抗腫瘤藥物順鉑對人肺癌A549細胞生.docx

四川大學本科畢業(yè)論文 抗癌藥物順鉑對人肺癌A549細胞生長的影響抗腫瘤藥物順鉑對人肺癌A549細胞生長的影響摘要目的：以體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細胞為研究對象，了解A549細胞不同生長發(fā)育時期的特性。并觀察經(jīng)不同濃度順鉑、不同時間長度處理后，對A549生長的抑制作用，觀察這種抑制作用的性質，為順鉑對人肺腺癌的分子生物學治療提供理論依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)A549 細胞，以血球計數(shù)板檢測不同時期A549細胞生長情況，觀察其形態(tài)變化，并繪制生長曲線；用呈濃度梯度的順鉑處理人肺癌A549細胞,觀察順鉑對A549細胞生長的影響；再用特定濃度的順鉑處理A549細胞不同時間，檢測順鉑對A549細胞生長的影響。結果：正常生長的A549細胞，細胞數(shù)目增長最快的時間段為96108h，倍增時間為27.6小時。用濃度為1g/ml、2g/ml、5g/ml、10g/ml、15g/ml、20g/ml的順鉑溶液處理A549細胞48小時后，A549細胞數(shù)目從8*105降至2.7*105，用2g/ml、5g/ml 的順鉑濃度分別處理A549細胞不同時間，2g/ml濃度下，抑制率從3.57%上升至24.59%；5g/ml時，抑制率從8.32%升至42.24%。結論：順鉑對A549細胞生長的抑制作用隨著濃度的升高而變強。當順鉑濃度為2、5g/ml時，對肺腺癌細胞A549的抑制最為顯著。隨著順鉑處理時間的增長，其對A549細胞生長的抑制率逐步變高。用5g/ml 順鉑作用于A549細胞時，作用12h24h時的抑制最為顯著。主題詞:人肺癌A549細胞；順鉑；生長抑制ABSTRACTObjective: To culture human lung adenocarcinoma cell A549 in vitro, and study growing development in different growth stage. Investigate the influences on A549 cells at vary Cisplatin concentration and in various time quantum.Methods: In order to culture A549 cells in vitro, use hemocytometer to test growthism of A549 cells at different growth period. Observe its morphological changesand draw growth curve of A549 cells. Use Cisplatin in concentration gradientto stimulate A549 cells, and examine its effect on A549 cells; use Cisplatin to stimulate A549 cells in various time quantum, and investigate its influences.Results: The fastest growing period of A549 cells cultured in normal condition was 96 to 108 hours, and the double time was 27.6 hours. After 48 hours of stimulation of cisplatin at 120g/ml, the amount decreased from 8*105/ml to 2.7*105/ml. Use 2g/ml、5g/ml cisplatin to stimulate A549 cells in various time quantum, under 2g/ml, the inhibition rate rise from 3.57% to 24.59%;5g/ml, it was from 8.32% to 42.24%.Conclusion:The inhibition rate of A549 cells stimulated by cispltin grew along with the concentration of Cisplatin and reaction time quantum. At 2、5g/ml, cisplatins inhibition is the most markable; At 2、5g/ml，theres the most notable impact on A549 cells in 12 to 24 hours.Key Words Human Lung Cancer Cell A549; Cisplatin(DDP); Growth inhibition.目錄綜述21.癌癥21.1.癌癥概述21.2.癌癥的治療22.致癌藥物順鉑簡介22.1順鉑的發(fā)現(xiàn)22.2順鉑的作用機制22.3 順鉑的耐藥性23 腫瘤和細胞周期2實驗設計21研究目的22實驗方案設計23研究意義24材料與方法24.1 材料24.2 主要儀器24.3 主要試劑與耗材24.4 主要試劑配制25 實驗步驟25.1 凍存細胞的復蘇25.2 細胞的傳代25.3. 細胞的計數(shù)25.4. A549細胞生長曲線特征25.5 用不同濃度順鉑對A549細胞生長的影響25.6 用順鉑處理不同時間，順鉑對A549細胞生長抑制率的影響25.7 統(tǒng)計學分析26. 實驗結果26.1 人肺腺癌A549細胞生長曲線特征26.2不同濃度順鉑對A549細胞生長的影響26.3用順鉑處理不同時間，順鉑對A549細胞生長抑制率的影響27. 討論28. 結果與展望2翻譯2參考文獻2致謝236綜述在現(xiàn)今這個經(jīng)濟飛速發(fā)展，科技日新月異的時代，人們享受著前所未有的美好生活同時，卻也逃不出病魔的手掌。癌癥，成為人們的噩夢，帶來的陰影彌漫在人們心中，久久不能散去。近期的數(shù)據(jù)更是顯示：每年全世界每十萬人中有一百只三百五十人左右死于癌癥。Net.1癌癥，一躍升為當今社會非正常死亡的三大重要原因之一。1. 癌癥1.1. 癌癥概述癌癥是一種主要受外界環(huán)境影響引發(fā)的復雜的基因疾病。致癌因子可以是食物、水，也可能在空氣中出現(xiàn)，甚至是人類照射到的日光、接觸到的化學物質。由于上皮細胞包覆于機體表面，甚至是消化道上的上皮細胞，都能夠接觸到致癌物。所以90%的癌癥發(fā)生在上皮細胞這個事實就顯得不能么驚人了。1如今社會中，非接觸性病癥如心血管疾病和癌癥已經(jīng)代替了以前易感染的疾病成為影響人們身體健康的主要因素。截止1996年，世界范圍內有一千萬新增癌癥患者，有六百萬人死于癌癥。預計到2020年，將會有兩千萬新增病例，其中一千二百萬人會因為患有癌癥而死亡。Net.2造成這個結果的部分原因則是因為人們生活水平的穩(wěn)步升高。調查顯示，癌癥在老年人中的發(fā)病率遠遠高于正常水平。更令人吃驚的是不健康的生活方式，特別是吸煙和高熱底纖維的西方飲食習慣均會提高癌癥的發(fā)病率。在新增的癌癥致病原因中，尼古丁和飲食不平衡都高達30%。2因此，絕大多數(shù)的癌癥是可以避免的，如改變生活習慣、少抽煙等。致癌物質和個體體質相互作用下，因其遺傳性和獲得性從而具有誘發(fā)癌癥的能力。誘發(fā)癌癥幾率的大小取決于機體處理致癌物質，是否能夠在他們造成基因損傷前完美地清除這些致癌物質。經(jīng)典的流行病學中指出了如吸煙者等癌癥高危人群。然而，事實上，不少的終生吸煙者究其一生都沒有罹患癌癥。3這也許就是因為他們自身通過平時的新陳代謝能夠處理掉潛在致癌物質。根據(jù)腫瘤細胞的特點，腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤。良性腫瘤常常生長緩慢，局部有壓迫性而不會侵入周圍的組織。除了當良性腫瘤在有限空間壓迫到神經(jīng)外，一般良性腫瘤的危害性較小。然而，許多所謂的“良性腫瘤”也有很大的可能演變?yōu)閻盒阅[瘤，如在腸道中的腫瘤。惡性腫瘤細胞一般分裂速度較快，生長迅速，因為細胞表面糖蛋白的增多使得惡性腫瘤細胞易于轉移，有侵入周圍組織器官的現(xiàn)象。惡性腫瘤具有最明顯的特征既是腫瘤細胞能夠離開最初的細胞群，轉移至其他地方，形成間斷的細胞島。良性腫瘤一般可以通過手術切除。針對還未轉移的惡性腫瘤可以先通過外科手段切除病灶，之后通過其他方法治療。而擴散了的惡性腫瘤，如血癌，則需要采用系統(tǒng)的化療療法。1.2. 癌癥的治療癌癥的治療通常綜合了許多不同治療形式。如果該腫瘤能夠通過手術切除掉，那么外科手術就是治療該腫瘤唯一也是最好的抗癌手段。同時也可以選擇使用一系列抗癌藥物進行定向放射性療法。最簡單的抗癌藥物就是針對DNA合成的。4這樣的話就出現(xiàn)了一個總要的問題：機體中，并非只有癌細胞增殖；還有像消化道上皮細胞、產生血紅細胞的骨髓細胞、上皮細胞等。所以，那些接受化療的腫瘤患者大都會經(jīng)歷掉發(fā)、身體消瘦等副作用。因為身體虛弱，感染的風險極高，所有有時，化療的危害甚至是致命的。以前的抗癌藥物通過直接抑制DNA合成達到抑制癌癥的作用，新一代的藥物則是通過影響調節(jié)細胞信號促進或調節(jié)細胞周期、生長因子及其受體、信號轉換通路以及影響DNA修復和凋亡。5以上的每一種途徑都可能被活化的突變體調控，為抑制腫瘤細胞提供了靶點。其他方法則主要是通過與突變體結合細胞毒素影響腫瘤細胞特異性，或者用蛋白水解酶和腫瘤血管的發(fā)生減緩腫瘤細胞的生長。62. 致癌藥物順鉑簡介上世紀60年代發(fā)現(xiàn)的抗癌藥物順鉑（順式二氨基二氯絡鉑）和隨后順鉑在臨床治療上的成功激起了金屬化合物在腫瘤治療中的應用。7,8從那以后，即使成功率很低，學者們仍然堅持研究成千上萬種的可能成為化療劑的金屬鉑化合物。9,10時至今日，世界范圍內作為抗癌藥物販賣的鉑類藥物其年銷售額已達到了二十億美元。11,12一些其他的金屬如鈦、鈮、鉬、錸的化合物相繼被證明有潛在的抗癌療效。8鉑類藥物、卡波鉑（順二氨環(huán)丁羧酸鉑）、奧沙利鉑（順式-草酸（反式-1-1-1，2-DACH）鉑）等藥物作為順鉑藥物的補充和輔助均已進入癌癥的臨床治療 當中。順鉑在臨床上的使用，治愈了90%的睪丸癌患，與此同時，順鉑在多種癌癥如卵巢，頭頸癌，膀胱癌，子宮頸癌，黑瘤，淋巴瘤的治療當中扮演著相當重要的角色。13順鉑是具有代表性的DNA交聯(lián)劑，還是一種重要的癌癥化療藥物。14細胞內較低的氯化物濃度使得順鉑分子上的一個氯分子的流失，然而正是如此，使得順鉑具有了兩個反應基，還能變成帶正電荷的親核物質。DNA堿基上結合的單加合物很容易就能被檢測出來。他們一般被加載到雙功能團加合物之后。因為鏈間的交聯(lián)會造成較大的基因損傷，所以大約只有百分之一的鉑加合物能夠引起DNA鏈間的交聯(lián)。142.1順鉑的發(fā)現(xiàn)大量文獻都記載著順鉑的發(fā)現(xiàn)15，然而只有很少的一部分僅僅簡單的敘述了發(fā)現(xiàn)順鉑的重要實驗。巴尼特羅森伯格是密歇根大學的生物物理學家，羅森伯格覺得有絲分裂過程中產生的紡錘體形態(tài)和學校的經(jīng)典科學實驗電磁場中分散鐵屑形成的磁場線很像。于是他打算研究電流是否對細胞分裂產生影響。為了證明這個想法，他取用生長在氯化銨緩沖溶液中的埃希氏大腸桿菌，通過浸沒在緩沖液中的“惰性的”鉑電極對其通電。16一段時間過后，大腸桿菌細胞的形態(tài)開始發(fā)生變化，成為類似意大利面細而長的形狀，而非其本來像香腸一樣的橢圓形。這一現(xiàn)象的原因被歸結為對細胞分裂的抑制作用。詳細調查過后顯示，該現(xiàn)象的發(fā)生并不是因為電流的作用，而是因為惰性鉑電極產生的鉑水解物的作用。17接下來檢測了一組十個的過渡金屬化合物也用同樣方法檢測，都造成了大腸桿菌形態(tài)的延長。同時，實驗中發(fā)現(xiàn)效果最好的仍然是鉑類鹽，(NH4)2PtCl6更是延長了一些革蘭氏陰性桿菌。17羅森伯格他們同時還聲稱是順式Pt(IV) 類配合物、PtCl4(NH3)2導致了這種抑制作用；與此同時反式的這類配合物沒有這種抑制作用。18鑒于這個結果，就有學者覺得這種復合物有一定抗癌效果。于是就用順式Pt(II)配合物、順鉑和Pt(IV)配合物作用于患有肉瘤的小白鼠。這次實驗中，這些復合物表現(xiàn)出了強大的療效，縮小小白鼠身上體積較大的硬性腫瘤，而這些小鼠幾乎都健康的活了下來。事實上，這些治愈的小鼠都沒有表現(xiàn)出腫瘤復發(fā)的跡象。19基于該結果，在癌癥的臨床治療中，順鉑成為了至今為止最成功的抗癌藥物。2.2順鉑的作用機制順鉑的抗癌特性被發(fā)現(xiàn)后，許多學者就開始研究順鉑的作用機理。其中最重要的一點便是便是順鉑的作用靶點。一般認為順鉑是通過與DNA的相互作用發(fā)揮其抗癌效用介導程序性細胞死亡（凋亡）。給病人給藥后，順鉑使血漿中氯化物濃度升高（大概達到了100mM）限制了氯離子配體中水分子的移位（即水合作用被抑制）。然而順鉑易受到血漿中蛋白質的攻擊，特別是那些含有硫醇的蛋白質，比如人血清清蛋白。事實上，研究顯示注射順鉑一天后，血漿中的蛋白質就結合了百分之六十五至百分之九十八的鉑。20這種蛋白質的結合機制造成了一定程度上的療效降低21，甚至導致了一些副作用。22由于細胞膜的相對擴散原理，復合物順鉑能作為一個整體進入到腫瘤細胞中。23但是越來越多研究顯示位于細胞膜上的銅傳輸?shù)鞍證trl參與其中。22細胞內的氯離子濃度大概為4-20mM，相對較低。于是，順鉑結構式中的一個氯配體被水分子代替，構成了一個帶正電荷、不能離開細胞的形式。體外研究表明，正是這種單水離子和鉑的加合物使鉑能夠在細胞核內與DNA相結合。24它能與基因里的堿基相互作用，一般情況下，能與鳥嘌呤組成單官能團的DNA加合物。25,26也許直接在順鉑單官能團加合物或鉑水合物的第二個氯化物配合體上發(fā)生快速環(huán)化作用，使得閉環(huán)作用形成了一個雙官能團加合物。27這個主要的雙官能團加合物是由鳥嘌呤-鳥嘌呤、腺嘌呤-鳥嘌呤堿基組成28，能夠造成DNA嚴重的扭曲變形。DNA結合蛋白可以輕松地識別出這種程度的DNA損傷。而這些蛋白質除了可以著手于DNA損傷修復外，還有啟動細胞凋亡信號的作用。29, 302.3 順鉑的耐藥性順鉑的耐藥性嚴重制約了腫瘤治療中的治療效果。從本質上來講，一部分腫瘤對順鉑的耐藥性十分強烈，如結腸癌、非小細胞肺癌等。而另外一些腫瘤如卵巢癌、小細胞肺癌等則需要在順鉑作用一段時間過后才能產生耐藥性。31順鉑耐藥的機制被認為腫瘤細胞內藥物的累積量減少，增加硫醇類蛋白質的吸收使之與順鉑相結合從而失活，甚至還提高DNA修復功能等機制。14,27,29細胞環(huán)境中富含硫基的物質很多，比如谷胱甘肽和金屬硫蛋白，它們都能夠與順鉑相結合并使之失活8,29根據(jù)Lewis電子論中的軟硬酸堿規(guī)則，這種失活能夠使軟配體鉑類Pt(II)優(yōu)先于硬配體給氨劑和軟配體給硫劑結合。腫瘤治療過程中，鏈間交聯(lián)劑的重要性將刺激我們加深基因對這類特殊損傷途徑的承受力。然而明顯的是，無論原核還是真核細胞，都針對這種交聯(lián)造成的DNA互補鏈密集型損傷，從它們全部具有修復功能的序列中選擇了合適序列。3 腫瘤和細胞周期腫瘤里經(jīng)常有致癌物質導致的細胞死亡。而只有凋亡蛋白酶的蛋白酶、凋亡激活因子(Apaf-1)、啟動與凋亡因子Bcl-2這三個位于線粒體表面調控凋亡機制主要因素相互作用下，才能決定一個細胞是否應該死亡。32腫瘤細胞施放的可擴散化學因子能夠誘導血管從周圍組織中長入腫瘤內，然而當腫瘤內血管不足的時候，極有可能導致這些細胞壞死。從另一方面說來，很多基因家族都能夠調控細胞凋亡，凋亡性細胞死亡也可以促細胞凋亡通路。細胞凋亡那個往往被視為對其他細胞有益的自殺性進程：當DNA損傷時，細胞信號同時進行修復和凋亡。當修復機制無法完美修復損傷基因時，細胞凋亡進程則開始發(fā)揮功效，對于機體來說出現(xiàn)錯誤的細胞最好死掉。由于細胞調控中存在修復和凋亡機制的解偶聯(lián)，所以許多腫瘤細胞中的基因紊亂導致潛在有害基因損傷也是可以存在的。相對于正常細胞，特別是有p53基因突變的細胞更具有生存優(yōu)勢。Net.3當DNA損傷時，正常細胞p53基因表達上調，其表征類似于導致細胞周期停滯和凋亡的轉錄因子。有p53基因突變的細胞就失去了細胞周期停滯和細胞凋亡機制的保護，也許會與其他具有基因損傷的細胞在機體中存活下來。這也許就能解釋人腫瘤中為什常見p53突變體的原因。34細胞凋亡的失控會導致許多疾病，包括免疫缺陷、心臟病、神經(jīng)退行性病變或病毒感染，尤為重要的凋亡喪失會引起癌癥。33癌癥使多細胞生物體的一種疾病，主要是由于細胞增殖和細胞死亡之間的平衡被打破。許多原癌基因調節(jié)細胞分裂，但另一些則調節(jié)凋亡，他們反映了平衡在這些過程中的重要性。原癌基因c-myc具有雙重作用，既可以激活細胞分裂又可以引發(fā)凋亡，當生長因子缺乏或細胞處于DNA損傷時，c-myc基因起到凋亡作用。因此由于基因突變造成的凋亡途徑的喪失或相當?shù)退降恼{控結果會導致癌癥。另一方面某些基因如bcl-2這樣一直正常的凋亡途徑基因的過渡表達也會引起癌癥。35許多癌癥治療采用DNA損傷藥物，這些藥物可以殺死分裂中的細胞。目前已認識到的抗癌藥物與其說沒有特異性作用到不如說是通過誘發(fā)凋亡而殺死癌細胞。對這些藥物產生抗藥性的主要機制之一在于凋亡途徑的抑制。在癌癥患者中，有百分之五十是由于腫瘤抑制基因p53的突變造成的。當損傷太大無法修復時，誘導凋亡不僅可以清楚癌細胞，而且可以一直突變細胞在細胞卻內的增值，否則會因為細胞變化而生成更加惡性的腫瘤。實驗設計1 研究目的本實驗以體外培養(yǎng)的肺腺癌細胞A549為研究對象，了解A549細胞不同時期生長發(fā)育的特性。學習細胞培養(yǎng)過程中主要實驗步驟與注意事項。并觀察經(jīng)不同濃度順鉑、不同時間處理后，對A549生長的抑制作用，觀察這種抑制作用的性質，為順鉑對人肺腺癌的分子生物學治療提供理論依據(jù)。2 實驗方案設計體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞 做人肺腺癌A549細胞生長曲線，觀察其細胞形態(tài)，測定其倍增時間、細胞生長倍數(shù)觀察不同濃度順鉑處理A549細胞后，對其生長的影響。選取合適的藥物處理濃度。用不同濃度的順鉑處理A549細胞，觀察其抑制率是否隨時間變化。選取適當濃度的處理時間。3 研究意義 現(xiàn)如今，肺癌在我國的發(fā)病率日益攀升，逐步成為我國發(fā)病率占第一的癌癥。這不僅給家庭，也給社會帶來了日益沉重的負擔。本研究從順鉑對人肺腺癌A549細胞生長的影響入手，本著提高患者生存質量，減少患者家庭經(jīng)濟負擔的目的，尋求提高肺癌治療成效的方法，期以延長肺癌患者的生存時間。4 材料與方法4.1 材料細胞株A549，由四川大學生命科學學院分子生物學及生物技術重點實驗室杜林方實驗室提供；順鉑（DDP）,由四川大學生命科學學院,李沁桐老師實驗室提供。4.2 主要儀器CO2儲罐購于中國成都泰宇有限責任公司；CO2細胞培養(yǎng)箱為德國BINDER公司產品；Dgital Eyepiece攝像頭型號為MFDCE-300；pH計購于中國上海康儀有限責任公司；冰凍離心機德國Eppendorf公司超凈工作臺型號為SW-CJ-IC，購于中國蘇州安泰有限責任公司；純水凈化設備為Millpore公司產品；倒置式生物顯微鏡（型號XDS-2）為中國瑞邦科技有限公司產品；電子分析天平為德國SARTORIUS公司產品；高壓滅菌鍋購于中國上海申安醫(yī)療有限責任公司；柜式生物藥劑儲存冰箱為海爾公司產品；恒溫水浴鍋購于美國PolyScience公司；計時器（Digital Timer）購于成都TIANGEN科技有限責任公司血球計數(shù)板是玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠制造的；液氮生物罐購于中國四川亞西橡塑機器有限公司，型號為：YDS-50B-125；一次性PE手套（A型）購于上海都得利塑料制品有限公司移液槍為Thermo Electron公司產品，所使用的型號為0.5l 10l 、50l 500l、100l 1000l；4.3 主要試劑與耗材試劑產品名稱產地規(guī)格南美洲胎牛血清（FBS)Hyclone500ml胰蛋白酶，0.25%Hyclone100ml雙抗Hyclone100mlDMEM高糖（含丙酮酸鈉）Hyclone500ml耗材產品名稱產地規(guī)格25cm2細胞培養(yǎng)瓶,密封蓋，斜頸Corning500個/箱細胞培養(yǎng)皿，100mm x 20mmBD20個/包，200個/箱6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)表面經(jīng)TC處理，無菌無熱源Corning50塊/箱12孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)表面經(jīng)TC處理，無菌無熱源Corning50塊/箱1000ul低吸附型槍頭,無核酸酶VISON1000/袋1000ul低吸附型槍頭， 盒裝，無核酸酶，無菌VISON96/盒200ul低吸附槍頭，無核酸酶VISON1000/袋200ul低吸附型槍頭， 盒裝，無核酸酶，無菌VISON96/盒15ml尖底離心管VISON25個/包，20包/箱50ml尖底離心管VISON25個/包，20包/箱1.5ml 離心管VISON500/袋200ul槍頭盒國產1000ul槍頭盒國產PE手套，中號上海100只/包，50包/箱吸水紙國產100張/包拭鏡紙國產100張/包低溫記號筆Nalgene4支/盒4.4 主要試劑配制實驗中需要使用的器械先用自來水清洗，后用去離子水反復多次沖洗器械。再在5%稀鹽酸溶液中浸泡12小時，再用蒸餾水清洗、烘干，高壓消毒備用。水的制備對水的要求在細胞培養(yǎng)過程中是極高的。必須是不含任何雜質包括各種離子的非常純凈的水。所以需要在實驗前制備出足量的經(jīng)過三次蒸餾凈化的蒸餾水待用。75%酒精量取無水乙醇750ml，加入ddH2O定容至1L。PBS緩沖液稱取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gK2HPO4，溶于800mlddH2O中，用鹽酸調節(jié)溶液的PH至7.3左右，最后定容至1L。在高壓鍋中于高壓下121滅菌25分鐘，保存于4冰箱中待用。順鉑溶液將1mg順鉑溶于1ml的PBS緩沖液中，配制成1mg/ml的順鉑溶液，滅菌后避光保存于4冰箱中。DMEM培養(yǎng)基1） 由于血清中有活性的補體對活細胞產生一定作用，所以配制培養(yǎng)基的胎牛血清（FBS）需要提前滅活。將南美洲胎牛血清在56水浴中水浴30分鐘，經(jīng)抽濾后方可加入培養(yǎng)基，未用的血清在-5至-20避光保存；2） 同理，雙抗（青霉素和鏈霉素）溶液在使用前也需要滅活；3） 向500mlDMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清（FBS），即50ml；4） 加入抗生素：向培養(yǎng)基中加入總體積1%的雙抗（即青霉素和鏈霉素）溶液%；5） 配好后混合均勻，不需要調節(jié)pH。分裝后，放置于4冰箱中避光保存。胰酶用022m的一次性無菌濾器過濾除菌，由于反復預熱對胰酶的活性有較大影響，所以將胰酶分裝至1.5mlEP管后于-20貯存；常用的胰酶分裝后保存于4備用，在室溫下放置時間超過30分鐘性質便會不穩(wěn)定，需避免反復冷卻加熱。5 實驗步驟5.1 凍存細胞的復蘇先將水浴鍋溫度調至37-37.5度，預熱待用。先用紫外照射超凈臺，殺菌滅菌15分鐘，風機吹過之后才能使用。并點燃酒精燈，用含75%酒精的棉球擦拭手套和超凈臺臺面。為避免人肺腺癌A549細胞在緩慢融化過程中細胞內再形成結晶從而損害細胞，應遵守慢凍快融的原則，則必須使液氮中取出的凍存細胞快速融化。主要的步驟如下：(1) 為避免液氮造成的身體損傷，穿上實驗服、戴上厚手套，才能從液氮罐中取出冷凍管。取出時要注意安全，防止冷凍管突然爆裂傷人。(2) 用鑷子夾住裝有凍存細胞的EP管迅速置于37水浴中并不斷的搖動EP管做圓圈運動，使其充分接觸水浴，快速融化凍存細胞。晃動過程中切勿使睡眠超過EP管蓋沿，防止細胞株污染。約1分鐘后，凍存的細胞基本溶解。(3) 酒精消毒凍存細胞管后，在超凈工作臺內打開冷凍管。用移液槍將解凍的細胞懸濁液移入15ml尖底離心管中，加入10mlDMEM高糖培養(yǎng)基。(4) 將離心管放進離心機,平衡后，以1500r/min離心10分鐘。(5) 用酒精消毒離心管，放進超凈臺中，由于上清液中含有就的培養(yǎng)基和對細胞有一定損傷作用的DMSO,所以用移液槍吸去上清液，用2ml培養(yǎng)基重復洗一次。(6) 然后加入10ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將其重懸。在超凈臺中將其移入25cm2培養(yǎng)瓶中。(7) 置于5%CO2，37，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。于12小時后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否貼壁生長。視細胞生長情況來決定換液時間，大概兩、三天換液一次。(8) 整理、清潔超凈臺。5.2 細胞的傳代在倒置顯微鏡下觀察，當A549細胞鋪展面積占瓶底總面積75%左右時，即可進行細胞傳代。主要的操作步驟如下：(1)超凈臺先紫外照射20分鐘滅菌，通風。(2)從培養(yǎng)箱取出來細胞，酒精消毒后，放進超凈臺內。(3)用移液槍吸取瓶中的培養(yǎng)液，為防止剩余培養(yǎng)基終止胰酶消化，所以吸得越干凈越好。再用PBS緩沖液2ml沖洗殘留培養(yǎng)基。此時為避免細胞損失，注入PBS緩沖液時將槍頭靠在培養(yǎng)瓶壁，緩慢加入。(4)加入1ml預熱至37的0.25%胰酶溶液，晃動培養(yǎng)瓶使胰酶浸潤全部細胞。將培養(yǎng)瓶置于37、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中反應至貼壁細胞收縮變圓，約2分鐘后取出。 (5) 因為血清有終止胰酶消化的功能，所以在超凈臺中，4mlDMEM培養(yǎng)基終止消化。一般可以看到瓶底細胞貼壁所形成的一層細胞薄膜，特別注意多吹培養(yǎng)瓶打邊角部分，此處生長的細胞數(shù)目較多，要多吹打幾次才能使A549細胞脫落。在吹打過程中最好不要產生泡泡。吹打之后的細胞懸液在倒置顯微鏡下可以看到細胞變?yōu)閳A形，為懸浮狀態(tài)。(6)再次吹打細胞懸液，使細胞在懸液中均勻分布，等量移入4個培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基6ml?；旌暇鶆蚓涂梢苑胚M二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意把瓶口旋開1/4圈。 (7)清理收拾超凈臺，備用。5.3. 細胞的計數(shù)用75%酒精清洗血球計數(shù)板和特制蓋玻片；A549細胞用0.25%胰酶溶液消化后，用1mlPBS緩沖液吹打制成細胞懸液。吸取A549細胞懸液，吹打約30下使其混合均勻。計數(shù)前無需染色，直接吸取10l細胞懸液沿蓋玻片邊緣緩慢浸入，保證蓋玻片下無氣泡、充滿懸液且不能使懸液流入旁邊的槽中。靜置1分鐘，取邊四角大格內的細胞計總數(shù)。該血球計數(shù)板每一大個體積為0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml。計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(視野中，一大格的細胞數(shù)目在70以上為減小誤差則最好稀釋整數(shù)倍)，最后乘以104，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數(shù)。細胞懸液要求細胞分散性良好，計數(shù)過程中只計數(shù)完整細胞，若多個細胞聚集成細胞團，則只計一個；若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。5.4. A549細胞生長曲線特征 將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，取生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰酶溶液消化，接種入三個十二孔板中，每孔細胞濃度為8*104/ml,置于37、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12小時觀察A549細胞生長狀況，取其中三孔計數(shù)，每孔計數(shù)3次，計算細胞數(shù)目平均值。以時間為橫坐標，細胞數(shù)目（104）為縱坐標，作人肺腺癌A549細胞的生長曲線。5.5 用不同濃度順鉑對A549細胞生長的影響將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，取生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰酶溶液消化，接種至12孔板中，置于37、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一天后，在倒置顯微鏡下觀察，如果A549細胞貼壁，進入生長對數(shù)期便可開始實驗。通過細胞計數(shù)可知，每孔的起始濃度為2*105個/ml，往每孔中加入2ml培養(yǎng)液。將順鉑溶液加入培養(yǎng)基中，使其最終濃度分別為1g/ml、2g/ml、5g/ml、10g/ml、15g/ml、20g/ml。每個濃度設三孔。與此同時，設置平行對照三個，只是用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37、5%CO2、飽和濕度相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48小時。48小時后，計算順鉑對A549細胞生長的抑制率。抑制率=（對照組平均細胞數(shù)目 - 實驗組平均細胞數(shù)目）/對照組平均細胞數(shù)目。5.6 用順鉑處理不同時間，順鉑對A549細胞生長抑制率的影響。A549細胞接種同上。貼壁后，根據(jù)實驗6.5加入合適濃度的順鉑。起始細胞數(shù)目為2*105個/ml，每個時間段設三個孔，同時設置不加順鉑的平行對照，在相同條件下培養(yǎng)。每12小時觀察一次細胞形態(tài)并計數(shù)。同樣計算其抑制率。5.7 統(tǒng)計學分析 收集實驗數(shù)據(jù)，求得細胞平均數(shù)，和相關數(shù)據(jù)，進行分析，并用Excel 2007軟件作圖。6. 實驗結果6.1 人肺腺癌A549細胞生長曲線特征肺癌細胞A549是典型的貼壁細胞，21在倒置顯微鏡下觀察，其形態(tài)學特點如下：A549細胞一般為單層貼壁細胞，有為數(shù)不多的細胞聚集成團貼附于培養(yǎng)瓶壁或培養(yǎng)瓶底生長；細胞體積較大，貼壁時細胞呈延展狀態(tài)，為不規(guī)則多邊形，有如神經(jīng)元般的腳狀突觸；細胞內容物豐富，細胞核呈圓形且較大，位于細胞中央部分。用0.25%胰酶溶液消化后，在倒置顯微鏡下觀察：細胞分布均勻，消化后，細胞原生質收縮，從而大多呈圓形或橢圓形。標準的A549細胞生長曲線近似“S”形。由圖7.1.可看出肺癌細胞A549在生長的第一天是生長緩慢的起始期、增殖迅速的對數(shù)期處于第二至第五天、細胞增殖逐漸平緩的穩(wěn)定期是在108120h，在120144h時，細胞數(shù)目開始減少，為衰退期。圖7.1. 肺腺癌細胞A549生長曲線時間細胞數(shù)0h12h24h36h48h60h72h84h96h108h120h132h144H（*104）89122430415171831201278771表7.1. 肺腺癌細胞A549細胞數(shù)目6.2不同濃度順鉑對A549細胞生長的影響圖7.2. 不同濃度順鉑下A549細胞的形態(tài)由圖可知，隨著順鉑溶液濃度的增長，肺腺癌細胞A549細胞生長的抑制率越高。當順鉑濃度為2、5g/ml時，對肺腺癌細胞A549的抑制最為顯著。若對不同濃度順鉑對A549細胞生長抑制率作圖則可知，當濃度大于10g/ml時，其趨勢平緩，斜率較小，業(yè)已進入平臺期。圖7.3. 不同濃度順鉑對A549細胞生長的抑制率順鉑濃度0g/ml1g/ml2g/ml5g/ml10g/ml15g/ml20g/ml細胞數(shù)量1（104）82766644403127細胞數(shù)量2（104）80776245343329細胞數(shù)量3（104）79766050342826平均（104）80.3376.3362.6746.333630.6727.33抑制率0%4.98%21.98%42.32%55.18%61.82%65.98%表7.2. 不同濃度順鉑對A549細胞生長的抑制率6.3用順鉑處理不同時間，順鉑對A549細胞生長抑制率的影響。圖7.4. 5g/ml的順鉑處理不同時間A549細胞形態(tài) 以2g/ml、 5g/ml 的順鉑濃度分別處理A549細胞12小時、24小時、36小時、48小時后顯示，隨著順鉑處理時間的增長，其對A549細胞生長的抑制率逐步變高。 0h 12h 24h 36h 48h圖7.5. 2g/ml和5g/ml順鉑處理A549細胞的抑制率時間加入順鉑濃度0h12h24h36h48h2g/ml DDP對照細胞數(shù)目（104）20.332838.6753.6762.33細胞數(shù)目1（104）2125333851細胞數(shù)目2（104）2328324643細胞數(shù)目3（104）1728374447平均20.33273442.6747抑制率0%3.57%12.08%20.50%24.59%5g/ml DDP對照細胞數(shù)目（104）20.332838.6753.6762.33細胞數(shù)目1（104）2126293237細胞數(shù)目2（104）2324303335細胞數(shù)目3（104）1727273236平均20.3325.6728.6732.3336抑制率0%8.32%25.86%39.76%42.24%表7.3. 2g/ml和5g/ml順鉑對A549細胞生長的抑制率7. 討論細胞生長一般不用單個細胞大小、形態(tài)變化表示。而是以群體的生長趨勢作為生長的指標。本研究首先通過對A549細胞作生長曲線圖，了解其對生長動力學特性。研究發(fā)現(xiàn)，A549細胞的生長曲線呈S形，結合形態(tài)觀察結果和繪制的生長曲線圖可知，人肺腺癌A549細胞的生長大致可以分為4個階段：024h為起始期、24108h為對數(shù)期、穩(wěn)定期在108120h之間和120144h為衰亡期。起始期：細胞經(jīng)過0.25%的胰酶消化后，并沒有貼上培養(yǎng)瓶壁，而是懸浮于培養(yǎng)基中。大約經(jīng)過24小時，細胞才慢慢貼壁。觀察其形態(tài)，由游離的圓形細胞逐漸成為延展狀態(tài)。在這一時期中，細胞還在適應新的生長環(huán)境，從一個環(huán)境進入另一個生長環(huán)境中所受到的影響還沒有消除，所以此時的生長并不旺盛，生長曲線很平緩。更有甚者細胞數(shù)在這個時期可能有所減少。本實驗中起始期時間并不久，可能因為癌癥細胞的適應階段都較短。對數(shù)期：24108h細胞適應了生長環(huán)境，細胞快速分裂，生長旺盛，在用胰酶消化細胞的時候會看見一層膜狀物質鋪滿12孔板底部。細胞形態(tài)正常，仍表現(xiàn)為延展狀的多邊形帶腳細胞。該時期內，生長曲線斜率大。由圖可見生長最快的時期為96108h。 穩(wěn)定期：即使每兩三天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)板內空間有限，培養(yǎng)板內細胞數(shù)目仍會達到飽和。倒置顯微鏡下視野內呈“小黑點”狀顆粒性物質的量增多，細胞的透光性變差。因為相互競爭，代謝物的積累、培養(yǎng)基中二氧化碳的濃度增大等原因，死亡的細胞數(shù)和新生的細胞數(shù)勉強可以持平，這時生長曲線再次呈平線。該實驗中，幾乎沒有穩(wěn)定期，生長曲線在此階段出現(xiàn)了一個峰。在工業(yè)生產過程中，則需要通過增加細胞數(shù)目、更換新鮮培養(yǎng)基、補充生長所需的生長因子、減少代謝廢物等方法延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產物。細胞培養(yǎng)過程中兩三天更換一次培養(yǎng)基則是基于上述原因。從前人的研究中發(fā)現(xiàn)，a549細胞在營養(yǎng)充足的環(huán)境下穩(wěn)定期較長，所以本實驗中可能是因為營養(yǎng)物質消耗、代謝廢物積累導致A549細胞較快進入衰亡期。衰退期：培養(yǎng)132h后，細胞數(shù)目出現(xiàn)一定程度減少。此時通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A549細胞體積縮小，細胞內顆粒狀物體增多；大多數(shù)細胞的細胞膜出現(xiàn)解體，即使有細胞胞膜完整，仍可觀察到皺縮現(xiàn)象。視野里幾乎都是細胞碎片和一些被胞膜包被的透光度高的包被小體。倍增時間：通過生長曲線可以計算出細胞生長倍增時間。倍增時間的計算方法有直接法和間接法兩種。直接法是利用公式TD=tlog2/(logNt-logN0)。其中N0 為對數(shù)期開始或某時刻的細菌數(shù)；Nt 為對數(shù)期末的細菌數(shù)；t為N0與Nt 之間的培養(yǎng)時間（本實驗中的單位為小時）?？傻帽对鰰r間約為27.6小時，A549細胞增長最快的時間段為96h108h。然而在ATCC數(shù)據(jù)庫中顯示正常生長的A549細胞倍增時間為22hNet.4可能原因如下，1） 復蘇的凍存細胞狀態(tài)不健康，存活率不高，導致生長緩慢；2）可能是因為實驗中胰酶消化時間過短或過長，時間過短造成細胞數(shù)目丟失，過長導致細胞死亡；也可能是因為消化過后未把所有細胞都從壁上吹下；亦或是吹打細胞懸液的槍頭吸附性較大；計數(shù)時沒有混勻細胞懸液等原因造成細胞數(shù)目的損失，使得Nt、N0的細胞量不準確。細胞生長倍數(shù)：細胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到最大活細胞濃度的比率。36 生長倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細胞濃度/接種時的活細胞濃度。則該實驗可得a549細胞的生長倍數(shù)為15.875倍。由于細胞培養(yǎng)受到的相關影響較多，所以一般需要在一定的密度細胞才能更好的生長，因此就要進行細胞技術。細胞計數(shù)的方法通常分為兩種，一是用血球計數(shù)板直接計數(shù)，即該實驗中使用的方法；二是MTT法。MTT在活細胞琥珀酸脫氫酶作用下能夠分解，從而產生藍色的晶狀顆粒，這些顆粒能夠在細胞內積累，這些顆粒的數(shù)量與細胞的數(shù)目成正比關系，所以加入MTT與細胞作用4小時后，可以通過分光光度計亦或是酶標儀比色的方法測出其OD值。因為MTT法是測定細胞內琥珀酸脫氫酶的活性，所以OD值直接反應出的是活細胞的代謝強度，間接得到細胞的相對數(shù)目，而不是細胞數(shù)目的絕對值。因為血球計數(shù)板得到的是一個實實在在的數(shù)，MTT法中的OD值只是一個比較值，所以一般實驗中為了提高計數(shù)效率、減小誤差，常聯(lián)合使用平板計數(shù)和OD值：用血球計數(shù)板計數(shù)后，再測其OD值。計算好換算標準后，就可以用MTT法快速測量未知的細胞數(shù)目。在能保證細胞正常生長的情況下，用兩種方法得到的細胞生長曲線是一致的。順鉑能夠損傷癌細胞的膜上結構，其廣譜抗癌作用明顯，到現(xiàn)在為止，順鉑仍然是抗肺癌治療中最常用的藥物，常常出現(xiàn)在癌癥的綜合治療之中。臨床用于卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實體腫瘤均能顯示療效。37且其對非小細胞肺癌的療效是肯定的。38順鉑為金屬鉑的化合物，含有類似烷化劑的雙功能基團，與細胞內親核基團結合，主要作用靶點為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內交鏈，形成DDPDNA復合物，抑制DNA復制和轉錄，導致DNA斷裂和錯誤編碼，造成細胞死亡，順鉑屬周期非特異性藥。39本實驗中，用不同濃度的順鉑刺激肺癌細胞A549的生長，可知，順鉑對A549細胞生長的抑制作用呈濃度依賴性；用相同濃度的順鉑作用于A549細胞不同時間，可以得出順鉑抑制A549細胞的生長同時也是時間依賴性的。綜上，抗癌藥物順鉑對肺腺癌細胞A549生長的抑制作用呈濃度-時間依賴性。由實驗結果可知，當順鉑濃度為2、5g/ml時，對肺腺癌細胞A549的抑制最為顯著。用5g/ml 順鉑作用于A549細胞時，作用12h24h時的抑制最為顯著。8. 結果與展望 本實驗用體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細胞作為研究對象，用血球計數(shù)板計數(shù)順鉑刺激后A549細胞生長的變化及影響。由實驗結果可知，A549細胞增殖最快的時期是接種后第二至第五天。在順鉑的作用下，A549細胞明顯受到抑制，活細胞數(shù)目下降，呈現(xiàn)明顯的濃度時間依賴性。當濃度在25g/ml時，抑制作用最為顯著。本實驗做到這一步就已經(jīng)結束了，如果還要研究A549細胞對順鉑的耐藥性或順鉑的耐藥機制等，則需要進行更多深入研究。翻譯通過細胞模型了解細胞對順鉑的耐藥性布麗塔思特德；瑪麗戴維摘要許多研究中都表示，順鉑耐藥機制主要包括細胞內藥物的累積、順鉑的細胞毒性、抑制凋亡和DNA修復。從100ng/ml 順鉑即可抑制的CCRF-CEM白血病細胞發(fā)展出一系列遞增劑量順鉑抑制模型。這種劑量遞增使得細胞可以承受7倍劑量即1.6g/ml的順鉑。這些腫瘤細胞中，順鉑耐受性與抗氧化劑谷胱甘肽的增加是相互聯(lián)系的。丁胱亞磺酰亞胺（BSO）是一種抑制劑，能夠抑制谷胱甘肽合成過程，但BSO對腫瘤細胞的順鉑耐受性沒有任何影響。這說明雖然采用順鉑治療后，細胞內谷胱甘肽水平上升，但這并不能直接產生腫瘤細胞對順鉑耐藥性。分別用濃度為100ng/ml和200ng/ml的順鉑溶液長時間刺激H69 SCLC細胞，得到耐順鉑細胞株H69-CP和H69CIS200。這兩種細胞株對順鉑的耐受性均為一般腫瘤細胞的2至4倍。同時，細胞內p21基因表達量均有減少，可能會提高DNA損傷情況下細胞經(jīng)歷完整細胞周期的能力。在H69CIS200細胞株和H69-CP細胞株中順鉑藥物的累積沒有明顯減少。在H69-CP細胞中個，細胞內谷胱甘肽增加，其耐藥性發(fā)展成為交叉耐藥性，對射線亦有一定得抵制作用。但是在H69CIS200細胞中，就沒有如上變化。這說明了，谷胱甘肽的增加可能致使腫瘤細胞對其他藥物和射線的交叉耐藥性，但谷胱甘肽濃度的變化并不是導致腫瘤細胞耐順鉑機理的直接原因。當然，細胞中順鉑耐藥性產生的機制是多種多樣的，甚至在相同細胞內其機制都有可能不同。那么怎樣治療具有順鉑耐受性的腫瘤喃？耐順鉑的腫瘤細胞一般對另一種化療藥物紫杉醇具有較高的敏感性（H69CIS200細胞）或者經(jīng)過紫杉醇預處理后對順鉑具有較高的敏感性（H69-CP細胞）。我認為，通過細胞模型了解細胞對順鉑耐受性產生機制的研究會將帶領我們了解逆轉腫瘤細胞順鉑耐受性的方法，并改善對于耐順鉑腫瘤的治療方法。前言癌癥患者治療中，順鉑在使用率已經(jīng)有超過30年的歷史。順鉑對包括睪丸癌、卵巢癌和肺癌在內的多種癌癥的治療過程中均有較高的成功率。二氨絡二氯鉑（DDP）進入細胞后便帶有了正電荷，能夠與D