基因工程原理習題參考答案.doc

基因工程原理習題集參考答案一、名詞解釋1、DNA分子克隆技術：克隆，指含有單一的DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細胞建立無性繁殖系的過程。DNA分子克隆技術也稱基因克隆技術，是在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉入細胞獲得大量拷貝的過程。其基本步驟包括：制備目的基因將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成DNA重組導入宿主細胞篩選、鑒定擴增和表達。載體在細胞內自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結構與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫，另一種是cDNA庫。2、分子雜交：兩條不同來源的DNA（或RNA）鏈或DNA與RNA之間存在互補順序時，在一定條件下可以發(fā)生互補配對形成雙螺旋分子，這種分子稱為雜交分子。形成雜交分子的過程稱為分子雜交。3、限制性片段長度多態(tài)性：從不同個體制備的DNA，使用同一種限制性內切酶酶切，切得的片段長度各不相同。酶切片段的長度可以作為物理圖譜或者連接圖譜中的標記子。通常是在酶切位點處發(fā)生突變而引發(fā)的。4、報告基因：一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因,也就是說,是一個表達產物非常容易被鑒定的基因、5、多聚酶鏈式反應（PCR）：一種體外擴增DNA的方法。PCR使用一種耐熱的多聚酶，以及兩個單鏈引物。以過高溫變性將模板DNA分離成兩條鏈。低溫退火使得引物和一條模板單鏈結合，然后是中溫延伸，反應液的游離核苷酸緊接著引物從5/端到3/端合成一條互補的新鏈。而新合成的DNA又可以繼續(xù)進行上述循環(huán)，因此DNA的數目不斷倍增。6、核酸的凝膠電泳：將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當的電極移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫做電泳的遷移率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數成正比，而與分子的摩擦系數成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數等）。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極向正極移動。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠進行染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。7、細菌轉化：所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致遺傳特性發(fā)生改變的過程。這種提供轉化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉化DNA的菌株則叫做受體菌株。大腸桿菌是使用最廣泛的實驗菌株。8、反義核酸：指與靶DNA或RNA堿基互補，并能與之結合的一段DNA或RNA。9、RNA interference：是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制。將與靶基因的轉錄產物mRNA 存在同源互補序列的雙鏈RNA 導入細胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產生相應的功能表型缺失,這一過程屬于轉錄后基因沉默機制范疇。10、Spi：噬菌體體重組克隆的一種篩選方法，其篩選方法是Spi+：不能感染E.coli(p2)； Spi-：(red- gam-)能感染E.coli(p2),形成小噬斑/host recA+/chi。包裝時若gam- ,需recA產物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑)，所以對宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/gam+可在recA-受體中增殖。11、DNA文庫：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。12、cDNA：cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下形成的互補DNA。13、cDNA文庫：以細胞的全部mRNA逆轉錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫。14、DNA探針：是帶有標記的一段已知序列DNA，用以檢測未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應用。15、轉導（作用）：借助于病毒載體，遺傳信息從一個細胞轉移到另一個細胞。16、染色體步移：通過相互重疊的基因組克隆之間進行一連串雜交從而實現染色體上基因的定位。17、斑點雜交：將被檢標本點到膜上，烘烤固定后與探針進行雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。18、-complementation：質粒載體重組克隆的篩選方法，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現互補。LacZM15 ：放在F質粒上，隨宿主傳代；LacZ ：放在載體上，作為篩選標記。19、菌落原位雜交：將細胞從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。20、核酸原位雜交：標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交的方法。21、限制性內切酶：識別DNA的特異序列，并在識別點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內切酶。22、酶切位點：DNA上一段堿基的特定序列，限制性內切酶能夠識別出這個序列并在此將DNA酶切成兩段。23、DNA連接酶：催化DNA中相鄰的5/磷酸基與3/羥基間形成磷酸二酯鍵，使DNA切囗封合，連接DNA片段。24、持家基因：是指對所有類型組織細胞在任何時候都需要其表達的基因，通常都是維持細胞基本生存所必須的基因，其表達常保持在固定的水平。又稱為組成性表達基因。25、奢侈基因：只在某特定的細胞類型中表達或者說只在發(fā)育階段的某些時期表達的基因叫做奢侈基因。26、Tm值：是反映DNA的熱穩(wěn)定性的一個參數，稱為DNA的熔解溫度，系指一半的雙鏈DNA解離成為單鏈時的溫度。27、分子標記：廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標記是指能夠用來作為指紋鑒定或區(qū)分個體特點的DNA片段。28、基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子中，構成遺傳物質的重新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達的過程。29、載體：是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA，它們一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構建的。30、衛(wèi)星DNA：又稱短串聯重復，26個核苷酸組成的重復單位串聯重復（1060次），兩側為特異的單拷貝序列，人類基因組中每10kbDNA序列至少有一個STR序列。31、多克隆位點：DNA中含有兩個以上密集的、能被多種限制性內切酶識別和切割的位點區(qū)。32、定位克?。阂卜Q為圖位克隆，是在獲取基因在染色體上的位置信息后，采用各種實驗方法對基因進行克隆和定位。定位克隆包括定位和克隆兩個過程，定位是通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置，克隆是從定位的染色體區(qū)段內分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。 也可以回答為“通過遺傳標記”先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內選擇已知基因，進行突變的篩選，并獲得cDNA及全基因的過程。33、基因芯片：基因芯片又稱為DNA微陣列，以基因序列為分析對象的微陣列，是通過縮微技術，根據分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學領域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。34、RT-PCR：是以RNA為起始材料經逆轉錄反應產生cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲取目的基因或檢測基因表達。主要用于分析基因的轉錄產物，克隆cDNA及合成cDNA探針，改造cDNA序列等。35、錨定PCR：用于在體外擴增未知序列的DNA片段的方法，一般的PCR必須預先知道欲擴增DNA片段兩側的序列，但人們經常需要分析一端序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因另一側配對的特異引物參與下，擴增帶有同聚物尾的序列。錨定引物PCR對分析未知序列基因有特殊用途。36、反向PCR：常規(guī)PCR可擴增位于兩個引物之間的DNA片段，但不能擴增引物外側的DNA序列，反向PCR則可擴增引物外側的DNA片段，對已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究。其原理為：先用一種在目標DNA區(qū)段上沒有識別位點的限制性內切酶從距離目標DNA一定距離的兩側位置切割DNA分子，然后將這些片斷進行分子內連接形成環(huán)，根據已知的目標DNA序列按照向外延伸的要求設計一對向外引物，保證被擴增的是目標DNA區(qū)段兩側的未知序列。37、多重PCR：在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴增產物消失，從而發(fā)現基因異常。多重PCR具有靈敏、快速的特點，特別適用于檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結果與southern blotting一樣可靠。38、質粒：是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子?，F在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做載體。39、粘粒載體：也叫柯斯質粒，是一類人工構建的含有DNA的cos序列和復制子的特殊特殊類型的質粒載體。40、穿梭質粒載體：是人工構建的一類具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可以在兩種不同寄主細胞中存活和復制的質粒載體。41、基因突變：基因突變是指由于DNA堿基對的置換、增添或缺失而引起的基因結構的變化，亦稱點突變。42、逆轉錄酶：在體內、外均能轉錄病毒性RNA成為DNA，稱為依賴RNA多聚酶，即為逆轉錄酶。分布在病毒的類核內。逆轉錄酶與三種功能有關： 使RNA一DNA雜合雙鏈形成；切除雜合雙鏈中的RNA鏈；進而再生成DNA一DNA的雙鏈。43、扣除雜交：就是用一般細胞的mRNA與特殊細胞的cDNA雜交，先扣除一般共有的cDNA，再將剩下的特異的cDNA進行克隆，用此方法已成功克隆出控制動物胚胎發(fā)育和組織分化的基因。44、測序酶 為修飾的T7 DNA polymerase，99%3-5外切活性被除去（Version1.0）；完全除去(V 2.0)；用于測序反應(測序酶)。45、YAC載體 酵母人工染色體載體；含酵母染色體復制起點ori，自主復制序列ARS；著絲粒（CEN）；兩個端粒（TEL）。用于克隆50kb以上甚至-Mb（200-500kb）。原生質體電轉化，URA3-trp-ade2-1赭石突變酵母菌，紅色菌落插入失活。46、同尾酶 一類產生相同粘性末端的限制性內切酶。47、cI篩選法 C基因發(fā)生突變時不能溶源化，C- ：在hflA（高頻溶源化）中形成噬斑。C+ 在hflA中形成溶源，產生混濁噬斑。48、Sanger測序 即酶法測序，用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。49、同裂酶：DNA經限制性內切酶切割后，產生相同粘性末端，這類限制性內切酶稱為同裂酶。50、復制起點：DNA復制的起始位點，DNA復制在起始位點處形成復制叉進行雙向復制，通常DNA復制的起始DNA序列存在重復倒位序列。51、啟動子：啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結合的部位，也就是使轉錄開始的部位。在RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下,-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數啟動子均有共同順序(consensus sequence)，只有少數幾個核苷酸的差別。52、起始密碼子：AUG不僅是Met或者fMet(在原核細胞)的密碼子，也是肽鏈合成的起始信號，故稱AUG為起始密碼子。53、起始因子： 在蛋白質生物合成的起始階段與核糖體亞基結合，起始蛋白質的合成。在E.coli中已分離出三種IF。IF1、IF2和IF3。其中，IF3具有形成三元復合物和解離因子活性，使70S核糖體顆粒解離為30S和50S亞基；IF2形成30S前起始復合物；IF1無特異功能，但具有加強 IF2和IF3的活性作用。54、復制終點DNA復制的終止位點，DNA復制在起始位點處形成復制叉進行雙向復制，在終止位點處終止DNA復制，通常DNA復制的終點DNA序列存在重復倒位序列。55、終止子：細菌DNA中有轉錄終止信號，稱為終止子。作用是在DNA模板的特異位點處終止RNA的合成。在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開模板DNA。56、終止密碼子：UAA、UAG和UGA為終止密碼子，不代表任何氨基酸，也稱為無意義密碼子。57、終止因子： 蛋白質肽鏈合成的終止因子，在E.coli中已分離出三種釋放因子。RF1，RF2和RF3。其中，只有RF3與GTP(或GDP)能結合。它們均具有識別mRNA鏈上終止密碼子的作用，使肽鏈釋放，核糖體解聚。二、選擇題參考答案1、B 2、B 3、C 4、C 5、B 6、C 7、B 8、C 9、B 10、C 11、C 12、C 13、D 14、B 15、C 16、D 17、B 18、C 19、B 20、D 21、D 三、填空題參考答案1、外顯子,內含子,斷裂基因； 2、必須基因,非必須基因； 3、轉化,供體菌株,受體菌株； 4、變性、退火、延伸；5、堿性磷酸酶，5磷酸；6、質粒載體、 噬菌體載體、人工染色體載體。7、200-500kb， 10-215kb，平均100kb；8、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺凝膠；9、切口平移法、隨機引物法；10 GAATTC， GGATCC，GATC ；11、RNA酶，RNA；12、小于10kb，9-23kb；13、 最快，最慢，居中。14、復制區(qū)，IG區(qū)。四、判斷題參考答案：1、錯誤 2、錯誤 3、錯誤 4、錯誤五、說明題（下列各項在基因工程中的主要作用或功能）參考答案：1、電泳介質,用于分離大小相差1bp的DNA,或用于分離蛋白質。2、用于制備單鏈DNA,因載體有單鏈絲狀噬菌體的IG區(qū),在幫助單鏈噬菌體的幫助下在宿主細胞中制備單鏈DNA。3、補齊DNA5端缺失的磷酸4、用于植物基因工程的轉化載體, 內含T-DNA區(qū)。5、DNA合成底物。6、電泳介質,用于分離大DNA或RNA7、作為分子雜交用,用于篩選與探針同源的基因8、除去DNA5端的磷酸基,防止DNA重組時載體的自連9、安慰誘導物,結構與別乳糖相似,用于誘導乳糖操縱元的表達10、生色劑，-半乳糖苷酶分解X-gal形成藍色產物，用于互補或藍白斑篩選。六、問答題參考答案：1、分子標記是能夠用來作為指紋鑒定或區(qū)分個體特點的DNA片段。這種標記在遺傳學研究和生物技術應用方面具有非常重要的作用。分子標記的基礎是個體間存在的自然遺傳變異，進而造成許多遺傳序列的多態(tài)性，即這些序列在不同的個體表現不同。分子標記就是通過查找和應用這種變異對個體、性狀和基因在遺傳差異的基礎上進行鑒別。 （1）限制性片段長度多態(tài)性 這是發(fā)展最早的分子標記技術。其原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點發(fā)生變異的突變都可導致RFLP的產生。此技術包括以下基本步驟： DNA的提取和純化；DNA的限制性內切酶酶切；用凝膠電泳將DNA片段分開；把DNA片段轉移到濾膜上；利用放射性標記的探針與濾膜上的DNA片段進行雜交以顯示特定的DNA片段，然后分析結果。（2）隨機擴增多態(tài)性DNA該技術用隨機引物非定點地擴增DNA片段，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分開擴增片段。其特點包括：不需DNA探針，設計引物也不需要預先知道序列信息；用一個引物就可擴增出許多片段，總的來說RAPD在檢測多態(tài)性時是一種相當快速的方法；技術簡單，RAPD分析不涉及分子雜交、放射自顯影或其他技術；RAPD分析所需DNA樣品量少；RPD分析中存在的最大問題是重復性不太高，因為在PCR反應中條件的變化會引起一些擴增產物的改變。（3）擴增片段長度多態(tài)性 其特點是把RFLP和PCR結合了起來。其基本步驟是：把DNA進行限制性內切酶酶切，然后選擇特定的片段進行PCR擴增（在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”），用接頭互補的但3/端有幾個隨機選擇的核苷酸的引物進行特異PCR擴增，只有那些與3/一端嚴格配對的片段才能得到擴增，再在有高分辨率的測序膠上分開這些擴增產物，用放射性法、熒光法或銀染色法均可檢測之。（4）單核苷酸多態(tài)性技術 同一位點的不同等位基因之間常常只有一個或幾個核苷酸的差異，因此在分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標記，已 有2000多個標記定位于人類染色體上，在植物上也在進行開發(fā)研究。2、類限制性核酸內切酶、類限制性核酸內切酶和類限制性核酸內切酶三類。類限制性核酶最適合基因工程，因為類限制性核酶內切酶只由一條肽鏈構成，僅需MG2+，切割DNA特異性最強，且就在識別位點范圍內切斷DNA。類和類限制性核酸內切酶由于切割序列是隨機的，與識別序列不統一，因此在基因工程中沒有什么價值。3、細菌通過對自身DNA上的識別序列進行甲基化來保護自己的DNA不被限制性內切酶破壞。4、對于平末端DNA，右先連上工設計合成的EcoRI切割產生的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，然后再插入到EcoRI限制位點中去；也可以將EcoRI的限制位點進行改造，將粘性末端變成平末端后，用T4DNA連接酶進行連接。5、 6、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進行連接反應，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導入能進行正常復制的寄主細胞，從而得到復制； （4）重組體分子的轉化子克隆的選擇和篩選。7、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進行連接反應，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導入能進行正常復制的寄主細胞，從而得到復制； （4）重組體分子的轉化子克隆的選擇和篩選。8、差異克隆：利用來源不同DNA之間的表現度差異來分離差異表達基因的功能克隆方法。在任何組織中都表達的基因是管家基因，在大多數cDNA文庫中都出現。用一個來源的cDNA去除第二個來源中共同的RNA，留下獨特的RNA用于文庫構建。9、基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子中，構成遺傳物質的重新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達的過程。 基因工程是基因分子水平上的遺傳工程，是一門能定向改造生物遺傳性狀的育種新技術?；蚬こ棠苁箮в懈鞣N遺傳信息的DNA片段越過不同生物間特異的細胞界限而組入到完全不同的生物體內。定向地控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異，從而創(chuàng)造出自然界沒有或具有新的遺傳性狀的生物新品種。10、(1)具有多克隆位點； （2）能自我復制； （3）具有篩選標記；（4）在細胞內的穩(wěn)定性。11、 (1)具有多克隆位點； （2）能自我復制； （3）具有篩選標記；（4）在細胞內的穩(wěn)定性。12、（1）cDDNA是指以mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下形成的互補DNA。以細胞的全部mRNA逆轉錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫。 基因組文庫指的是將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導入宿主細胞,進行克隆得到的所有重組體內的基因組DNA片段的集合,它包含了該生物的所有基因。 （2）基因組文庫與cDNA文庫的差別：基因組文庫中包含了甩有的基因，而cDNA文庫只包含表達的基因，缺乏內元和調節(jié)序列，因此在研究基因結構時沒有多大用處。cDNA文庫代表了mRNA的來源，其中一些特定的轉錄本豐富而另一些很少，所以存在豐度的差別；而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列。從不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別表達的基因；基因組文庫中不能?；蚪M文庫由于含有不表達序列，因此比cDNA文庫大。mRNA在不同的組織之間存在豐度的差異，因此cDNA文庫的在構建時對于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的問題。13、（1）抗生素抗性基因插入失活法； （2）一半乳糖苷酶基因失活插入法； （3）放射性標記核酸探針雜交法。14、構建cDNA文庫的主要步驟：mRNA分離； cDNA第一鏈合成； cDNA第二鏈合成 載體與cDNA的連接；噬菌體的包裝及轉染； cDNA文庫的擴增和保存。15、聚合酶鏈反應，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的的方法，因此也稱為基因的體外擴增法。是20世紀80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點。其應用主要是以下幾個方面： （1）科學研究： 基因克??；DNA測序；分析突變；基因重組與融合；檢測基因的修飾；鑒定與調控蛋白質結構的DNA序列；轉座子插入位點的繪圖；合成基因的構建；構建克隆或表達載體；檢測某基因的內切酶多態(tài)性等。 （2）臨床診斷：細菌、病毒、螺旋體、支原體、衣原體、立克次氏體、分枝桿菌等病原體的鑒定；人類遺傳病的鑒定；診斷遺傳疾患；臨測臨床標本中病原體的核酸序列；對法醫(yī)學標本做遺傳學鑒定；分析激活癌基因中的突變情況；生成克隆化雙鏈DNA中的特異序列作為探針。16、（1）相同點：反應的底物都是dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）；都需要DNA聚合酶的催化，而且鏈的延伸都只能是5/3/方向；都需要模板，都按半保留復制機理進行；都需要引物；都需要MG2+催化。（2）不同點：細胞內DNA復制是半不連續(xù)復制，而PCR中，DNA是連續(xù)復制；細胞內DNA的復制時，不需要將雙鏈完全解開形成單鏈，按半不連續(xù)方式進行DNA的復制，而PCR反應中，DNA雙鏈必須完全解鏈，復制過程都是連續(xù)進行的；細胞內DNA的復制時，DNA的解鏈通過解鏈酶催化，而PCR反應中是通過高溫使雙鏈解離；細胞內DNA的復制時，引物是通過RNA聚合酶和成的RNA鏈，而PCR反應中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸； 細胞內DNA的復制時，溫度保持一致，而PCR反應中，溫度在解鏈溫度、退火、延伸3個溫度之間變化。17、PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有六種，即引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs（包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，是PCR反應中靶DNA序列擴增的原料）、模板DNA和緩沖液（通常含有MGCl2、Tris一HCl、KCl等）、MG2+（DNA聚合酶的激活劑）。18、很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼一半乳糖苷酶N一端的146個氨基酸，稱為一肽，載體轉化的宿主細胞為lacZ15基因型，它表達一半乳糖苷酶的C一端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有一半乳糖苷酶活性，使特異的底物X一gal變?yōu)樗{色化合物，這就是所謂的一互補，而重組子由于基因插入使一肽基因失活，不能形成一互補，在含X一gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。19、限制性酶切片段長度多態(tài)。20、原理：基因芯片的工作原理與經典的核酸分子雜交方法一致，都是應用已知核酸序列作為靶基因與互補的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對原理將兩者進行雜交；再通過熒光或同位素檢測系統對芯片進行掃描，由計算機系統對每一探針上的信號做出比較和檢測，從而得出所需要的信息。 生物學研究的意義： （1）用于繪制基因缺失圖譜和進行基因表達分析； （2）用于基因突變研究； （3）用于病毒病原體的檢測和基因分型；（4）用于細菌檢測；（5）用于同細胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統性地研究細胞中任意時期特異表達的基因；（6）能了解某些基因對特定生長發(fā)育階段的重要性；（7）基因芯片還可用于進行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖；（8）用病人的可疑cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達受抑制或激活。21、管家基因是指所有類型組織細胞在任何時候都需要表達的基因。由于管家基因是生命活動必需的基因，表達相對穩(wěn)定，差異小，所以在基因芯片技術中根據各芯片的管家基因可以得出標準化系數進行標準化校正；管家基因在所有的細胞中都有表達，因此有關管家基因的概念有助于分析差異表達基因的表達情況，進而進行差異表達基因的克隆。通過管家基因，能比較不同樣本中某種mRNA的水平。在進行基因分離時，可通過不同組織間基因的比較，扣除相同部分（管家基因）后得到差異表達基因，從而得到不同組織間基因表達。22、（1）用于鑒定啟動子； （2）可以用以了解細胞中基因的表達情況，便于分析基因的調節(jié)； （3）在轉基因研究領域用于檢測轉基因是否成功23、基本步驟：組織與細胞的固定組織和細胞雜交前的預處理探針的選擇及標記雜交雜交結果的檢測。24、（1）RFLP標記 DNA某一位點上的變異有可能引起該位點特異性的限制性內切酶識別位點的改變，包括原有位點的消失或出現新的酶切位點，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化。這種變化引起的多態(tài)現象即為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。對RFLP的檢測主要是用southern雜交的方法進行，即利用限制酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經標記的特異DNA探針與之雜交，通過發(fā)射自影或非同位素顯色技術來揭示DNA的多態(tài)性。 （2）RAPD標記 隨機擴增多態(tài)性DNA，用隨機短引物（人工合成的六核苷酸）進行DNA的PCR擴增。所擴增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機性和任意性，因此隨機引物PCR標記技術可用于對任何未知基因研究。 （3）ISSR標記 簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性。利用基因組中常出現的SSR本身設計引物，無需預先克隆和測序。 （4）SSR標記 簡單重復序列多態(tài)性，又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯重復的拷貝數目不等而出現的多態(tài)現象。 （5）STS標記 序列標定位置。染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組中只有一份拷貝的DNA短片斷，一般長200500bp。STS標記是根據單拷貝的DNA片斷兩端的序列，設計一對特異引物，經PCR擴增基因組DNA而產生的一段長度為幾百bP的特異序列。（6）AFLP標記擴增片段長度多態(tài)性。通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點和其后的選擇性堿基的變異。（7）CAPS標記 是特異引物PCR與限制性酶切相結合而產生的一種DNA標記，當SCAR或STS的特異擴增產物的電泳譜帶不表現多態(tài)性時，一種補救辦法就是用限制性內切酶對擴增產物進行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為CAPS標記。它揭示的是特異PCR產物DNA序列內限制性酶切位點變異的信息，也表現為限制性片段長度的多態(tài)性。（8）SNP標記 單核苷酸多態(tài)性。不同個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸的差別。其比較的不是DNA的片段長度，而是相同序列長度里的單個堿基的差別。25、重組的類型主要有以下幾種： （1）同源重組：重組對之間需要有同源性。調節(jié)這一過程的蛋白（如大腸桿菌中的RecA）不是序列專一性的，而是同源依賴的，經常涉及長的同源區(qū)域。Holliday模型可以用來解釋同源重組的分子機制。 （2）位點特異性重組：在能識別特定的核苷酸序列的重組酶作用下，DNA分子間的重組。噬菌體DNA的整合和切離是典型的位點特異性重組。調節(jié)這一過程的蛋白（位點特異性重組酶）在供體和受體分子中識別短的，特異DNA序列，這些蛋白之間的相互作用幫助重組。 （3）轉座重組：由于在轉座酶的作用下轉座因子插入染色體或切離染色體而產生的遺傳重組，重組對之間不需要同源性。如玉米中的Ac一Ds雙因子系統，果蠅中的P因子等。 （4）異常重組：發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間。按其機制主要分為兩類：末端連接是指斷裂的DNA末端彼此相連；鏈滑動是指DNA復制時，由一個模板跳躍到另一個模板所引起的重組。 （5）不正常重組：重組對之間不需要同源性或少量同源性，是異常細胞作用的結果。包括復制中不正常的（但在錯誤的地方發(fā)生）同源重組。 （6）人工重組：體外用純化的酶和底物進行的DNA連接引起的重組。26、PCR是一種模擬天然DNA復制過程,在有DNA模板、DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶）、引物和4種dNTP的情況下，通過高溫變性一低溫退火一中溫延伸這樣反復循環(huán)的過程，在體外擴增特異性DNA片段的分子生物學技術。 特殊的PCR方法有：錨式PCR，可以用來快速分離cDNA末端（RACE）；反向PCR，可擴增引物外側的DNA片段，對已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究；多重PCR，在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴增產物長度減少或消失，從而發(fā)現基因異常；反轉錄PCR，先將mRNA反轉錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。其他還有PCR，熒光PCR等。27、根據核酸分子探針的來源及其性質，探針的種類可分為四類： （1）基因組DNA探針 克隆化的各種基因片段是最常用的核酸探針，因真核基因組存在高度重復序列，探針應盡可能選用基因的編碼序列（外顯子），避免使用內含子及其他非編碼序列，否則探針可能因高度重復序列的存在引起非特異性雜交而導致假陽性結果。 （2）cDNA探針 與mRNA互補的DNA鏈稱cDNA，cDNA中不存在內含子及其他高度重復序列，故特異性高，是一種較理想的核酸探針。 （3）RNA探針 RNA探針有以下優(yōu)點： RNA：RNA、RNA：DNA雜交體較DNA：DNA雜交體的穩(wěn)定性高；RNA單鏈不存在雙鏈DNA探針的互補雙鏈的復性，雜交效率高；RNA無高度重復序列，非特異雜交少；雜交后可以用RNase消化未雜交的RNA探針，可降低雜交本底。（4）寡核苷酸探針 人工合成的寡核苷酸片段作探針的優(yōu)點：可以根據需要合成相應的序列，避免基因組DNA探針中高度重復序列所帶來的影響；多數長為1530bp即使有一個堿基不配對也會影響雜交鏈的Tm值，嚴格控制反應條件，可檢測出基因點突變；探針復雜性降低，雜交反應時間較短。28、（1）非放射性標記物主要有四類： 半抗原：如生物素、地高辛，可利用這些半抗原的抗體進行檢測。配體：生物素是抗生物素蛋白卵白素和鏈霉菌類抗生物素蛋白的配體可用親和法檢測。熒光素：如羅丹明（一種熒光染料）等可被紫外線激發(fā)出熒光，用于檢測?；瘜W發(fā)光材料：有些標記物與另一類物質反應而產生化學發(fā)光現象，能直接對x光片曝光。（2）優(yōu)點：安全、對環(huán)境和人體無害、其標記物可反復使用，不存在半衰期問題，其標記的DNA探針保存在50%的甘油中，在一200C可保存半年之久。（3）合成非放射性核酸探針的方法主要有：異羥基毛地黃苷配基標記DNA探針（地高辛配基系統）。DNA探針的生物素標記。直接與核酸發(fā)生活性反應、連接到核酸探針上的非放射性標記物，如：光敏生物素；辣根不定期氧化物酶；堿性磷酸酶等，均可通過化學方法直接交聯到核酸探針上，雜交后再用相應的方法，如抗原一抗體反應、酶促反應顯色等檢測。熒光素標記核酸探針：根據探針標記的性質不同，雜交體可直接用熒光顯微鏡觀察，或用酶組織化學法、免疫組織法檢測。29、濾膜雜交主要有： （1）southern blotting：特指DNA印跡雜交； （2）northern blotting：特指RNA印跡雜交； （3）dot blotting（斑點印跡）/slot blotting（狹線（縫）印跡）。例如：southern blotting（印跡法）基本流程：組織或細胞基因組DNA限制性內切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳印跡轉移至濾膜預雜交加入探針雜交洗膜放射自顯影。30、足跡法研究RNA聚合酶與啟動子的識別及結合末端標記的DNA+RNA聚合酶用用DNA酶水解電泳放射自顯影，對照：DNA用DNA酶水解電泳放射自顯影，結果：啟動子部位受RNA聚合酶保護，不被降解；啟動子功能的研究一啟動子突變。使啟動子的堿基序列發(fā)生變化或采用修飾堿基的方法，可以改變啟動子的強弱。使啟動子的功能減弱或消失下降突變，使啟動子的功能增強上升突變。31、真核生物mRNA的3/端有一段poly（A）結構，根據堿基互補配對原則，A與T能形成堿基互補。32、在極端非標準條件下，限制酶能識別與切割序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。引起星星活性的因素：高濃度甘油（5%）；酶過量（100U/g）；低離子強度（25mM）；高Ph(8.0)；有機溶劑（二甲基亞砜（PMSD）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、 二甲基甲酰胺）；用其它二價陽離子代替Mg2+ （Mn2+ 、Cu2+、Co2+、 Zn2+）。33、Ipp：大腸桿菌強啟動子（脂蛋白基因）lac：乳糖操縱元的啟動子及操縱子 S：大腸桿菌分泌蛋白基因序列 MCS：多克隆位點 Ipp：大腸桿菌強終止子 lacI：乳糖操縱元的調控基因 ori：質粒的復制起點 ampr：抗氨芐青霉素(AmpR)的基因此載體的用途：作為大腸桿菌中的一個可調控的表達載體，可大量表達克隆的外源基因，并將蛋白分泌到細胞外。工作原理：將外源基因正確插入到克隆載體后，轉化進入大腸桿菌，通過加入IPTG誘導外源基因的表達。34、pBR322 ori：來源于pBR322載體的質粒復制起點，此載體在宿主菌中能自主復制。 lacIq：來自于乳糖操縱元的調控突變基因，可產生大量調控蛋白。 Plac：來自于乳糖操縱元的啟動子 lacO：來自于乳糖操縱元的操縱子g10 RBS：來自于g10基因的核糖體結合位點序列。6His：6個組氨酸的短肽序列，這些帶有組氨酸標簽的蛋白質能夠緊緊地同A蛋白柱結合，但很容易被EDTA溶液洗脫。從而可以一步完成大量蛋白質的純化。MCS：多克隆位點，可以插入外源基因。rrnB：來自5SrRNA基因的終止子序列。此載體的用途：作為大腸桿菌中的一個可調控的表達載體，可大量表達克隆的外源基因，此蛋白帶有6個組氨酸的短肽序列，這些帶有組氨酸標簽的蛋白質能夠緊緊地同A蛋白柱結合，但很容易被EDTA溶液洗脫。從而可以一步完成大量蛋白質的純化。工作原理：將外源基因正確插入到克隆載體后，轉化進入大腸桿菌，通過加入IPTG誘導外源基因的表達。35、（1）根據已知氨基酸序列和密碼子使用頻率及簡并性，分別對氨基酸N端、C端和中間都取一定長度的序列推出其mRNA。（2）再根據mRNA合成cDNA，并加上放射性標記作為探針(猜測體探針)。（3）提取該物種的總DNA，用適合的酶切消化，選擇一種合適的載體與酶切消化DNA的片段連接，轉化宿主，篩選，構建該物種的基因組文庫。（4）用3種探針分別與文庫進行原位雜交，篩選陽性克隆，再用3種探針分別與不同探針從文庫中篩選的陽性克隆雜交，陽性克隆可能為該基因克隆。（5）將此陽性克隆作序列分析對比，直到克隆到基因為止。七、分析題：參考答案：1、（1）PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完