - 2 0 是由葡聚糖g 一2 5 經(jīng)羥基丙化加工而成，屬分子篩凝膠o “ “，梵英適蠲予天然產(chǎn)物在蠢援溶割中豹縫純。它在分離j l 茶素單髂方囂其巍較 多優(yōu)勢：( 1 ) 分離范圍是1 0 0 4 0 0 0 ，兒茶素各單體分子量均在此范圍，可用該 凝羧進(jìn)褥有數(shù)分離；( 2 ) 該凝獲藏瓣莢釜親求及親蠹雙重瞧滋，蘢英適弱予天 然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化，同時通用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離如同 分異構(gòu)體懿分離；( 3 ) 藍(lán)類介質(zhì)靜分離效聚優(yōu)良，受載量可遮3 0 0 m g 祥晶m l 凝 膠：( 4 ) 該凝膠層析條件溫和，具有生物大分子的相容性，不影響天然產(chǎn)物活 性。凝膠材料本身不帶電荷，不會與被分離物質(zhì)相囂作用，因而溶質(zhì)回收率接 近l o o ：( 5 ) 該凝膠分離效果好，震現(xiàn)性強(qiáng)，完成次分離霈時較短。每個樣 品洗脫后柱翁再生，可反復(fù)使用，壽命長。 練上本磺究選搦s e p h a d e xl h 一2 0 終為艨輯分質(zhì)。 3 2 試驗(yàn)材料與設(shè)備 3 2 1 材料 主要試驗(yàn)用材料見表3 一l ，3 2 2 3 表3 - 1 主要試驗(yàn)原料 t a b l e3 - 1m a i nm a t e r i a l s 乙醇 丙酮 甲醇 甲醇 乙腈 乙腈 二次重蒸水 上海振興化工一廠分析純 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司分析純 上海振興化工一廠色譜純 江蘇淮陰漢邦公司色譜純 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司色譜純 江蘇國達(dá)公司色譜純 試驗(yàn)室制備 3 2 2 主要設(shè)備 主要設(shè)備見表3 3 。 表3 - 3 主要儀器設(shè)備 ! 壘壘! ! 曼：蘭坐璺! 翌! g 翌! p 巴! 墜塑 名稱產(chǎn)地 高效液相色譜儀( h p l c ) 色譜柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 a m ) 2 4 8 7 雙波長紫外檢測器 層析柱 d h la 電腦恒流泵 b s z - 1 0 0 自動部分收集器， t h - 1 0 0 0 a 梯度混合器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 超聲波脫氣儀 f d l 型冷凍干燥器 w a t e r s5 1 5 系列 w a t e r s w a t e r s 上海華美寶試驗(yàn)儀器廠 上海滬西分析儀器廠 上海精科實(shí)業(yè)有限公司 上海滬西分析儀器廠 上海申勝生物技術(shù)有限公司 江蘇淮陰漢邦 北京博醫(yī)康技術(shù)公司 3 2 3 兒茶素單體預(yù)分離試驗(yàn)裝置 兒茶素單體預(yù)分離試驗(yàn)裝置圖見圖3 - 3 圖3 - 1兒茶素單體預(yù)分離試驗(yàn)裝置圖 3 3 試驗(yàn)方法 3 3 1 試驗(yàn)步驟 1 、凝膠柱的預(yù)處理：稱取適量的干凝膠，用洗脫劑充分溶脹( 可用加熱法溶 脹縮短溶脹時間) ； 2 、分離柱：將溶脹好的凝膠緩慢倒入層析柱，使其均勻沉降。待沉降到所需高 度后，繼續(xù)用3 5 倍柱床體積的洗脫液淋洗以平衡柱子： 3 、樣品：稱取適量樣品溶于少量洗脫劑中充分溶解，超聲排氣后，用滴管緩慢 將其加入柱內(nèi)，待樣品完全滲入凝膠后接上自動部分收集器開始收集； 4 、收集洗脫液：設(shè)定適當(dāng)?shù)暮懔鞅昧魉俸妥詣硬糠质占鞯氖占瘯r間； 5 、收集液的檢測； 6 、合并含e c g 兒茶素單體的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得成品。 7 、合并含e g c g ( g c g ) 兒茶素單體的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后待純化。 3 3 2h p l c 檢測條件 儀器：w a t e r s5 1 5 系列高效液相色譜儀器 分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) 檢測器：2 4 8 7 雙波長紫外檢測器 檢測波長： = 2 8 01 m 流動相：重蒸水乙腈乙酸乙酯= 8 6 1 2 2 ( 體積比) 流速：1 o m l m i n a u f s = 2 0 0 0 3 3 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谶x擇適宜預(yù)分離兒茶索單體的試驗(yàn)條件，由于影響因素多， 欲從較少的試驗(yàn)中得到最優(yōu)的試驗(yàn)條件，故采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。 3 3 3 1 試驗(yàn)?zāi)康募翱疾熘笜?biāo) 1 試驗(yàn)?zāi)康模?使用安全無毒，廉價的原料，采用簡單易行，成本低廉的操作，一次分離 兒茶素單體e c g 及e g c g 。由于e g c g 和g c g 為同分異構(gòu)體，難以一次將其分開， 囂戴預(yù)分離玲段將潑袋戇e g c g 積g c g 兩個零體夔瀑合滾終為一令筑分，德愛續(xù) 純化。 2 ，試獫考察攆標(biāo)：( 為考察囂條鋅藩努離洼黢辯窩躬澎璃，均澄蘸2 0 0 0 r a l 浚虢 液為分析對毅) ( 1 ) 考察鑫單缽戇分離度： 試驗(yàn)中，采用自動部分收集器收集洗脫液，每試鍺收集的洗脫液體積約l o m l 采用2 + 2 中建立的離效液搬色譜定性及定量方法對每試管中的洗脫液成分避行 定憔、定量測定。將每試管中測得的兒茶素e c g 質(zhì)徽之和作為洗脫出的e c g 總 質(zhì)量，而將與其它兒茶素及咖啡因完全分離，h p l c 檢測圖上只含有e c g 吸收峰 的洗脫液部分中e c 6 的質(zhì)量作為洗脫液中e c g 單體質(zhì)量。隔理，可以測褥澆脫 出的e g c g 及g c g 總質(zhì)量和單體質(zhì)量，在這里由于e g c g 及g c g 較難分離，先將 它 l 作為一個整體考察，印談為h p l c 檢測潮上只食有e g c g 幫g c g 吸浚蜂靜洗 脫液就是e g c g 單體及g c g 單體部分。各兒茶索單體質(zhì)量與該兒茶索總質(zhì)量的百 分比為分離鷹，勢離發(fā)越接送予1 0 0 ，表臻單薅蒜效采越搿。 a