RNAi的作用機(jī)制及siRNA的合成方法.doc

RNAi的作用機(jī)制及siRNA的合成方法RNAi的作用機(jī)制及siRNA的合成方法RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)或使其沉默的過程。dsRNA可以抑制不同類型細(xì)胞的靶向基因表達(dá)，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。因.關(guān)鍵詞：合成方法機(jī)制作用基因siRNARNAi的作用機(jī)制及siRNA的合成方法RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double strandedRNA， dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)或使其沉默的過程。dsRNA可以抑制不同類型細(xì)胞的靶向基因表達(dá)，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。因此，RNAi技術(shù)又被形象地稱為基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)。RNAi是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post tracriptional gene silencing，PTGS)1。1 RNAi技術(shù)的發(fā)展過程早在1990年，植物學(xué)家Jorgeen等人用矮牽?；ㄗ鲈囼灒瑢⒆仙睾铣苫?qū)胫参矬w，嘗試將更多拷貝的色素基因注入植物體，使花朵的色彩更加艷麗。結(jié)果許多花朵沒有開出更艷麗的花朵，反而開出白色的花朵。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)入的基因不但自身沒有表達(dá)為蛋白質(zhì)，反而關(guān)閉了牽牛花中與其同源的色素相關(guān)基因的表達(dá)。由于這種由外源基因的導(dǎo)入而造成的抑制作用最初被確認(rèn)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，稱這種現(xiàn)象為共抑制(cosureion)2。1994年，Cogoni等人將外源性類胡蘿卜素基因?qū)胍吧痛植阪滄呙咕?，結(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制，他們稱這種基因失活形式為消除作用或基因壓制(quelling)3。1995年康乃爾大學(xué)的Guo4博士在實驗中想通過反義RNA阻斷美麗線蟲(C. elega)的par-1基因表達(dá)，同時還用正義RNA做了一個對照，試圖觀察到對照試驗組基因表達(dá)增強(qiáng)的現(xiàn)象，但結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)了反義和正義RNA都阻斷了該基因的表達(dá)，Guo等人一直不能解釋該現(xiàn)象。直到1998年Fire等5才發(fā)現(xiàn)這是由于Guo博士在試驗中污染了雙鏈RNA而引起的。他們還證明轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA經(jīng)純化后注射線蟲所引起的阻斷作用十分微弱，而經(jīng)純化的雙鏈RNA則能高效特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，他們將此現(xiàn)象稱為RNA干擾。1999年， Hunter6等的實驗進(jìn)一步驗證了RNAi的存在。他們將dsRNA去除后，再將正義或反義的RNA注入線蟲卵中，沒有產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。相反，如果將上述正義及反義RNA混合，經(jīng)退火復(fù)性后得到的dsRNA注入線蟲卵中可以顯著地產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，從而印證了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的結(jié)論。2000年首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為2123 nt的短片段。2001年，首次報道了哺乳動物細(xì)胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（shRNA）在哺乳動物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)特異性的基因沉默7。2003年首次用RNAi技術(shù)對模型動物進(jìn)行了治療研究8。2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎沒有堅持研究成果要經(jīng)過數(shù)十年實踐驗證的“慣例”，破格授予美國科學(xué)家安德魯菲爾和克雷格梅洛，以表彰他們1998年發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。此后，人們在不同種屬的生物中進(jìn)行了廣泛而深入的研究，結(jié)果證實dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象存在于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、渦蟲、水螅、斑馬魚、小鼠、大鼠、猴乃至人類等多種生物中2。2 RNAi的作用機(jī)制目前關(guān)于基因沉默的假說認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，主要包括起始階段、效應(yīng)階段和倍增階段。21 起始階段外源性導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等多種方式引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)， 在細(xì)胞內(nèi)特異性與RNA酶(RNAase核酸內(nèi)切酶) Dicer結(jié)合，dsRNA被切割成2123nt長度的帶有3端單鏈尾巴及磷酸化的5端的短鏈dsRNA，即小干擾RNA(siRNA)。（以下圖片均來自于陳莉等的文章在醫(yī)藥領(lǐng)域中RNA干擾研究進(jìn)展）2.2 效應(yīng)階段雙鏈siRNA可以與含Argonauto（Ago）蛋白的核酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在ATP供能情況下，激活的RISC將siRNA的雙鏈分開，RISC中核心組分核酸內(nèi)切酶Ago負(fù)責(zé)催化siRNA其中一條鏈去尋找互補(bǔ)的mRNA鏈，然后對其進(jìn)行切割。反義鏈先與同源mRNA配對結(jié)合，然后RISC在距離siRNA 3端12個堿基的位置將mRNA切斷降解，從而阻止靶基因表達(dá)，使基因沉默9。2.3 倍增階段siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA為模板，siRNA為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產(chǎn)生更多的siRNA， 可再次形成RISC，并繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)。并作用于靶mRNA。如此反復(fù)倍增，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大。因此少量的siRNA就可以產(chǎn)生高效的基因沉默效果10。3 RNAi的設(shè)計及合成3.1 siRNA的設(shè)計設(shè)計高效率的siRNA首先要通過NCBI、DDBJ、BMBL這3個基因序列數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)的基因序列，獲得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理設(shè)計siRNA。常規(guī)siRNA的設(shè)計原則是以成熟的mRNA為標(biāo)準(zhǔn)，若以DNA序列為參照，則最好選擇cDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)+50到+100以后的下游序列，兩端的非翻譯區(qū)不作為siRNA設(shè)計依據(jù)。siRNA二聚體的正義鏈和反義鏈各含21nt為佳，3端為突出末端。3凸端為尿苷(U)，5凹端為腺苷(A)的mRNA序列應(yīng)作為首選。進(jìn)行Gen-Bank BLAST查詢，確保所選siRNA編碼不與其它基因同源11。不是mRNA的所有亞單位都能形成有效的siRNA，大約有60%70%可以發(fā)揮沉默效應(yīng)， 這是由于5和3-UTR有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，產(chǎn)生UTR結(jié)合蛋白或翻譯起始復(fù)合物均可能影響RISC結(jié)合mRNA，從而影響siRNA的效果，所以沉默效應(yīng)率差異較大，針對一個靶基因需要設(shè)計34條siRNA，以保證能夠篩選出一條有效序列12。3.2iRNA的合成方法制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶消化法、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法等。當(dāng)已經(jīng)找到最有效的siRNA時，適合以核苷酸單體為原料，通過化學(xué)方法合成兩條互補(bǔ)的長約2123 nt的RNA單鏈，然后退火形成雙鏈復(fù)合體，這種方法所獲得的產(chǎn)物純度、干擾效率高，合成簡單，但是制備周期長，作用時間短，而且價格昂貴限制了其應(yīng)用和推廣13。體外轉(zhuǎn)錄法14是以兩段互補(bǔ)的DNA為模板， 在針對靶序列的正義鏈和反義鏈上游接上T7啟動子，使用T7 RNA聚合酶，各自在體外轉(zhuǎn)錄獲得兩條單鏈RNA，將兩條單鏈退火后形成雙鏈RNA，然后用RNA酶消化，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后就是所需的雙鏈RNA，此方法適用于篩選有效的siRNA，但不適用于對特定siRNA進(jìn)行長期研究。酶消化法15是先在體外化學(xué)合成2001000 完整的目的基因長片段dsRNA， 用細(xì)胞內(nèi)形成的siRNA關(guān)鍵酶-Dicer酶或者RNase進(jìn)行消化，即可得到各種不同的針對同一目的基因的不同位點的siRNA混合物，然后將混合物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，能得到較高的抑制效率。該方法抑制率高，且省時省力， 但此法產(chǎn)生的混合物可能導(dǎo)致非特異性抑制，另外在體外轉(zhuǎn)錄長鏈RNA有困難，Dicer酶費(fèi)用較高16，此方法不適用于長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄17是將siRNA的質(zhì)粒、病毒表達(dá)載體或帶有siRNA表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)胞，由細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生RNA干擾作用。siRNA表達(dá)載體常用能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的含有RNA聚合酶(pol)啟動子的載體18 ，通過轉(zhuǎn)染含有RNA聚合酶II/III的啟動子U6或H1，及其下游一小段特殊結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒或病毒載體到宿主細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄出shRNA，該RNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶剪切成siRNA而發(fā)揮作用。該方法的優(yōu)點是細(xì)胞特異性強(qiáng)，適用于基因功能的長時間研究2。siRNA表達(dá)框(siRNA expreion caettes， SECs)17是一種由PCR制備的siRNA表達(dá)模板，可直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需