（分析化學(xué)專業(yè)論文）動(dòng)力學(xué)液相色譜法.pdf

中文摘要 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，眾多復(fù)雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學(xué)提出 了許多熱點(diǎn)研究課題。色譜分離技術(shù)仍然是生物工程下游技術(shù)中的核心步驟，如何盡可 能獲得良好分離效果是分離科學(xué)工作者追求的的個(gè)重要目標(biāo)之一。近年來出現(xiàn)了一類 全新的色譜分離方法，其分離機(jī)理與傳統(tǒng)的基于熱力學(xué)理論的分離模式不同，溶質(zhì)在動(dòng) 力學(xué)因素，如流動(dòng)相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不同的色譜保留特性， 利用動(dòng)力學(xué)因素對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離，我們將其稱之為動(dòng)力學(xué)色譜法。已有的工作多集中在 理論研究，實(shí)際應(yīng)用多限于分離一些標(biāo)準(zhǔn)小分子和d n a 分子片段，因此該方法有待進(jìn) 一步發(fā)展和開拓其用途。本文以反相液相色譜( r p l c ) 為載體，研究了溶質(zhì)的動(dòng)力學(xué) 色譜規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了溶質(zhì)普遍遵循的動(dòng)力學(xué)方程式，提出了兩個(gè)描述溶質(zhì)動(dòng)力學(xué)色譜行為 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并將其用于實(shí)際樣品分離。 論文包括以下六個(gè)部分： 1 文獻(xiàn)綜述：簡單地討論了色譜動(dòng)力學(xué)的發(fā)展、基礎(chǔ)理論和主要內(nèi)容，包括塔板理論、 速率理論、非平衡理論和質(zhì)量平衡理論四部分。闡述了動(dòng)力學(xué)色譜和色譜動(dòng)力學(xué)的 主要區(qū)別。重點(diǎn)綜述了兩種動(dòng)力學(xué)色譜，即流體動(dòng)力色譜和障礙色譜的分離原理、 模型、儀器、應(yīng)用和二者之間的異同點(diǎn)及聯(lián)系。共引用文獻(xiàn)7 5 篇。 2 以細(xì)胞色素c 肽譜為研究對(duì)象，初步研究了反相液相色譜中動(dòng)力學(xué)因素對(duì)其分離效 果的影響。重點(diǎn)討論了流動(dòng)相流速對(duì)分離度、峰容量和溶質(zhì)洗脫順序的影響。同時(shí) 研究了溶質(zhì)分子量與溶質(zhì)相對(duì)保留值之間的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)相對(duì)保留值與流速之間 存在雙對(duì)數(shù)的線性關(guān)系l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( d ) 以及溶質(zhì)分子量與方程式中二經(jīng)驗(yàn)常 數(shù)口值和6 值之間的關(guān)系，并將該雙對(duì)數(shù)的線性關(guān)系方程式與s d t 里的兩組線性方 程式進(jìn)行了比較。 3 探討了小分子、多肽和大分子蛋白質(zhì)在反相液相色譜中的動(dòng)力學(xué)色譜行為。提出了 溶質(zhì)普遍遵循的動(dòng)力學(xué)色譜方程式，即l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( v ) 。詳細(xì)地探討了該動(dòng)力 學(xué)色譜方程式中的兩參數(shù)a 、6 。在分離中的的意義，即參數(shù)a 的意義定義為在流動(dòng)相 流速為1 o m l m i n 時(shí)溶質(zhì)的相對(duì)保留值的對(duì)數(shù)值，6 值用來描述溶質(zhì)相對(duì)保留值隨流 速變化的趨勢大小。由于口、6 均是在動(dòng)力學(xué)因素流速變化的條件下描述溶質(zhì)保留情 況的，因此，a 、6 是兩個(gè)與熱力學(xué)無關(guān)的動(dòng)力學(xué)色譜參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)的相對(duì)保 留值與分量之間無特定關(guān)系，也不符合s c 或t - i d c 機(jī)理。a 、b 之間具有一定的線 性關(guān)系，但其相關(guān)系數(shù)不是很好。 4 r p l c 中溶質(zhì)相對(duì)保留值和流動(dòng)相流速之間存在雙對(duì)數(shù)線性關(guān)系，本章以l y s 中4 種較難分離的組分為研究目標(biāo)，根據(jù)動(dòng)力學(xué)色譜方程式中的兩參數(shù)a 、b 的意義，對(duì) 該4 種組分的分離進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)流速條件的優(yōu)化。由動(dòng)力學(xué)色譜參數(shù)a ，b 值推測了 溶質(zhì)在不同流速時(shí)色譜圖中的分離情況，驗(yàn)證了動(dòng)力學(xué)參數(shù)a ，b 值所代表意義的合 理性，并預(yù)測了分離的最佳流速。 5 溶質(zhì)在r p l c 中滿足動(dòng)力學(xué)色譜方程式l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ，實(shí)驗(yàn)證實(shí)小分子的 動(dòng)力學(xué)參數(shù)b 值普遍地小于大分子蛋白質(zhì)的b 值，因此流動(dòng)相流速對(duì)小分子相對(duì)保 留值的影響趨勢大于大分子蛋白，小分子在色譜柱中比大分子蛋白遷移速度的快。 本章?lián)颂岢隽藘煞N分離復(fù)雜樣品的動(dòng)力學(xué)色譜策略，即：a ：在流速增大到一定程 度時(shí)，小分子組分會(huì)和大分子組分在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)會(huì)快速分成兩大部分，簡化了 分離程序。b 小分子洗脫濃度是一個(gè)范圍，而蛋白質(zhì)大分子洗脫濃度很窄，可以認(rèn) 為是一個(gè)點(diǎn)，洗脫復(fù)雜樣品時(shí)，可以先進(jìn)行一個(gè)適宜濃度的等度洗脫小分子，然后 進(jìn)行梯度洗脫大分子。采用上述兩種動(dòng)力學(xué)色譜策略對(duì)蟾蜍卵子細(xì)胞組分進(jìn)行了快 速分離純化，并對(duì)高豐度多肽組分進(jìn)行了去除，同時(shí)富集了低豐度蛋白組分。預(yù)計(jì) 該動(dòng)力學(xué)色譜策略將為蛋白質(zhì)組學(xué)從復(fù)雜樣品中將高豐度組分去除同時(shí)檢測低豐度 組分的提出了一個(gè)新的實(shí)用方法。 6 利用動(dòng)力學(xué)色譜方程式兩個(gè)動(dòng)力學(xué)色譜參數(shù)a 、b 在不同熱力學(xué)條件下的相對(duì)穩(wěn)定性 提出了動(dòng)力學(xué)色譜指紋圖譜的初步構(gòu)建。 關(guān)鍵詞：動(dòng)力學(xué)液相色譜法，高效液相色譜，肽譜，動(dòng)力學(xué)指紋圖譜，動(dòng)力學(xué)色譜參數(shù) a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n ti nl i f es c i e n c e ，al a r g e rn u m b e ro fh o tr e s e a r c h i n gt o p i c sf o r m o d e r ns e p a r a t i o ns c i e n c eh a v e b e e nr e p o r t e d c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi ss t i l l t h ek e yp r o c e s so fd o w n s t r e a mb i o t e c h n o l o g y h o wt oo b t a i nt h eb e s tl cr e s o l u t i o nh a sb e e n a l l i m p o r t a n ti n v e s t i g a t e dh o tp o i n t i nr e c e n ty e a r s , an o v e lc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n m e t h o db a s i n go nh y d r o d y 7 n a m i cf a c t o r s ，s u c ha sm o b i l ef l o wr a t e ，t h es h a p ea n ds i z eo f p a c k i n gb e i n gd i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a le q u i l i b r i u mt h e r m o d y n a m i c sw a se x p l o r e d a p a r t i c u l a rf e a t u r eo ft h i sc h r o m a t o g r a p h yi sf i r s t l yn a m e da sd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y m a n y c o r r e l a t i v ep u b l i c a t i o n sh a v e b e e nc o n c e n t r a t e di nt h e o r e t i c a lr e s e a r c h , t h e p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n sa r eo f t e nl i m i t e dt ot h es e p a r a t i o no fs o m es t a n d a r ds m a l lm o l e c u l e sa n dd n a m o l e c u l a rf r a g m e n t s , s om o r ej o b ss h o u l db en e e dt op r o m o t ei t sf u r t h e rd e v e l o p m e n ta n d e x p a n di t sa p p l i c a t i o n i nt h i sp a p e r , t h er u l eo fs o l u t er e t e n t i o nb yd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i nr e v e r s ep h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) h a sb e e ns t u d i e d a ne q u a t i o nt h a ti so b e y e d u n i v e r s a l l yb y s o l u t e si sf o u n da n dt w op a r a m e t e r su s e dt od e s c r i b et h e d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yb e h a v i o ra r ef i r s t l yp r o p o s e d i nt h ee n d ，t h em e t h o di su s e df o rt h e s e p a r a t i o no ft h ea c t u a ls a m p l e s p a p e r si n c l u d et h ef o l l o w i n gs i xp a r t s ： 1 l i t e r a t u r er e v i e w ：ab r i e fd i s c u s s i o na b o u tt h ed e v e l o p m e n t ，b a s i ct h e o r ya n dt h em a i n c o n t e n t so fc h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c si si n t r o d u c e d i ti n c l u d e st h ep l a t et h e o r y , r a t et h e o r y , n o n e q u i l i b r i u mt h e o r y a n dm a s sb a l a n c et h e o r y t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e n c h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c sa n dd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i s e x p l a i n e d t w od y n a m i c c h r o m a t o g r a p h i e s ，h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ( s d c ) a n ds l a l o mc h r o m a t o g r a p h y ( s c ) w e r ei n t r o d u c e da n dr e v i e w e di nt h i sp a p e r , m a i n l yf o rt h er e c e n td e v e l o p m e n to fs e p a r a t i o n p r i n c i p l e ，t h e o r e t i c a lm o d e l ，a p p l i c a t i o n sa n d 7 5r e f e r e n c e sa r ec i t e d 2 b yt a k i n gt h ep e p t i d em a p p i n go fc y t o c h r o m e - ca sa ne x a m p l e ，t h ee f f e c to fd y n a m i c f a c t o r si nr p l ci si n v e s t i g a t e d i ti sm a i n l yf o rt h ee f f e c to nt h er e s o l u t i o n ，p e a kc a p a c i t ya n d s o l u t ee l u t i o no r d e rt os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ea n d r e t e n t i o n s ，w ef o u n dt h el o g a r i t h mo ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m e ( r r t ) o fp e p t i d e st ob e t t t p r o p o r t i o n a lt ot h el o g a r i t h mo f t h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s e 加) ，巴 l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ( 1 ) t h e t w ol i n e a rp a r a m e t e r sw e r ea l s of o u n dt oo b e yt h ee q u a t i o n ： 口= c + db w h e r e ，釓ba r ee m p i r i c a lc o n s t a n t s ( 2 ) t h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e so fl o g l o gl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h et w ol i n e a re q u a t i o n s i ns t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ( s d t ) a r ea l s oc o m p a r e d 3 t h ed y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro fs m a l ls o l u t e s ，p e p t i d e sa n dt h ep r o t e i n si n r p l ci sa l s os t u d i e d t h ee q ( 1 ) i sa l s ot e s t e da n df o u n di tt ob eu n i v e r s a la n dd i s c u s s e di n d e t a i l b o t h 口ba g et h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i sp a r a m e t e r st h a th a v en o ta n y t h e r m o d y n a m i c sm e a n i n g as p e c i f i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em o l e c u l a rm a s so fp e p t i d e s a n dr e t e n t i o nv a l u e si sn o tf o u n da n dt h es o l u t ee l u t i o no r d e rd o e sn o to b e yt h em e c h a n i s mo f s co rh d c b o t haa n dbh a v eal i t t l el i n e a rr e l a t i o n s h i p ，b u tt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti sn o t v e r yg o o d 4 i nt h i sc h a p t e r , t h eo p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ef o rt h es e p a r a t i o no ff o u r c o m p o n e n t so fl y sp e p t i d em a p p i n gi si n v e s t i g a t e da n df o u n dt h a ti ti sd i f f i c u l tt os e p a r a t e u s i n gc o m m o nm e t h o d h o w e v e r , t h es e p a r a t i o no fs o l u t e sa td i f f e r e n tf l o wr a t e so fm o b i l e p h a s ei sp r e d i c t e df r o mt h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s ，aa n db t h e o p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ew a sa l s op r e d i c t e da n di tv e r i f yt h em e a n i n ga b o u ta ， bi ns e p a r a t i o n 5 t h ee x p e r i m e n tc o n f i r m e dt h a tt h ebv a l u eo fi sg e n e r a ls m a l l e rt h a nt h a to fp r o t e i n m a c r o m o l e c u l e s t h e r e f o r e ，t h es m a l lm o l e c u l e s r r tc h a n g ei sg r e a t e rt h a nt h a to f m a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n sa st h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ec h a n g e d t h em o v ev e l o c i t yo f s m a l lm o l e c u l e si sg r e a t e rt h a nt h a to fm a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n si nc o l u m n a c c o r d i n gt ot h i s p r i n c i p l e ，t w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sf o rt h es e p a r a t i o no fc o m p l e xs a m p l e sa r e p r e s e n t e d t h eo n ei st h a tt h ec o m p l e xs a m p l e sw i l lb eq u i c k l yd i v i d e di n t ot w om a j o r c o m p o n e n t s ，t h es m a l lm o l e c u l e sg r o u pa n dt h em a c r o m o l e c u l e sg r o u p ，w h e nt h ef l o wr a t eo f m o b i l ep h a s ei si n c r e a s eu pt oac e r t a i nv a l u ed u r i n gg r a d i e n te l u t i o na n dt h et w og r o u p sw i l l s i m p l i f yt h es e p a r a t e d t h es m a l lm o l e c u l e sh a saw i d t he l u t i o nc o n c e n t r a t i o nr a n g eb u tt h a t o fm a c r o m o l e c u l e si sv e r yn a r r o wt h a tc a nb es i m p l yr e g a r d e da s “ap o i n t ”，s ot h eo t h e r d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g yc a nb ea d a p t e d ：as u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n f o ri s o c r a t i c e l u t i o nt oe l u t es m a l lm o l e c u l e sf i r s t l y , a n ds u b s e q u e n t l yag r a d i e n te l u t i o nt os e p a r a t e m a c r o m o l e c u l e s c o m p o n e n t so fh o p t o a do v u mc e l lw e r er a p i d l ys e p a r a t e da n dp u r i f i e db y t h i sw a y h i g ha b u n d a n c eo fp e p t i d ec o m p o n e n t sw e r er e m o v e dw i t ht h el o w - e n r i c h e d p r o t e i n s i tw o u l db ee x p e c t e dt h a tt h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sw i l lb ea n e w p r a c t i c a lm e t h o du s e df o rp r o t e o m i c s 6 t h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s 口 bh a s m o r es t a b i l ec h a r a c t e ri n d i f f e r e n tt h e r m o d y n a m i cc o n d i t i o n s ad y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e rc h r o m a t o g r a m w a sc o n c e i v e ds i m p l y k e yw o r d s ：d y n a m i cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ，p e p t i d e m a p p i n g , d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yf i n g e rc h r o m a t o g r a m , d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h yp a r a m e t e r v 西北大學(xué)學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明書 本人完全了解西北大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定。學(xué)校 有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版。本人允許 論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西北大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi) 容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存 和匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所等機(jī)構(gòu)將本學(xué)位論 文收錄到中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫或其它相關(guān)數(shù)據(jù)庫。 保密論文待解密后適用本聲明。 學(xué)位論文作者簽名：笸建薈指導(dǎo)教師簽名：i 僉鳋芰墮 八_ 、1 撕7 年多月，9 日 年6 月io 日 西北大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及 取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，本 論文不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西北大 學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì) 本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名：唐壹聾 兩7 年6 月10 日 西北大學(xué)博士學(xué)位論文 1 1 前言 第一章文獻(xiàn)綜述 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，眾多復(fù)雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學(xué)提 出了眾多熱點(diǎn)研究課題。如何實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、組織或體液所包含的成千上萬種組分的有效 分離，是現(xiàn)代分離科學(xué)研究所要解決的首要問題，同時(shí)也是難點(diǎn)問題。理想的分離方法 首先應(yīng)具備高分辨率，能夠快速將復(fù)雜組分同時(shí)分離并與后續(xù)的鑒定技術(shù)有效銜接。高 效液相色譜( 玎p l c ) 作為目前最為有效的分離方法之一，在蛋白質(zhì)的多級(jí)純化過程中， 發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 如何盡可能獲得高的色譜分離度是分離科學(xué)工作者追求的的一個(gè)重要目標(biāo)之一。色 譜的分離過程，受熱力學(xué)因素和動(dòng)力學(xué)因素的同時(shí)控制。為了得到滿意的分離效果，首 先應(yīng)考慮填料的性質(zhì)及其與溶質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱，這主要表現(xiàn)在色譜柱和色譜模式的選 擇上。同時(shí)由于流動(dòng)相的種類與使用條件既影響動(dòng)力學(xué)因素，又影響熱力學(xué)因素，故必 須正確地選擇并優(yōu)化色譜分離條件。上述這些問題，都涉及到色譜的基本理論。 色譜技術(shù)的理論基礎(chǔ)可以大致歸納為色譜熱力學(xué)和色譜動(dòng)力學(xué)兩大部分。色譜熱力 學(xué)的問題，眾多色譜工作者研究的很多。這里，擬簡單地討論色譜動(dòng)力學(xué)的幾個(gè)問題， 主要討論一種新的色譜模式一動(dòng)力學(xué)色譜。 1 2 色譜動(dòng)力學(xué) 色譜過程動(dòng)力學(xué)理論研究是色譜分析實(shí)現(xiàn)高效、快速的理論基礎(chǔ)。色譜動(dòng)力學(xué)理論 主要研究在色譜過程中物質(zhì)在柱內(nèi)的輸運(yùn)現(xiàn)象【。其研究的主要目的是解釋穿透曲線的 形狀，探求影響色譜峰擴(kuò)張的原因和機(jī)理，為獲得高效能色譜柱系統(tǒng)提供理論指導(dǎo)，為 選擇色譜分離條件奠定理論基礎(chǔ)。在物料平衡原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)的傳輸、 分配狀況，可以推導(dǎo)出溶質(zhì)遷移必須遵守的規(guī)律，即色譜動(dòng)力學(xué)方程。求解動(dòng)力學(xué)方程 可以獲知色譜流出曲線的形狀。進(jìn)而研究柱效率、峰形與各種參數(shù)之間的關(guān)系。 色譜動(dòng)力學(xué)理論可分成塔板理論【2 1 ，速率理論，非平衡理論【3 1 和質(zhì)量平衡理論四部 分。塔板理論中引出的塔板數(shù)和塔板高度的概念在表征柱效時(shí)是很有用的參數(shù)，但塔板 理論不能把柱效與色譜參數(shù)定量地關(guān)聯(lián)起來。速率理論和非平衡理論分別從微觀和宏觀 1 第一蘋文獻(xiàn)綜述 的基點(diǎn)出發(fā)研究色譜分離動(dòng)力學(xué)過程，而且能把柱效與色譜參數(shù)關(guān)聯(lián)起來，這對(duì)改善色 譜柱結(jié)構(gòu)，提高柱效是有指導(dǎo)意義的，但不能給出色譜流出曲線形狀。質(zhì)量平衡理論能 從物理意義上描述各種機(jī)理的色譜分離過程，也能有效地給出色譜柱效與參數(shù)的關(guān)系和 色譜流出曲線的信息，但是其數(shù)學(xué)推導(dǎo)和求解特別復(fù)雜。 1 2 1 塔板理論( p l a t et h e o r yo f c h r o m a t o g r a p h y ) 塔板理論是m a r t i n 和s y n g e 于1 9 41 年首先提出的，是對(duì)色譜過程進(jìn)行描述的初次 嘗試。在m a r t i n 之后，s a i d 等學(xué)者也對(duì)這一理論做了補(bǔ)充和完善，使塔板理論為色譜 界所接受。塔板理論將一根色譜柱看作是一根精餾柱，它由許多單級(jí)蒸餾的小塔板和小 短柱組成，每一個(gè)單級(jí)蒸餾的小塔板或小短柱很小，但允許溶質(zhì)在其中有足夠的時(shí)間達(dá) 到兩相間的平衡。就像在精餾塔內(nèi)進(jìn)行精餾一樣，這種假想的踏板或小短柱越小或越短， 就意味著在一個(gè)精餾塔或分離柱上允許進(jìn)行反復(fù)平衡的次數(shù)就越多，即具有更高的分離 效率。 塔板理論基于以下幾個(gè)基本假設(shè)：l 、色譜柱內(nèi)徑和柱內(nèi)填料填充均勻，色譜柱由 若干小段組成，每一小段的高度為h ，這樣一小段稱為一個(gè)理論塔板。2 、溶質(zhì)分子在 塔板內(nèi)固定相和流動(dòng)相之間的分配瞬間達(dá)到平衡，且縱向分子擴(kuò)散可以忽略。3 、溶質(zhì) 在各塔板上的分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)，與溶質(zhì)在每個(gè)塔板上的量無關(guān)，即呈線性分布等溫 線。4 、流動(dòng)相通過色譜柱是不連續(xù)的，而是脈沖式的間歇過程。5 、溶質(zhì)開始時(shí)加載色 譜柱零塊塔板上。 塔板理論將色譜過程看作是一個(gè)平衡分配的不連續(xù)過程，這是一種理想的極限狀 態(tài)。實(shí)際的色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難實(shí)現(xiàn)真正的平衡。塔板理論忽略了色譜過程 中分子擴(kuò)散等因素，其理論假設(shè)不能全面反映色譜分離本質(zhì)，色譜過程不僅與分配平衡 有關(guān)，而且與分子擴(kuò)散、傳質(zhì)，即分子速率有關(guān)。 1 2 2 速率理論( r a t et h e o r yo fc h r o m a t o g r a p h y ) 鑒于塔板理論的局限性，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年在前人工作的基礎(chǔ)上，研究了擴(kuò)散、 傳質(zhì)等于色譜過程物料平衡或質(zhì)量平衡的關(guān)系，根據(jù)物料平衡方程，考察溶質(zhì)通過色譜 體系總的濃度變化，導(dǎo)出速率理論方程。其后g i d d i n g s 將色譜過程看作分子無規(guī)則運(yùn) 動(dòng)的隨機(jī)過程，用隨機(jī)行走( r a n d o m w a l k ) 模型來描述它，根據(jù)隨機(jī)理論導(dǎo)出速率理 論方程。 速率理論運(yùn)用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴(kuò)張的因素?？偨Y(jié)起來包括 2 西北大學(xué)博士學(xué)位論文 兩大部分：柱外譜帶展寬效應(yīng)和柱內(nèi)譜帶展寬效應(yīng)，而柱內(nèi)譜帶展寬效應(yīng)主要有4 種， 即多路徑效應(yīng)( m u l t i p a t he f f e c t ) 、縱向擴(kuò)散( 1 0 n g i t u d i n a ld i f f u s i o n ) 、流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻 力( t h er e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h em o b i l ep h a s e ) 以及固定相中的傳質(zhì)阻力( t h e r e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h es t a t i o n a r yp h a s e ) 。 在總結(jié)了上述各種引起峰展寬的效應(yīng)的基礎(chǔ)上，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年提出了填充 氣相色譜柱內(nèi)總理論塔板高度的方程，即 一2 d p + 孕+ 警 ) 其中 五= 砉志 ( 1 2 ) 根據(jù)這一表達(dá)式，可以比較精確地預(yù)測給定的色譜柱在優(yōu)化的流動(dòng)相速度下的柱效 率，以及各種因素對(duì)總理論塔板高度的影響。這對(duì)于色譜柱的優(yōu)化設(shè)計(jì)是十分重要的。 從v a nd e e m t e r 方程中可以得到一個(gè)最佳流速。 v a n d e e m t e r 方程雖然比較滿意地描述和解釋了發(fā)生于色譜過程中的譜帶展寬過程。 但是，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有時(shí)試驗(yàn)值偏離公式。于是，后續(xù)學(xué)者繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行了廣泛而 深入的研究，并提出了一些修正的v a nd e e m t e r 方程，如g i d d i n g s 方程、h u b e r 方程、 h o r v a t h l i n 方程、k n o x 方程和描述開管柱的g o l a y 方程。 1 2 3 質(zhì)量平衡理論( m a s sb a l a n c em o d e l ) 質(zhì)量平衡理論能從物理意義上描述各種機(jī)理的色譜分離過程，可以有效地給出色譜 柱效與參數(shù)的關(guān)系和色譜流出曲線的信息。許多色譜工作者【5 1 對(duì)該理論的發(fā)展和應(yīng)用 做了大量的工作。但他們的工作都僅僅考慮了色譜柱內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程。鄒漢法【2 】等人在 前人的工作基礎(chǔ)上，考慮到柱外效應(yīng)的影響，建立了整個(gè)液相色譜系統(tǒng)的質(zhì)量平衡模型， 導(dǎo)出了色譜流出曲線的一級(jí)矩和二、三級(jí)中心矩的表達(dá)式，并給以了一定的討論。 1 2 4 色譜動(dòng)力學(xué)模型( c h r o m a t o g r a p h yd y n a m i cm o d l e ) 色譜分離過程的動(dòng)力學(xué)研究可用來分析流出曲線的形狀，探求引起色譜峰區(qū)域?qū)挾?擴(kuò)張的眾多因素和機(jī)理，可以建立適宜的色譜模型來對(duì)某分離單元的分離過程進(jìn)行數(shù) 學(xué)模擬。色譜技術(shù)和計(jì)算機(jī)的發(fā)展為動(dòng)力學(xué)色譜模型的建立提供了便利，目前研究者們 已經(jīng)提出了許多色譜模型用于色譜分離過程動(dòng)力學(xué)的研究。其中最常用的幾種模型包括 普遍化速率模型( a r ) 、集總孔擴(kuò)散模型( p o r ) 、平衡擴(kuò)散模型( e d ) 和傳遞擴(kuò)散模型( t d ) 第一章文獻(xiàn)綜述 1 3 動(dòng)力學(xué)色譜( d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ) 近年來出現(xiàn)了一類新的色譜分離方法，其分離機(jī)理與傳統(tǒng)的基于熱力學(xué)理論的分離 模式不同，溶質(zhì)在動(dòng)力學(xué)因素，如流動(dòng)相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不 同的色譜特性，利用動(dòng)力學(xué)因素等對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離。這種方法最大的特點(diǎn)就是溶質(zhì)的分 離是依靠于流體力學(xué)現(xiàn)象而非傳統(tǒng)的熱力學(xué)中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的化學(xué)平 衡，顯著影響溶質(zhì)保留值的是各種流體力學(xué)因素，如固定相顆粒的大小、流動(dòng)相的流速、 溫度和黏度以及溶質(zhì)的空間構(gòu)型，而化學(xué)因素，如固定相顆粒的化學(xué)性質(zhì)、孔徑和溶劑 的疏水性并不是影響分離的關(guān)鍵因素。其主要研究內(nèi)容是研究動(dòng)力學(xué)因素對(duì)溶質(zhì)的保留 值、分離度、峰容量等色譜行為的影響。 1 4 動(dòng)力學(xué)色譜和色譜動(dòng)力學(xué) 色譜動(dòng)力學(xué)研究的主要目的是解釋穿透曲線的形狀，探求影響色譜峰擴(kuò)散的原因和 機(jī)理，為獲得高效能色譜柱系統(tǒng)提供理論指導(dǎo)，為選擇色譜分離條件奠定理論基礎(chǔ)，并 在物料平衡原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)的傳輸、分配狀況，推導(dǎo)出物質(zhì)輸運(yùn)必須遵 守的規(guī)律，即色譜動(dòng)力學(xué)方程。求解動(dòng)力學(xué)方程可以獲知色譜流出曲線的形狀。進(jìn)而研 究柱效率、峰形與各種參數(shù)之間的關(guān)系。 動(dòng)力學(xué)色譜研究的主要內(nèi)容是研究動(dòng)力學(xué)因素對(duì)溶質(zhì)色譜遷移行為的影響，探求溶 質(zhì)在動(dòng)力學(xué)因素影響下的相關(guān)遷移規(guī)律，建立溶質(zhì)分離的動(dòng)力學(xué)模型，為選擇最佳的色 譜分離的動(dòng)力學(xué)條件奠定理論基礎(chǔ)。 1 5 兩種動(dòng)力學(xué)色譜( h d c 、s c ) 的發(fā)展和應(yīng)用 液相色譜的分類依據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的作用特征，可分為離子交換色譜，疏水相 互作用色譜和反相色譜，親合色譜及尺寸排阻色譜等。近年來出現(xiàn)的兩種色譜模式，即 流體動(dòng)力色譜( h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y , h d c ) 和障礙色譜( s l a l o m c h r o m a t o g r a p h y , s o ) ，其溶質(zhì)均與固定相之間的作用特征無關(guān)，或關(guān)系甚小，而主要是 與流動(dòng)相的流動(dòng)特征有關(guān)，或是基于動(dòng)力學(xué)因素發(fā)展起來的兩種新的色譜方法，二者通 稱為動(dòng)力學(xué)液相色譜法。目前已經(jīng)在測定和分離聚合物、多肽、d n a 和生物大分子方 面有廣泛的應(yīng)用。耿信篤曾經(jīng)在一篇綜述中，從與s e c 做比較的角度簡要地介紹了 4 西北大學(xué)博士學(xué)位論文 t s i h d c 和s c 的分離原理及二者之間的不同點(diǎn)，下文詳細(xì)并系統(tǒng)地說明了h d c 和s c 的分離原理、模型、理論發(fā)展、儀器設(shè)備和最新應(yīng)用，也探討了h d c 與s c 之間的聯(lián) 系及相互轉(zhuǎn)化。 1 5 1 流體動(dòng)力色譜( 皿c ) h d c 是s m a l l 等在7 0 年代初就己開發(fā)的一種可同時(shí)測定聚合物或膠體乳膠粒的 直徑及其分布的方法【1 9 m 】。他們采用了無孔剛性固體顆粒填充色譜柱，待分離乳液在高 壓下通過色譜柱時(shí)，由于不同大小的溶質(zhì)所受到的水動(dòng)力效應(yīng)的不同，其乳液在流動(dòng)相 中的移動(dòng)速度也不同，因此實(shí)現(xiàn)了聚合物或膠體懸浮液的分離。m o i l 2 2 l 等研究者進(jìn)一 步發(fā)展和完善了h d c ，并將其引伸到某些天然高分子的分離。后來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在一根直 徑為幾百微米的毛細(xì)管中同樣也可實(shí)現(xiàn)不同粒徑混合物的分離【2 3 , 2 4 l 。這種采用毛細(xì)管， 而不是填充柱作為分離柱的分離方法拓寬了h i ) c 的應(yīng)用范圍，這在理論研究和實(shí)際應(yīng) 用上都有著非常重要的意義。e l i e 和r e h a u d 曾利用管徑為1 5 m m 的毛細(xì)管成功地對(duì) 紙纖維懸浮液中的纖維顆粒進(jìn)行了分離【2 5 1 。用內(nèi)徑小于1 0 “m 的毛細(xì)管，稱其為微毛 細(xì)管，其分離機(jī)理與內(nèi)徑大于1 0 岬的毛細(xì)管略有不同，s i l e b i t 2 6 l 和d o s r a m o s 2 7 1 以及 t i j s s e n 2 8 1 和b o s 2 9 】對(duì)微毛細(xì)管h d c 進(jìn)行了詳細(xì)的理論探討和應(yīng)用研究。 1 5 1 1 皿c 的原理 1 5 1 1 1h d c 柱 毛細(xì)管h d c 和填充柱h d c 所需色譜裝置大體相同。二者的不同之處在于毛細(xì)管 h d c 采用管徑不同的毛細(xì)管作為分離色譜柱，而填充柱h d c 則使用無孔剛性固體顆 粒填充的色譜柱。相對(duì)于毛細(xì)管h d c ，填充柱h d c 的設(shè)備相對(duì)簡單，操作也更為簡便， 尤其是檢測手段的簡化，使用一般的紫外檢測器便能滿足要求。而毛細(xì)管h d c 受到進(jìn) 樣量和檢測濃度的限制，要求檢測器較為靈敏，通常使用高靈敏度紫外檢測器或其它手 段，如電位分析、激光激發(fā)熒光法及激光光散射法等f 3 們。 1 5 1 1 2h d c 分離模型 盡管h d c 包括了前述的兩種主要模式，毛細(xì)管t t d c 和填充柱h d c ，而大部分有 關(guān)h d c 的理論都以前者為主【3 1 , 3 2 l ，由于可將填充h d c 顆粒間的間隙視為毛細(xì)管體系， 故填充h d c 有與毛細(xì)管h d c 相同的分離模型。 h d c 的分離機(jī)理可描述為：當(dāng)流動(dòng)相從填料顆粒間經(jīng)過時(shí)，由于水動(dòng)力效應(yīng)的存 在使其流型為層流拋物面型，溶質(zhì)在這種情況下的分離主要是借助于靠近填料顆粒表面 第一蘋文獻(xiàn)綜述 的低流速區(qū)域所產(chǎn)生的排斥效應(yīng)，大的溶質(zhì)分子由于受到的排斥效應(yīng)大于小的溶質(zhì)分 子，更容易遠(yuǎn)離填料顆粒表面而進(jìn)入高流速區(qū)域，這樣大分子溶質(zhì)的移動(dòng)速度大于小分 子溶質(zhì)，從而先于小分子被洗脫出來。有多個(gè)模型描述了溶質(zhì)在h d c 中的保留行為， 最簡單的僅考慮了幾何學(xué)效應(yīng)，而常用的模型是d i m a r z i o 和g u t t m a n l 3 3 3 4 及b r e n n e r 和 g a y d o s l 3 2 1 依據(jù)幾何學(xué)原理而提出的保留時(shí)間和溶質(zhì)大小的關(guān)系，如圖1 1 所示，溶質(zhì)分 子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移可用方程( 1 3 ) 來表示： r = ( 1 卅執(zhí)一c ”。1 ( 1 3 ) 式中，r = t m t o 為溶質(zhì)的保留值與無限小的標(biāo)記物的保留值之比，也稱之為相對(duì) 保留值；x - - d e ，以為溶質(zhì)的有效直徑，是毛細(xì)管的直徑。占和c 均為與幾何學(xué) 有關(guān)的常數(shù)；c 值介于0 5 5 之間【3 5 l ，在填充柱里c 值介于2 7 - 2 8 之間。 從式( 1 3 ) 看出，對(duì)于粒徑不同的顆粒來說，其相對(duì)停留時(shí)間是不同的，這樣具有 不同大小顆粒的溶質(zhì)便可用皿c 法進(jìn)行分離。由于大分子先于小分子被洗脫出來，因 此，雖然它所用分離原理與常講的尺寸排阻色譜( s e c ) 不同，但其洗脫順序卻與s e c 相同。 然而這里需要指出的是，在式( 1 3 ) 的推導(dǎo)過程中假定被測粒子作為剛性的不旋 轉(zhuǎn)微球來處理，而實(shí)際上對(duì)于流動(dòng)體系中的粒子來說，其上下所受的力是不平衡的，在 力矩的作用下將發(fā)生旋轉(zhuǎn)，反過來將會(huì)影響其流動(dòng)速度。這個(gè)現(xiàn)象最早由d i m a r z i o 和 g u t t m a n l 3 1 1 以及b r e n n e r 和g a y d o s 3 2 l 論及。 圖1 1 大溶質(zhì)分子移動(dòng)快于小分子的h d c 分離原理示意圖 f i g u r e l - lp r i n c i p l eo fh d cs e p a r a t i o n l a r g e ra n a l y t e sc a n n o ts a m p l el o wf l u i dv e l o c i t i e sn e a rt h e c h a n n e lw a l la n dt h e r e f o r em o v ef a s t e r 1 5 1 2h d c 的發(fā)展和應(yīng)用 用h d c 分離時(shí)要求溶質(zhì)分子的大小與流經(jīng)管道直徑的比值不是太小，應(yīng)大于 o o l ，一般介于0 0 1 0 3 5 之洲3 們。在t - d c 提出的初期，人們使用小孔徑的毛細(xì)管( i d 5 0 - 5 0 0 p m ) ，或者使用填充1 0 2 0 1 m a 填料的填充柱，其內(nèi)部管道相對(duì)較大，因此它們僅 6 西北大學(xué)博士學(xué)位論文 局限于分析較大的一些溶質(zhì)，如纖維和固體顆?！? 1 , 3 7 , 3 引。一般來說，采用小內(nèi)徑的毛細(xì) 管，或非常小的粒徑均勻的微球作為填料時(shí)可顯著提高h(yuǎn) d c 柱的柱效，因此后來人們 使用內(nèi)徑更小的( - 5 i u n ) 的毛細(xì)管和更小顆粒的填料( 1 1 5 9 m ) 3 5 , 3 9 】來提高h(yuǎn) d c 的 分離度，如，s t e g e m a n 等 4 0 , 4 1 】利用粒徑范圍在( 1 4 2 7 ) g r n 單分散s i 0 2 微球?yàn)樘盍戏?離聚苯乙烯顆粒、膠體s i 0 2 顆粒和蛋白質(zhì)等，取得了良好的分離效果。考慮到r d c 的 分離機(jī)理在體積排除色譜( s e c ) q 口同樣存在，故可將h d c 與s e c 結(jié)合，從而拓寬所分 離溶質(zhì)分子量的范圍。c h e n g 4 2 j