堿磷酸酶-基因?qū)嶒?yàn).doc

編號 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文開題報(bào)告論文題目：堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)學(xué)生姓名： 年 級： 專 業(yè)： 指導(dǎo)教師： 二一三年八月十二日學(xué)生姓名論文題目開題時(shí)間項(xiàng)目來源本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課一、立論依據(jù)項(xiàng)目的研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢分析，主要參考文獻(xiàn)及出處：堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP, ALKP) (EC 3.1.3.1)屬磷酸單脂酶族，底物專一性較低，廣泛應(yīng)用于表位連鎖圖譜，探針標(biāo)記測序和免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域。分子生物學(xué)中，ALP分解寡聚核甘酸的末端單酯化磷酸，是常用的遺傳工程酶。1產(chǎn)堿性磷酸酶的生物有很多，從細(xì)菌到高等哺乳動物均有分布。人血液中的堿性磷酸酶含量是重要的指標(biāo)之一，其檢驗(yàn)結(jié)果及異位表達(dá)對癌癥等許多疾病有著指導(dǎo)意義。2，3目前商業(yè)堿性磷酸酶主要來源于動物（小牛腸堿性磷酸酶）、植物（麥芽）和微生物（細(xì)菌堿性磷酸酶）(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，BAP表達(dá)于細(xì)胞膜外的周質(zhì)空間。相比表達(dá)于胞內(nèi)使其更機(jī)動和高效。BAP的功能已基本揭示，簡單來說BAP是細(xì)菌產(chǎn)生攝取應(yīng)用的自由磷酸基團(tuán)的一種方式，4被大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)所支持。然而，缺乏BAP的E. coli 仍然能夠存活，所以應(yīng)該還存在相關(guān)的替代機(jī)制。5目前，對BAP的研究熱點(diǎn)主要由于其海洋有機(jī)磷利用的酶特性等集中于海洋微生物領(lǐng)域。海洋細(xì)菌堿性磷酸酶的亞細(xì)胞研究揭示了其相關(guān)合成基因及表達(dá)特性對于海洋有機(jī)磷循環(huán)及海洋生物多樣性的貢獻(xiàn)。研究人員證實(shí)了3733種BAP序列(包括 PhoA, PhoD, and PhoX )，包含胞質(zhì)分泌及胞外位于不同支載結(jié)構(gòu)。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了細(xì)菌于海洋表面部分光耦合的磷攝取機(jī)制。6鑒于磷對于海洋維持初級產(chǎn)能的重要性，并且考慮到其最主要的來源之一有機(jī)磷分解，海洋生物BAP的分子生物學(xué)研究也是熱點(diǎn)之一。相關(guān)的酶動力學(xué)研究表明，與藻青菌相關(guān)的堿性磷酸酶來說，鈣對于維持其基本活性是必須的。有假說稱其與浮游植物可能是鋅-P共限制的，一些海洋細(xì)菌的BAP可選形式即PhoX是于此相關(guān)的。7此外，分子研究表明，移除BAP的3磷酸集團(tuán)能夠促進(jìn)碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)RNase消化產(chǎn)物分析對的寡核苷酸覆蓋。8另外，ALP于哺乳動物的分子酶動力學(xué)研究與海洋BAP也取得了相應(yīng)的結(jié)果。外生堿性磷酸酶處理補(bǔ)充了結(jié)腸炎的內(nèi)生酶保護(hù)機(jī)制以及抑制了細(xì)菌對大鼠的轉(zhuǎn)座。為AP抵制細(xì)菌轉(zhuǎn)座作用補(bǔ)充了證據(jù)。9本研究對BAP進(jìn)行克隆及表達(dá)研究，能夠?yàn)檫M(jìn)一步的科研研究提供原料，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并無較大科研價(jià)值。參考文獻(xiàn)： 1.Tams, L., Huttov, J., Mistrk, I., Kogan, G. 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Pharmacol Res. 66:144-153.二、實(shí)驗(yàn)方案1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題： 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：包括質(zhì)粒提取、PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、凝膠回收、感受態(tài)制備、IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE鑒定等。 關(guān)鍵問題：IPTG誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化； 超聲破碎的方案優(yōu)化。2. 實(shí)驗(yàn)思路、方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析： 實(shí)驗(yàn)思路：依據(jù)技術(shù)路線完成試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)。 技術(shù)路線： 實(shí)驗(yàn)方案：詳細(xì)方案已于講義給出。 可行性分析：實(shí)驗(yàn)室相關(guān)技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)人員熟悉相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及方法，實(shí)驗(yàn)的可行性很高。3. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)度（10天之內(nèi)）： 前一夜搖菌。 第一天： 1 提取pET-His, pCDNA-BAP； 2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定pET-His, pCDNA-BAP； 3 以pCDNA-BAP為模版擴(kuò)增目的基因片段。 4 酶切pET-His。 第二天 1 凝膠回收酶切片段； 2 PCR產(chǎn)物連接； 3 轉(zhuǎn)化E. coli； 4 搖菌。 第三天 1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 2 提BAP蛋白； 3 SDS-PAGE鑒定。4. 預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果： 1 獲得目的產(chǎn)物BAP； 2 成功構(gòu)建BAP表達(dá)載體； 3 撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。5. 曾參與與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的學(xué)習(xí)和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學(xué)過基因工程課程、讀過相關(guān)的文獻(xiàn)、寫過有關(guān)的綜述、參加過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或研究課題、獲得學(xué)術(shù)獎勵情況等）1學(xué)習(xí)基因工程，期末測評93；讀過分子克隆，GENE IX等文獻(xiàn)； 2于 生物技術(shù)通報(bào)(C) 發(fā)表綜述 蛋白質(zhì)組學(xué)在研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用，第一作者；于 J. Anim. Sci. (SCI) 接收論文 Molecular Characterization and Expression Analysis of ELOVL1 Gene in the Cashmere Goat (Capra hircus) ，第一作者；于 Dna Cell Bio.l接收改稿 Connecting mTORC1 signaling to SREBP1 activation thorough lipids synthesis in mammals，第三作者；3按時(shí)間排序：參與國家創(chuàng)新基金 絨山羊成纖維細(xì)胞中超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Krox20對IGFBP5啟動子活性的影響 完成3種細(xì)胞組成型表達(dá)檢測；參與內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目No. 2011MS0521完成免疫組化工作；主