（微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）深海適冷菌分泌蛋白酶的發(fā)酵優(yōu)化及熱穩(wěn)定性保護(hù).pdf

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 本論文以本實(shí)驗(yàn)室保存的深海適冷交替假單孢菌p s e u d o a l t e r m o n a ss p s m 9 9 1 3 所產(chǎn)的適冷蛋白酶為研究對(duì)象 著眼于解決產(chǎn)酶效率和酶的穩(wěn)定性?xún)煞?面制約適冷蛋白酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素 取得了一定的進(jìn)展 首先對(duì)p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化 研究結(jié)果表 明 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量檸檬酸鈉有利于提高產(chǎn)酶 蛋白質(zhì)類(lèi)氮源物質(zhì)如 豆粕 豆餅粉對(duì)產(chǎn)酶具有促迸作用 較易吸收利用的氮源 如豆粕水解液 蛋白 胨 尿素 銨鹽等 對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用 鈣 鎂離子對(duì)產(chǎn)酶都有一定的促進(jìn)作用 而鋅 銅 鐵離子對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用 表面活性劑吐溫8 0 和s d s 都對(duì)產(chǎn)酶有促 進(jìn)作用 磷酸鹽是產(chǎn)酶必需的 發(fā)酵產(chǎn)酶是好氧過(guò)程 裝液量較少對(duì)產(chǎn)酶比較有 利 發(fā)酵液初始p h 7 0 以上有利于產(chǎn)酶 優(yōu)化后產(chǎn)酶提高了約6 5 但尚未達(dá) 到工業(yè)化生產(chǎn)的要求 需進(jìn)一步對(duì)菌株加以改造 以提高其產(chǎn)酶效率 然后對(duì)p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶粗酶及純酶的熱穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究 結(jié) 果表明 p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶粗酶及純酶溶液對(duì)熱都比較敏感 熱穩(wěn)定性較 差 粗酶液在室溫 2 0 2 5 和3 0 下保溫9 6 小時(shí)后酶活分別喪失8 3 6 和 9 4 9 純酶溶液在3 0 下6 0 m i n 酶活喪失4 0 3 在4 0 下2 0 r a i n 酶活喪失 6 8 9 然而干燥后的p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶粗酶粉卻具有很好的穩(wěn)定性 酶 粉在室溫和3 0 c 下保存三個(gè)月 酶活基本沒(méi)有喪失 其穩(wěn)定性完全可以達(dá)到工 業(yè)化生產(chǎn)酶制劑的要求 結(jié)合以前的研究結(jié)果 進(jìn)一步表明p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋 白酶在溶液狀態(tài)下對(duì)熱敏感的主要原因是自溶 而非熱變性 因此如何阻止該適 冷蛋白酶自溶是保持其在溶液中穩(wěn)定性的關(guān)鍵 比較了凡種不同的糖 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 乳糖 海藻糖 對(duì)粗酶液穩(wěn) 定性的保護(hù)作用 海藻糖的保護(hù)作用最為顯著 進(jìn)一步研究了海藻糖在不同溫度 條件 2 0 3 0 c 4 0 2 下以及不同濃度的海藻糖對(duì)粗酶液的保護(hù)情況 結(jié)果 表明 不同溫度 2 0 4 0 c 下 海藻糖對(duì)粗酶液熱穩(wěn)定性都有很好的保護(hù)作用 在一定程度上有效地阻止了適冷酶蛋白的自溶 而且溫度越高 這種保護(hù)作用就 越顯著 海藻糖對(duì)粗酶液熱穩(wěn)定性保護(hù)作用的最佳濃度為1 0 1 5 海藻糖用 于適冷蛋白酶純酶的穩(wěn)定性保護(hù)同樣取得了很好的效果 加入海藻糖后的純酶溶 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 液4 0 保溫3 0 m i n 酶活基本沒(méi)有喪失 進(jìn)一步對(duì)海藻糖保護(hù)適冷酶熱穩(wěn)定性的機(jī)理進(jìn)行了探討 利用高效毛細(xì)管電 泳 f i p c e 高效 快速的特點(diǎn) 實(shí)時(shí)檢測(cè)了p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶純酶在4 0 下自溶的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及海藻糖對(duì)酶蛋白的穩(wěn)定性保護(hù)作用 結(jié)果表明 海藻糖 加入前后 p s p s m 9 9 1 3 適冷蛋白酶的毛細(xì)管電泳行為發(fā)生了明顯的變化 海藻 糖的存在 可以在一定程度阻止適冷酶蛋白自溶的發(fā)生 起到穩(wěn)定適冷蛋白酶活 性的作用 根據(jù)f i p c e 檢測(cè)數(shù)據(jù) 結(jié)合國(guó)外近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 研究結(jié)果 對(duì) 海藻糖穩(wěn)定酶蛋白活性的機(jī)制進(jìn)行了分析 推測(cè)海藻糖對(duì)酶分子的穩(wěn)定性保護(hù) 作用是通過(guò)對(duì)酶蛋白整體結(jié)構(gòu)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的 這種結(jié)合作用的驅(qū)動(dòng)力來(lái)自于酶 蛋白表面的親水性以及海藻糖強(qiáng)的水合特性 海藻糖與酶蛋白之間似乎不存在強(qiáng) 的氫鍵作用 關(guān)鍵詞 適冷蛋白酶發(fā)酵條件穩(wěn)定性海藻糖高效毛細(xì)管電泳 i i 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t t h e r ea r et w o k e y l i m i t sw h e nc o l d a d a p t e d p r o t e a s ei su s e di ni n d u s t r y o n ei se n z y m e p r o d u c t i o ne f f i c i e n c y a n dt h eo t h e ri si t ss t a b i l i t y w eh a v es t u d i e dt h ec o l d a d a p t e d p r o t e a s es e c r e t e db yc o l d a d a p t e dp s e u d o a l t e r m o n a ss p s m 9 9 1 3p r e s e r v e di no u rl a b a n dm a d es o m ea c h i e v e m e n t st os o l v et h ea b o v e p r o b l e m s f i r s t t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ec o l d a d a p t e dp r o t e a s es e c r e t e db yp s p s m 9 9 1 3w e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc i t r a t ew o u l di n c r e a s et h ep r o d u c t i o n o f p r o t e a s e i fb e a n b i t sa n db e a n c a k ep o w d e r sw e r ea d d e d t ot h em e d i aa sn i t r o g e n s o t a c e s t h ey i e l do fp r o t e a s ei n c r e a s e d w h i l et h en i t r o g e ns o t c e t h a tc o u l db e a b s o r b e d e a s i l y s u c h a sb e a n b i t s h y d r o l y s a t e p e p t o n e u r e a a n d a m m o n i u m r e s t r a i n e dt h ep r o d u c t i o no f p r o t e a s e s o m em e t a li o n ss u c ha sm g c a 2 p r o m o t e d t h ep s p s m 9 9 1 3t os e c r e tp r o t e a s e w h i l eo t h e r ss u c ha sz n c u 2 f e 2 h a v en e g a t i v e e f f e c t s u r f a c e a c t i v ea g e n t s t w e e n8 0a n ds d s c o u l di n c r e a s et h ep r o d u c t i o no f p r o t e a s e p h o s p h a t ew a sn e c e s s a r yf o rp s p s m 9 9 1 3t os e c r e tp r o t e a s e o x y g e nw a s s t r i c t l y n e e d e di n f e r m e n t a t i o n l e s sl i q u i d c u l t u r em e d i u mw a sb e n e f i c i a l f o r p r o d u c t i o no fp r o t e a s e t h ei n i t i a lp h o ft h em e d i u ma b o v e7w a sg o o df o rp r o t e a s e p r o d u c t i o n t h ey i e l do fp r o t e a s eh a d i n c r e a s e db y6 5 a f t e ro p t i m i z e d w h i c hs t i l ln o t a c c o r dw i t ht h es t a n d a r do fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o nh o w c v e r f u r t h e re f f o r t sl i k e s t r a i n e n g i n e e r i n gn e e d e d t oi m p r o v et h ee n z y m e p r o d u c t i o ne f f i c i e n c y s e c o n d t h es t a b i l i t i e so fc r u d ea n dp u r i f i e dc o l d a d a p t e dp r o t e a s e ss e c r e t e db y e s p s m 9 9 1 3 w e r es t u d i e d r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h e y a l ea l l t h e r m o l a b i l e t h ea c t i v i t yo fc r u d ec o l d a d a p t e dp r o t e a s ed e c r e a s e d8 3 6 a tr o o m t e m p e r a t u r e f o r9 6 ha n dd e c r e a s e d9 4 9 a t3 0 cf o r9 6 h t h ee n z y m ea c t i v i t y d e c r e a s e d 4 0 3 a t3 0 f o r6 0 r a i na n dd e c r e a s e d6 8 9 a t4 0 f o r2 0 m i n h o w e v e r t h ec r u d ee n z y m ew a ss t a b l ea f t e rf r e e z i n g d r yo rb e i n gd r i e da tr o o m t e m p e r a t u r e w h i l et h ee n z y m ep o w d e rw a ss t o r e da tr o o mt e m p e r a t u r ea n d3 0 c f o r t h r e em o n t h s t h ep r o t e a s ea c t i v i t yd i dn o td e c r e a s e w h i c ha c c o r d e dw i t ht h es t a n d a r d o fi n d u s t r i a le n z y m e p r e p a r a t i o n a c c o r d i n g t ot h er e s e a r c hr e s u l t sb e f o r e c a u s eo ft h e t 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 p r o t e a s et h e r m o l a b i l e 證s o l u t i o ni sf u r t h e ri n d i c a t e dt ob e a u t o l y s i s n o td e n a t u r a t i o n s o t h ek e y t ok e e p p r o t e a s es t a b l ei ns o l u t i o ns t a t ei st op r e v e n ti t sa u t o l y s i s s e v e r a ls u g a r sw e r eu s e df o rs t a b i l i z i n gt h ec r u d ep r o t e a s e t r e h a l o s eh a sr e m a r k a b l e e f f e c t c o m p a r e dt o o t h e rs u g a r s s ot h es t a b i l i z e de f f e c t so ft r e h a l o s ea tv a r i o u s t e m p e r a t u r e s w e r ef u r t h e rs t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt r e h a l o s ec o u l ds t a b i l i z et h e c r u d ep r o t e a s ee f f e c t i v e l ya n di t sp r o t e c t i v ee f f e c t sw o u l di n c r e a s ew h e n t e m p e r a t u r e r i s e t h eo p t i m a c o n c e n t r a t i o no fu e h a o s et os t a b i l i z e dc r u d ee n z y m ej s1 0 1 5 t r e h a o s eh a st h es a m ee f f e c to ns t a b i l i z i n gt h ep u r i f i e dp r o t e a s e w h i c hc o u l dr e m a i n a c t i v i t yc o n s t a n ta tt h ep r e s e n c eo f t r e h a l o s ea t4 0 c f o r3 0 m i n l a s t t h ea u t o l y s i sp r o c e s s e so fp u r i f i e dp r o t e a s ew i t ha n dw i t h o u tt h ep r o t e c t i o no f t r e h a l o s ea t4 0 cw e r ed e t e c t e d 謝血c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i ts h o w e dt h a tt h e r e s u l t sw e r ed i f f e r e n tmt w oc o n d i t i o n s t r e h a o s ec o u l di n h i b i ta u t o l y s i sa n ds t a b i l i z e t h ep r o t e a s e t h es t a b i l i z a t i o nm e c h a n i s mw a si n f e r r e da c c o r d i n gt ot h er e c e n tr e s e a r c h r e s u l t so fh o m ea n da b r o a d t h a tt r e h a l o s es t a b i l i z e dt h e p r o t e a s eb y a c to ni t s i n t e g r a t e ds t r u e l u r e t h ei m p e t u s o fc o m b i n a t i o no ft r e h a l o s ea n d p r o t e a s ec o m e s f r o m h y d r o p h i l i cp r o p e r t y o fp r o t e a s es u r f a c ea n dh y d r a t i o no f t r e h a l o s e t h e r es e e m sn o h y d r o g e n b o n da c t i o nb e t w e e n t h e m k e yw o r d s c o l d a d a p t e dp r o t e a s e f e r m e n t a t i o n s t a b i l i t y t r e h a l o s e h p c e 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學(xué)位論文 是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下 獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果 除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外 本論 文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果 對(duì)本 文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體 均已在文中以明確方式標(biāo)明 本人完全意識(shí)到本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān) 論文作者簽名 日期 加0 廠 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 同意 學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版 允 許論文被查閱和借閱 本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部 或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索 可以采用影印 縮印或其他 復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定 論文作者簽名 避導(dǎo)師簽名三越日 期 叢皇i 辮 一 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章前言 1 1 研究背景 海洋是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的資料寶庫(kù) 海洋面積占地球表面的7 1 海 水總體積占地球總水量的9 7 浩瀚海洋中生活著2 0 萬(wàn)余種生物 豐富多彩的 海洋生物資源具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景 海洋農(nóng)業(yè) 將是為人類(lèi)供應(yīng)蛋白質(zhì)的主要產(chǎn) 地 海洋生物天然產(chǎn)物 將為人類(lèi)提供治療疑難病的特效藥物和特殊功用的生化 產(chǎn)品 海洋作為地球最大的生態(tài)系統(tǒng) 將對(duì)維護(hù)地球生存環(huán)境起舉足輕重的作用 林錦湖1 9 9 4 在 2 1 世紀(jì)是海洋開(kāi)發(fā)的新世紀(jì) 的呼聲中 發(fā)展海洋生物 技術(shù) 加快海洋生物資源的開(kāi)發(fā)利用進(jìn)程 成了當(dāng)今科學(xué)研究最具發(fā)展前景的領(lǐng) 域 也成了科技較發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)今后經(jīng)濟(jì)發(fā)展的戰(zhàn)略重點(diǎn)之一 林岳夫 尹衛(wèi) 平1 9 9 6 海洋生物技術(shù)是運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué) 化學(xué)和工程學(xué)的手段 利用海洋生物體 生命系統(tǒng)和生命過(guò)程 生產(chǎn)有用產(chǎn)品的 f 高技術(shù)科學(xué) 是現(xiàn)代生物技術(shù)與海洋 生物學(xué)相交叉的產(chǎn)物 是8 0 年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的新興科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域 海洋生物 技術(shù)的發(fā)展將使人類(lèi)更有效地開(kāi)發(fā)海洋生物資源 對(duì)人多地少的我國(guó)生存和發(fā)展 具有重要意義 將是未來(lái)知識(shí)經(jīng)濟(jì)的重要體現(xiàn) 我國(guó)海洋生物經(jīng)分類(lèi)鑒定的有2 0 2 7 8 種 分屬4 4 個(gè)門(mén) 其中1 2 個(gè)門(mén)是海洋 中所特有的 印莉萍1 9 9 9 1 9 9 6 年 我國(guó)政府將海洋生物技術(shù)列入8 6 3 國(guó)家 高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃 目前海洋生物技術(shù)一方面著眼于天然資源的開(kāi)發(fā) 另一方面利 用細(xì)胞融合 染色體操作進(jìn)行海洋生物的育種 海洋微生物與微藻類(lèi)的研究 海 洋生物具有耐鹽 耐寒 耐熱 耐壓 光合成 固氮 硝酸還原 浮游 發(fā)光和 吸磁等機(jī)能 人們期待在基因水平上闡明這些機(jī)能并加以利用 基于此 本實(shí)驗(yàn) 室開(kāi)展了對(duì)海洋深海適冷微生物的研究工作 并取得了海洋8 6 3 計(jì)劃的資助 本 篇論文就是本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的海洋8 6 3 課題 深海適冷蛋白酶的研究 的部分 內(nèi)容 深海是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境 這里永久低溫 火山口除外 高壓 黑暗 生活在這種特殊環(huán)境下的微生物必然有特殊的生理代謝機(jī)制 對(duì)深海微生物的研 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 究不僅有助于我們了解生命的起源 而且可以了解各種極端微生物的生活特性 有助于我們對(duì)深海微生物資源的開(kāi)發(fā)利用 深海中微生物種類(lèi)和數(shù)量之多超乎人 們的想象 在深海海水中存在著各種微型浮游微生物 海底沉積物中微生物的種 類(lèi)更為廣泛 n o r k r a n sa n ds t e h n1 9 7 8 v e t r i a n i 等1 9 9 9 t a k a m i 等 1 9 9 7 通 過(guò)平板培養(yǎng)在1 0 8 9 8 米深的海底沉積物中發(fā)現(xiàn)其中的微生物包括放線菌 真菌 非極端菌和各種極端菌如嗜堿菌 嗜熱菌 嗜壓菌 嗜冷菌等 通過(guò)1 6 s r d n a 同源序列比較發(fā)現(xiàn)其中的微生物種類(lèi)遠(yuǎn)比培養(yǎng)出來(lái)的多 由于深海絕大部分處于 低溫 可以肯定 在這里生長(zhǎng)的微生物大多為嗜冷或耐冷的 在2 5 0 0 6 5 0 0 米 深的海底沉積物中 分離的微生物可以證實(shí)這一點(diǎn) 其中大多為嗜冷的 在2 0 以上不能生長(zhǎng) 例如深海菌株d b 6 7 在1 個(gè)大氣壓下在i 0 c 以上則不能生長(zhǎng) 但在高壓下 其生長(zhǎng)溫度則要高一些 k a t o 等1 9 9 5 k a t o 等1 9 9 6 i s a k s e na n d j o r g e n s e n1 9 9 6 1 1 1 適冷微生物 1 1 1l 定義 適冷微生物 c o l d a d a p t e dm i c r o o r g a n i s m 也稱(chēng)低溫微生物 最早的適冷微 生物是由f o r s t e r 發(fā)現(xiàn)的 他于1 8 8 7 年報(bào)道了在冷凍保存的魚(yú)中分離到能在o c 下生長(zhǎng)良好的細(xì)菌 此后 大量能在低溫環(huán)境中生存的有機(jī)生物體被發(fā)現(xiàn) 主要 是細(xì)菌 酵母 單細(xì)胞藻類(lèi) 霉菌 r u s s e l l1 9 9 2 g o u n o ta n dr u s s e l l1 9 9 9 在 1 9 0 2 年 s c h m i d t n i e l s o 首先將能在0 下生長(zhǎng)的微生物命名為嗜冷微生物 p s y e h r o p h i l e s 以后 i n g r a h a m 和s t o k e s 1 9 5 9 s t o k e s 1 9 6 3 給出一個(gè) 更為準(zhǔn)確的定義 他們將在一周或兩周內(nèi)在0 c 下能夠生長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落的 微生物稱(chēng)為嗜冷微生物 并區(qū)分成專(zhuān)性嗜冷微生物 o b l i g a t ep s y c h r o p h i l e s 和 兼性嗜冷微生物 f a c u l t a t i v ep s y c h r o p h t i e s 專(zhuān)性嗜冷微生物是指最適生長(zhǎng)溫度 低于2 0 c 的微生物 而兼性嗜冷微生物是指最適生長(zhǎng)溫度高于2 0 c 的微生物 由于在這個(gè)定義中 兼性嗜冷微生物并沒(méi)有嗜低溫的特征 與中溫微生物難以區(qū) 別 因此 m o r i t a 于1 9 7 5 年重新給出了一個(gè)適冷微生物的定義 他將適冷微生 物分成兩大類(lèi) 嗜冷微生物 p s y c h r o p h i l e s 和耐冷微生物 p s y c h r o t r o p h s 嗜 冷微生物是指最適生長(zhǎng)溫度不高于1 5 c 最高生長(zhǎng)溫度不高于2 0 4 c 的微生物 耐冷微生物是指在0 c 下能夠生長(zhǎng)繁殖 最適生長(zhǎng)溫度為2 0 2 5 的微生物 現(xiàn) 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 在m o r i t a 關(guān)于適冷微生物的定義已被廣泛采用 1 1 1 2 分布及微生物多樣性 由于地球生物圈的8 5 左右每年都會(huì)降到5 c 以下 7 5 常年處于5 以下 j a b a r o s s r y lm o d t a1 9 7 8 p e t e rp s h e r i d a n n i c h o l a sp a n a s i k j o n n am c o o m b s j e a ne b r e n c h l e y2 0 0 0 因此適冷微生物在地球上廣泛分布 如南北兩 極地區(qū) 冰窟 高山 深海乃至冷庫(kù)等低溫環(huán)境中都有適冷微生物存在 自f o r s t e r 發(fā)現(xiàn)適冷微生物以來(lái) 各國(guó)科學(xué)家對(duì)低溫環(huán)境下適冷微生物的多樣性 適冷微生 物的分離培養(yǎng) 生理特征 遺傳特征等進(jìn)行了廣泛的研究 對(duì)適冷微生物的研究 不僅有助于我們了解適冷微生物在這些低溫環(huán)境下對(duì)生物鏈 地球的物質(zhì)循環(huán)所 起的作用 而且為人類(lèi)利用這些適冷微生物資源奠定了基礎(chǔ) 適冷微生物在自然界中的種類(lèi)很多 具有廣泛的微生物區(qū)系 已發(fā)現(xiàn)的適冷 微生物既有真細(xì)菌 藍(lán)細(xì)菌 又有酵母菌 真菌和藻類(lèi)及古細(xì)菌 從各種環(huán)境中 分離培養(yǎng)的結(jié)果來(lái)看 細(xì)菌的數(shù)量最大 種類(lèi)也最多 在革蘭氏陰性菌中 數(shù)量 最多 分布最廣的是假單胞菌屬 其次是a c h r o m o b a c t e r f l a v o b a c t e r i u m a l c a l i g e n e s a e r o m o n a s x a n t h o m o n a s s e r r a t i a 等 低溫的革蘭氏陽(yáng)性菌有 a r t h r o b a c t e r i u m b a c i l l u s 和m i c r o c o c c u s 等 適冷真菌在自然界中也很多 適冷 的酵母t o r a l o p s i s 屬和c a n d i d a 屬是從極地冰 雪 土壤等自然環(huán)境中分離到的 另外 從冷藏食品中分離到的適冷酵母有c a n d i d a c r y p t o c o c c u s r h o d o t o r a l a t o r a l o p s i s h a n s e n i a s p o r a 和s a c c h a r o m y c e s 其中c a n d i d a 是存在最為普遍的適 冷酵母 目前已分離到的適冷真菌至少屬于8 個(gè)屬 數(shù)量最多 分布最廣的是 p e n i c i l l i u m 和c l a d o s p o r i u m m a r g e s i na n ds c h i n n e r l9 9 4 在極地和深海中也 分離到一些種類(lèi)的病毒 這些病毒也可能具有適冷特征 d a n o v a r o a n ds e r r e s i2 0 0 0 f u h r m a n1 9 9 9 在深海中還存在著適冷的藍(lán)細(xì)菌和綠藻 j a n n a s c ha n dt a y l o r 1 9 8 4 在雪原上存在的著名的 紅雪 現(xiàn)象 實(shí)際上是由幾種適冷的雪藻引起 的 最常見(jiàn)的一種是c h l a m y d o m o n a sn i v o l 括 這些雪藻在i o c 以上不能生長(zhǎng) 產(chǎn)生鮮紅的孢子形成所謂的 紅雪 b r o c k1 9 7 9 從低溫環(huán)境中所分離到的適冷微生物中 耐冷微生物的數(shù)量往往多于嗜冷微 生物 比如k o b o f i 1 9 8 4 從南極海水中分離到1 5 5 株細(xì)菌中 耐冷菌占7 7 而嗜冷菌占2 3 這是由于耐冷菌在適應(yīng)溫度快速改變以及對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物的 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 利用上更具優(yōu)勢(shì) 這些適冷微生物對(duì)陸地和海洋低溫生態(tài)環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)和生 物質(zhì)的初步生產(chǎn)具有重要作用 由于采樣的困難以及培養(yǎng)技術(shù)的限制 目前分離 到的適冷微生物種類(lèi)還只是所有適冷微生物中很少的一部分 1 1 1 3 適冷機(jī)制 適冷微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化適應(yīng) 形成了一套適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊結(jié)構(gòu)和特 殊的代謝機(jī)制 1 適冷微生物的適冷結(jié)構(gòu) 對(duì)適冷微生物適冷結(jié)構(gòu)研究最多的是其膜的結(jié)構(gòu) 方面 與中溫微生物和 嗜高溫微生物相比較而言 適冷微生物膜中不飽和脂肪酸的比例增大 環(huán)狀脂肪 酸的比例減小 從而導(dǎo)致膜脂的熔點(diǎn)降低 使膜脂在低溫下保持液態(tài) 具有流動(dòng) 性 這對(duì)適冷菌在低溫下的生存非常重要 b h a k o om h e r b e r t r a1 9 8 0 m a r r a n d i n g r a h a m1 9 6 2 s u u t a r im l a a k s os1 9 9 3 n e i d l e m a n1 9 9 0 r u s s e l la n df u k u n a g a 1 9 9 0 另一方面 膜的面積增大 使得適冷微生物在低溫環(huán)境下也可以吸收更 多的營(yíng)養(yǎng) r u s s e la n df u k u n a g a 1 9 9 0 增加膜中不飽和脂肪酸含量從而改變膜 的結(jié)構(gòu)是微生物適應(yīng)低溫的策略之一 己被許多試驗(yàn)證實(shí) 將e c o l i 或s a l m o n e l l a 突變體培養(yǎng)在含不飽和脂肪酸的培養(yǎng)基中會(huì)導(dǎo)致這些菌的最低生長(zhǎng)溫度降低 增 加其適冷性 m a r ra n di n g r a h a m1 9 6 2 c a n i l l a c 等 1 9 8 2 將中溫的 耐冷的 嗜冷的三株a r t h r o b a c t e r 菌株分別培養(yǎng)在低于其最適溫度的溫度下 結(jié)果三株菌 膜脂中不飽和脂肪酸的含量都增多 膜中的不飽和脂肪酸是由不飽和脂肪酸合成 酶合成的 對(duì)嗜冷菌如b a c i l l u s l i s t c r i a p s e u d o m o n a s b r e v i b a c t e r i u m 和嗜冷 酵母的研究表明 低溫能誘導(dǎo)不飽和脂肪酸合成酶的合成 高溫使適冷菌失去合 成此酶的能力并導(dǎo)致酶失活 因此適冷菌在高溫下難以保持膜中不飽和脂肪酸的 含量 這可能也是適冷菌不耐高溫的原因之一 g o t m o t1 9 8 6 除了對(duì)適冷菌膜的結(jié)構(gòu)研究較多之外 對(duì)適冷菌所產(chǎn)生的適冷酶的結(jié)構(gòu)也有 較為詳細(xì)的研究 適冷酶特殊的結(jié)構(gòu)特性將在下面的適冷酶綜述部分具體說(shuō)明 適冷微生物能夠在低溫下正常生長(zhǎng) 除了有適應(yīng)低溫的膜結(jié)構(gòu)和酶結(jié)構(gòu)之 外 還有其它不同于中溫或高溫微生物的適低溫結(jié)構(gòu) 2 適冷微生物的適冷代謝機(jī)制 適冷微生物能夠適應(yīng)低溫特殊的生態(tài)環(huán)境 除了有適應(yīng)低溫的特殊結(jié)構(gòu)之 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 外 更重要的是有適應(yīng)低溫的各種代謝機(jī)制 保證其在低溫下的正常生長(zhǎng) 這些 機(jī)制包括低溫下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn) d n a 的復(fù)制合成 蛋白質(zhì)的合成 合 成代謝和分解代謝的正常進(jìn)行 能量代謝的正常進(jìn)行 細(xì)胞的分裂等 辛明秀 馬延和1 9 9 6 a 保持膜對(duì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常轉(zhuǎn)運(yùn)吸收 中溫微生物在低于5 時(shí)一般就不能吸收代謝外源物質(zhì)而只能代謝內(nèi)源物 質(zhì) 這是限制其在低溫下生長(zhǎng)的原因之一 而適冷微生物由于其膜在0 c 甚至0 以下仍具有流動(dòng)性 因此它們?cè)? c 甚至0 以下仍可吸收胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) m o r t o n 等 1 9 7 8 研究了嗜冷 中溫和嗜熱的t o r u l o p s i s 屬酵母對(duì)胞外葡萄糖的 轉(zhuǎn)運(yùn)能力 發(fā)現(xiàn)只有嗜冷酵母能夠在2 c 的低溫下轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖 h e r b e r t 等 1 9 9 2 研究比較嗜冷的弧菌和耐冷的假單胞菌在不同溫度下對(duì)葡萄糖和乳糖的吸收速度 時(shí)發(fā)現(xiàn) 嗜冷弧菌吸收利用葡萄糖和乳糖在0 c 時(shí)最快 而在1 5 2 0 c 時(shí)降低 而耐冷假單胞菌在2 0 c 時(shí)吸收葡萄糖和乳糖最快 由此可見(jiàn) 適冷微生物適應(yīng) 溫度越低 在低溫下膜轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力越強(qiáng) 適冷微生物這種能夠在 低溫下保持膜對(duì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)吸收的能力 為其在低溫下的正常生長(zhǎng)提供了 物質(zhì)基礎(chǔ) b 在低溫下產(chǎn)生大量不同類(lèi)型的酶 許多研究表明 適冷微生物的最高產(chǎn)酶溫度在最適生長(zhǎng)溫度以下 h o s h i n o 等1 9 9 7 適冷微生物一些酶的產(chǎn)生是由生長(zhǎng)溫度調(diào)節(jié)而不是生長(zhǎng)速率調(diào)節(jié)的 適冷微生物在低溫下產(chǎn)生更多的酶可以補(bǔ)償?shù)蜏叵旅富钶^低的缺陷 保證其高效 率地利用低溫環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) b u r i n i 等1 9 9 4 g u i l l o u 等1 9 9 5 適冷菌還能夠產(chǎn)生不同類(lèi)型的同工酶 而且這些同工酶的熱穩(wěn)定性不同 b r e n c h l e y 等 1 9 9 6 發(fā)現(xiàn)一株嗜冷菌產(chǎn)生的b 半乳糖苷酶同工酶具有不同的最 適溫度 產(chǎn)生不同類(lèi)型的同工酶可能是適冷微生物適應(yīng)低溫的方式之一 c 保持酶在低溫下的高催化效率 由于適冷微生物產(chǎn)生的適冷酶的結(jié)構(gòu)更具柔性 利用較少的能量就可發(fā)生構(gòu) 象轉(zhuǎn)變 因而 適冷酶具有k m 低 e a 低 k a t 高等特點(diǎn) 使其在低溫下具有較 高的催化效率 如h o s h i n o 1 9 9 7 從海洋魚(yú)類(lèi)中分離的p s e u d o m o n a ss p p l 4 產(chǎn)生的適冷蛋白酶最適催化溫度為2 5 在0 c 仍具有最高活力的1 5 而中 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 溫蛋白酶的最適催化溫度一般為5 0 6 0 c 在0 下只具有不到1 的最高酶活 力 提高酶在低溫下的催化效率也是適冷微生物適應(yīng)低溫環(huán)境的途徑之一 d 加快蛋白質(zhì)降解 提高生長(zhǎng)速率 嗜冷菌的最適生長(zhǎng)溫度低于1 5 c 耐冷菌的最適生長(zhǎng)溫度也一般為2 0 左 右 因此適冷菌在低溫下具有更高的生長(zhǎng)速率 研究發(fā)現(xiàn) 隨著溫度的降低 適 冷菌的生長(zhǎng)速率降低得比中溫菌慢 適冷菌的溫度系數(shù)q 1 0 小于中溫菌的q l o 即適冷菌可以在低溫下保持高的生長(zhǎng)速率 m a r g e s i na n ds c h i n n e r1 9 9 4 一些 研究表明 耐冷菌的蛋白質(zhì)降解速率比中溫菌的要快得多 p o t i e r 等1 9 8 5 a r a k i 1 9 9 1 a m i d1 9 9 2 蛋白質(zhì)的迅速轉(zhuǎn)換是適冷菌節(jié)省能量的途徑之一 特別是在 低溫生態(tài)環(huán)境寡營(yíng)養(yǎng)的情況下 加快蛋白質(zhì)降解可以迅速為蛋白質(zhì)的合成提供氨 基酸 e 產(chǎn)生冷激蛋白 c s p s 冷激蛋白 c s p s 廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌中 是細(xì)胞在應(yīng)對(duì)冷 刺激時(shí)所產(chǎn)生的一系列7 k b 左右的蛋白質(zhì) 當(dāng)生長(zhǎng)溫度突然降低時(shí) 無(wú)論是適 冷微生物還是中溫微生物都會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生冷激蛋白 m a y r 等1 9 9 6 w h y t ea n d i l n i s s1 9 9 2 將嗜冷酵母t r i c h o s p o r o n p u l l u l a n s 的生長(zhǎng)溫度從而2 1 降為5 c 它在1 2 小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)合成了2 6 種冷激蛋白 j u l s e t ha n di n n i s s1 9 9 0 冷激蛋白中 有一些是酶 如與細(xì)胞膜在低溫下發(fā)生結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)的去飽和酶等 r u s s e l ln ja n d f u k u n a g an1 9 9 0 r u s s e l ln j1 9 9 2 冷激蛋白在適冷微生物對(duì)低溫的生理適應(yīng)過(guò) 程中發(fā)揮著重要作用 主要是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和m r n a 的折疊 隨著新的適冷微生物資源的發(fā)現(xiàn)和對(duì)適冷微生物適冷機(jī)制的詳細(xì)研究 對(duì)適 冷微生物的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛 1 1 2 適冷酶 近年來(lái)對(duì)適冷酶的研究越來(lái)越廣泛深入 由于適冷酶具有柔性較高的構(gòu)象 是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的很好的材料 因此近年來(lái)的研究主要側(cè)重于探討適冷酶 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 適冷酶在低溫下保持高催化效率的機(jī)制 同時(shí)探索適冷酶在 食品 紡織 洗滌劑及環(huán)境保護(hù)等行業(yè)中的應(yīng)用 g e r d a y 等1 9 9 7 g e r d a y 等 2 0 0 0 1 1 2 1 來(lái)源 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 目前所研究的適冷酶很大一部分是由適冷菌產(chǎn)生的 還有一部分適冷酶是由 中溫酶通過(guò)生物工程技術(shù)如基因定點(diǎn)突變等而產(chǎn)生的 d e m i r j i a n 等2 0 0 1 f e l l e r 等1 9 9 6 k a l l o 等1 9 9 7 r o o v e r sa n ds a n c h e z 2 0 0 1 t a g u c h i 等2 0 0 0 w i n t r o d e 等 2 0 0 0 目前已報(bào)道的適冷酶種類(lèi)很多 i s l l i i 等1 9 8 7 i y oa n df o r s b e r g 1 9 9 9 o h k u m a 等1 9 9 6 o c h i a l 等1 9 7 9 其中研究最多的是適冷菌產(chǎn)生的胞外酶如適 冷的q 淀粉酶 適冷蛋白酶 適冷脂酶等 由南極嗜冷菌a l t e r o m o n a sh a l o p l a n e t i s a 2 3 產(chǎn)生的a 淀粉酶是第一個(gè)被結(jié)晶的適冷酶 1 1 2 2 特性 適冷酶的特性概括起來(lái)主要包括以下三個(gè)方面 1 低溫下較高的催化活性 適冷酶的最適催化溫度一般明顯低于同類(lèi)中溫酶和高溫酶 如適冷蛋白酶的 最適催化溫度一般為3 0 4 0 而中溫蛋白酶的最適催化溫度一般為5 0 6 0 適冷酶一般在o c 甚至o c 以下仍具有較高的催化效率 目前報(bào)道的適冷酶均具 有此特征 適冷酶在o c 下的殘余酶活比例要比同類(lèi)中溫酶高出數(shù)倍 比如 適 冷菌f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e s 8 5 產(chǎn)生的適冷葡聚糖酶 在o 具有7 0 的最高 酶活 而同類(lèi)中溫酶在o c 只具有1 8 的最高酶活 i y oa n df o r s b e r g 1 9 9 9 適 冷酶的這一特性主要是由于適冷酶在低溫下能夠保持較高的轉(zhuǎn)換數(shù) k c a t 適 冷酶低溫下高的底物轉(zhuǎn)化效率 保證了適冷生物在低溫下的代謝效率 如由南極 嗜冷菌b a c i l l u st a 3 9 產(chǎn)生的s u b t i l i s i n 當(dāng)以s u c f a a f p n a 為底物時(shí) 在4 c 時(shí)轉(zhuǎn)化系數(shù)k c a t 為3 2 s i 而中溫菌b a c i l l u ss u b t i l 捃利用同樣的底物時(shí) 在4 c 時(shí) 的轉(zhuǎn)換系數(shù)k c a t 為1 8 s 1 f e l l e r 等1 9 9 6 由南極魚(yú)中分離的胰蛋白酶以l p a b a 為底物時(shí) 在5 c 時(shí)的k c a t 為2 9 m i f f l 而牛的胰蛋白酶用同樣的底物在4 時(shí)的 k c a t 為5 4 m i n l g e n i c o t 等1 9 8 8 實(shí)驗(yàn)表明 有許多適冷酶在低溫下的k m 值降低 k m 值的降低表明酶與底物親和力的增強(qiáng) 這是適冷酶在低溫下提高催 化效率的一種途徑 大部分適冷酶都是通過(guò)降低k m 或提高k c a t 或二者都改變 來(lái)提高酶在低溫下的催化效率 生理系數(shù)k c a t k m 值高是適冷酶的基本特征 適冷酶的活化能明顯低于中溫酶 表明酶進(jìn)行催化反應(yīng)所需的能耗少 反應(yīng)能夠 在低溫下進(jìn)行 降低活化能也是酶提高在低溫下催化效率的途徑之一 f e l l e r a n d g e r d a y1 9 9 7 適冷酶之所以能在低溫下保持高催化活性 必然有其分子結(jié)構(gòu)方 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 面的原因 按一般知識(shí)理論推測(cè) 應(yīng)該是酶活性位點(diǎn)發(fā)生了改變 但是大量研究 表明 所有參與反應(yīng)的氨基酸殘基在適冷酶和中溫酶中都是嚴(yán)格保守的 q i a n 等1 9 9 4 f i e l d sa n ds o m e r o1 9 9 8 d a m i c o 等2 0 0 0 因此 適冷酶的冷適應(yīng)分 子基礎(chǔ)必須另行找起 2 熱敏感性 絕大多數(shù)適冷酶只能在相對(duì)低的溫度下保持高催化效率 溫度稍高即很快失 活 表現(xiàn)出很高的熱敏感性 適冷酶的熱變性溫度均比同類(lèi)中溫酶低1 5 2 0 盡管近年來(lái)的研究并未發(fā)現(xiàn)適冷酶低溫下的高催化活性與其熱敏感性之間存在系 統(tǒng)性關(guān)聯(lián) 但是這種趨勢(shì)確實(shí)在自然界中普遍存在 近年來(lái)人們更傾向于認(rèn)為適 冷酶的熱敏感性是由于缺乏選擇壓力 而不是適冷菌為了提高低溫催化活性而誘 導(dǎo)形成的物理或化學(xué)約束的結(jié)果 m i y a z a k i 等2 0 0 0 w i n t r o d e 等人 2 0 0 1 通過(guò)對(duì)適冷枯草桿菌蛋白酶 4 1 進(jìn)行定向進(jìn)化獲得的高穩(wěn)定性突變體3 2 g 7 比 野生株蛋白酶適應(yīng)溫度更寬 活性更高 這表明適冷酶并非一定是不穩(wěn)定的 不 過(guò)通過(guò)對(duì)繼續(xù)傳代幾次獲得的穩(wěn)定突變株的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) 突變體蛋白酶盡管 在1 0 時(shí)對(duì)小分子底物的催化活性明顯高于中溫b p n 枯草桿菌蛋白酶 但并未 表現(xiàn)出更高的酪蛋白水解活性 t a g u c h i 等2 0 0 0 而且 在中溫枯草桿菌b p n 的適冷突變株中也發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定性降低的現(xiàn)象 在另一個(gè)與適冷枯草桿菌蛋白酶 4 1 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中 為提高中溫枯草桿菌b a c i l l u ss p h a e r i c u s 蛋白酶s i i 在低溫下 的催化活性 所獲得的四個(gè)適冷突變體中的三個(gè)表現(xiàn)出穩(wěn)定性的降低 w i n t r o d e 等2 0 0 0 因此 要揭示適冷酶的冷適應(yīng)性與熱敏感性之間的可能關(guān)系 還需要 更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)加以闡明 3 柔性 目前普遍被接受的假說(shuō)認(rèn)為 適冷酶在低的適宜溫度下較高的催化活性和較 強(qiáng)的熱敏感性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性的提高緊密相關(guān) f i e l d sp a s o m e r og n1 9 9 8 z a v o d s z k yp k a r d o sj s v i n g o r p e t s k og a1 9 9 8 對(duì)己報(bào)道的適冷q 淀粉酶 枯 草桿菌蛋白酶 b 內(nèi)酰胺酶 磷酸酶等的結(jié)構(gòu)研究表明 適冷酶在低溫下較同 類(lèi)的中溫酶和高溫酶具有更高的柔性 f e l l e ra n dg e r d a y1 9 9 7 在適冷酶的結(jié)構(gòu) 中 鹽橋的數(shù)量減少 疏水核內(nèi)芳香環(huán)的相互作用減弱 脯氨酸與精氨酸殘基數(shù) 量減少 酶的疏水性減弱 親水性增強(qiáng) 使酶與溶劑的相互作用增強(qiáng) 這些結(jié)構(gòu) 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 的改變都有利于酶分子柔性的增加 m a r s h a l l1 9 9 7 酶分子中在適當(dāng)部位的柔 性的增加 有利于活性位點(diǎn)與底物的接近和相互作用以及產(chǎn)物的釋放 這已被大 量研究所證實(shí) a i t t a l e b 等1 9 9 7 r u s s e l l 等1 9 9 8 如枯草芽孢桿菌蛋白酶 4 1 與其同源中溫酶相比 底物結(jié)合部位有兩個(gè)氨基酸殘基被取代 減少了活性部位 入口的空間位阻 使酶分子變得更具柔性 降低了催化過(guò)程中構(gòu)象改變所耗費(fèi)的 能量 在 4 1 中 鹽橋與芳香族相互作用的減少也使酶分子柔性增加 4 1 酶分 子表面有四個(gè)長(zhǎng)鏈的氨基酸殘基以及大量的極性氨基酸殘基 主要為天冬氨酸 使酶分子表面的長(zhǎng)度與極性增加 增強(qiáng)了酶分子與溶劑的相互作用 使酶更具柔 性 同時(shí)降低了酶分子的緊密度和穩(wěn)定性 d a v a i l 等1 9 9 4 根據(jù)目前對(duì)適冷酶的研究結(jié)果 可以認(rèn)為適冷酶有兩種通過(guò)柔性結(jié)構(gòu)進(jìn)行低 溫適應(yīng)的機(jī)制 也由此將適冷酶結(jié)構(gòu)的柔性分為兩種 一局部柔性和整體柔性 z e c c h i n o n 等2 0 0 1 1 局部柔性 對(duì)適冷磷酸甘油酸激酶 p g k 的d s c 差示掃描量熱 研究發(fā)現(xiàn) 適冷p