飼料酶制劑企業(yè)標(biāo)準(zhǔn).doc

飼料酶制劑標(biāo)準(zhǔn)引 言本標(biāo)準(zhǔn)是針對(duì)以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)、含有二種或二種以上主要功效酶成分、經(jīng)配置而成的飼料用復(fù)合酶制劑。目前市場(chǎng)上的飼料用復(fù)合酶制劑酶活力單位定義不同，因此在本標(biāo)準(zhǔn)中酶活力的表示除自定義的外，還將其換算成國(guó)際單位，便于科研、生產(chǎn)、銷(xiāo)售和使用單位的使用。1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了來(lái)源于黑曲霉的飼料用復(fù)合酶制劑的術(shù)語(yǔ)和定義、產(chǎn)品分類(lèi)、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯存條件。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 191-2000 包裝、儲(chǔ)運(yùn)、圖示標(biāo)志GB/T 5917-1986配合飼料粉碎粒度測(cè)定方法GB/T 6435-1986飼料水分的測(cè)定方法GB 10648 飼料標(biāo)簽GB/T 130791999飼料中總砷的測(cè)定GB/T 130801991 飼料中鉛的測(cè)定方法GB/T 130821991 飼料中鎘的測(cè)定方法GB/T 13091-2000 飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法GB/T 174801998飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定GB/T 18869-2002 飼料中大腸菌群的測(cè)定QB/T 1803工業(yè)用酶制劑通用試驗(yàn)方法NYT 722-2003 飼料用酶制劑通則GB/T6388 運(yùn)輸包裝收發(fā)貨標(biāo)志QB/T1804 工業(yè)酶制劑 通用檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志，包裝，運(yùn)輸，貯存QB/T1805.3 工業(yè)用蛋白酶制劑QB/1502-1992 食品添加劑果膠酶制劑國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局(1995)第43號(hào)令定量包裝商品計(jì)量監(jiān)督規(guī)定3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)、定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1飼料用酶制劑 Enzymatic Preparation for Feed飼料用酶制劑是通過(guò)產(chǎn)酶微生物發(fā)酵工程或含酶動(dòng)、植物組織提取技術(shù)生產(chǎn)加工而成，具有一種或幾種底物清楚的酶催化活性，有助于改善動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收等，并有生物學(xué)評(píng)定依據(jù)，符合安全性要求，作飼料添加劑用的酶制劑產(chǎn)品。3.2飼料用復(fù)合酶制劑 通過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)品中含有二種或二種以上主要功效酶成分，對(duì)飼料中多種成分具有酶催化作用的飼料用酶制劑。3.3酶活單位: 根據(jù)作用底物的不同，對(duì)飼料用復(fù)合酶中相關(guān)酶種的酶活單位作如下定義。3.3.1酸性蛋白酶按部頒法以酪蛋白為底物（Merck公司生產(chǎn)，Hammastein法制備），在pH2.3，40反應(yīng)10分鐘后，用Folin法測(cè)定蛋白酶活力，以每分鐘生產(chǎn)1g或1M酪氨酸所需酶量為一個(gè)單位。分別以U/g 和IU/g表示。3.3.2半纖維素酶：以木聚糖為底物（Sigma公司生產(chǎn)，燕麥木聚糖），在pH5，40反應(yīng)30分鐘后，用DNS法測(cè)定木糖生成量，以每分鐘產(chǎn)生1g或1M木糖所需之酶量為一木聚糖酶活力單位。分別以U/g 和IU/g表示。3.3.3果膠酶活性：以果膠（Sigma，桔皮果膠）為底物，在pH3.5，50反應(yīng)30分鐘后，DNS法測(cè)定生成的半乳糖醛酸量，以每小時(shí)生成1g或1M半乳糖醛酸所需酶量為一個(gè)單位。分別以U/g 和IU/g表示。3.3.4纖維素CMC酶按部頒法以CMC鈉（上海試劑廠生產(chǎn)）為底物，在pH4.8，50反應(yīng)30分鐘后，用DNS試劑測(cè)定生成的還原糖量，以每小時(shí)生成1g或1M葡萄糖所需酶量作為一個(gè)纖維素酶活單位。分別以U/g 和IU/g表示。3.3.5糖化酶活性：以可溶性淀粉（菱湖淀粉廠生產(chǎn)）為底物40，pH4.5反應(yīng)30分鐘后，用碘量法測(cè)定生成的還原糖量，以每小時(shí)生成1g或1M葡萄糖所需酶量為一個(gè)單位。分別以U/g 和IU/g表示。3.3.6 -葡聚糖酶在40、pH5.0的條件下，每分鐘內(nèi)從濃度為1.0%（w/v）的葡聚糖（SigmaG6513）溶液中降解釋放出1g或1M葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，分別以U/g 和IU/g表示。4飼料用復(fù)合酶制劑的安全性由黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)獲得的飼料用復(fù)合酶，采用的產(chǎn)酶菌種是我國(guó)農(nóng)業(yè)部105號(hào)公告公布的允許使用的飼料級(jí)微生物菌種，同時(shí)也是符合食品添加劑使用的發(fā)酵菌株。5要求5.1感官指標(biāo)微黃色粉末、色澤均勻、無(wú)異味、無(wú)發(fā)霉變質(zhì)、結(jié)塊。5.2酶活力指標(biāo)飼料用復(fù)合酶產(chǎn)品中的酶系及酶活力指標(biāo)應(yīng)符合表1規(guī)定。表1. 產(chǎn)品酶系及酶活力酶系酶活酸性蛋白酶糖化酶果膠酶半纖維素酶纖維素酶葡聚糖酶U/g10000180000012000075000720000180000IU/g6010000600500400010005.3衛(wèi)生指標(biāo)衛(wèi)生指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2飼料用復(fù)合酶制劑的衛(wèi)生指標(biāo)砷，mg/kg,（以As 計(jì)）5.0鉛，mg/kg,（以 Pb計(jì)）10.0鎘，mg/kg,（以 Cd計(jì)）0.5沙門(mén)氏菌，不得檢出大腸菌群，MPN/100g3000黃曲霉毒素B1, mg/kg0.05注： 不得檢出國(guó)家明令禁止的藥物和物質(zhì)。5.4粒度孔徑0.325mm（60目篩）分析篩篩上物，不大于20%。5.5水分不大于10%。5.6凈含量按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局（1995）第43號(hào)令執(zhí)行。6試驗(yàn)方法6.1感官要求取樣品適量，進(jìn)行感官檢驗(yàn)，觀察、嗅聞或觸摸。6.2酶活力6.2.1酸性蛋白酶按附錄A測(cè)定。6.2.2半纖維素酶按附錄B測(cè)定。6.2.3-葡聚糖酶活力按附錄C測(cè)定。6.2.4纖維素CMC酶活力按附錄D測(cè)定。6.2.5糖化酶活力按附錄E測(cè)定。6.2.6果膠酶活力按附錄F測(cè)定。6.3砷（As）按GB/T13079-1999執(zhí)行。6.4鉛（Pb）按GB/T 13080-1991執(zhí)行。6.5鎘（Cd）按GB/T13082-1991執(zhí)行。6.6沙門(mén)氏菌按GB/T 13091-2000執(zhí)行。6.7大腸菌群按GB/T 18869-2002執(zhí)行。6.8黃曲霉毒素B1按GB/T 17480-1998執(zhí)行。6.9水分按GB/T 6435-1986執(zhí)行。6.10粒度按GB/T 5917-1986執(zhí)行。6.11凈含量用適宜感量的衡器進(jìn)行檢驗(yàn)。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1組批的定義生產(chǎn)廠以每一班次生產(chǎn)且經(jīng)包裝的、具有同樣工藝條件、同一產(chǎn)品名稱(chēng)、批號(hào)、規(guī)格和同樣質(zhì)量證明書(shū)的產(chǎn)品為一個(gè)組批。7.2取樣方法從每批產(chǎn)品的包裝中隨機(jī)抽取。用清潔適用的取樣工具伸入所取樣品的四分之三深處，用交叉法取出足夠量的樣品，將采得的樣品充分混合均勻按四分法縮分至250g，平分裝入兩個(gè)清潔、干燥具有密閉性和避光性的具塞樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，注明生產(chǎn)廠名稱(chēng)、產(chǎn)品名稱(chēng)、批號(hào)、取樣日期等。7.3檢驗(yàn)分類(lèi)產(chǎn)品分為出廠檢驗(yàn)和型式檢驗(yàn)。7.3.1出廠檢驗(yàn)7.3.1.1出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目感官指標(biāo)、酶活力、水分、粒度、凈重。7.3.1.2判定方法對(duì)抽取的樣品按出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)結(jié)果中有任何一項(xiàng)指標(biāo)不合格時(shí)，應(yīng)重新取樣進(jìn)行復(fù)檢，取樣范圍或樣品數(shù)量為第一次取樣量的兩倍，復(fù)檢結(jié)果中仍有指標(biāo)不合格，則整批產(chǎn)品判為不合格，不能出庫(kù)。7.3.1.3判定結(jié)論每批產(chǎn)品應(yīng)由生產(chǎn)廠質(zhì)量檢驗(yàn)部門(mén)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，只有檢驗(yàn)合格后方可簽發(fā)合格證出廠。7.3.2型式檢驗(yàn)7.3.2.1型式檢驗(yàn)項(xiàng)目型式檢驗(yàn)的樣品必須從出廠檢驗(yàn)合格產(chǎn)品中隨機(jī)抽取。型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為本標(biāo)準(zhǔn)“5要求”中各項(xiàng)指標(biāo)。7.3.2.2型式檢驗(yàn)的范圍有下列情況之一時(shí)，應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：a).審發(fā)生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)時(shí)；b).產(chǎn)品的原輔材料、工藝過(guò)程及主要設(shè)備有較大變化時(shí)；c).停產(chǎn)6個(gè)月以上，恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d).出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次型式檢驗(yàn)有較大差異時(shí)；e).當(dāng)用戶(hù)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有較大異議時(shí)。7.3.2.3判定方法對(duì)抽取的樣品按型式檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)結(jié)果中有任何一項(xiàng)指標(biāo)不合格時(shí)，應(yīng)重新取樣進(jìn)行復(fù)檢，但衛(wèi)生指標(biāo)如有一項(xiàng)不合格時(shí)，即判為不合格產(chǎn)品，不得復(fù)檢。復(fù)檢的取樣范圍或樣品數(shù)量是第一次取樣的兩倍。復(fù)檢結(jié)果仍有指標(biāo)不合格，則判為不合格產(chǎn)品。8標(biāo)志、標(biāo)簽8.1標(biāo)志產(chǎn)品的外包裝應(yīng)有產(chǎn)品名稱(chēng)、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、注冊(cè)商標(biāo)、生產(chǎn)許可證號(hào)、產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)、凈重、防潮防曬標(biāo)志，同時(shí)還應(yīng)注明“飼料添加劑”字樣，并采用鮮明的飼料標(biāo)簽，符合GB/T 191-2000規(guī)定。8.2標(biāo)簽按GB 10648執(zhí)行。9包裝、運(yùn)輸、貯存9.1包裝產(chǎn)品的包裝需具備：密封、防水、避光、一定的強(qiáng)度要求和一定的包裝規(guī)格等。9.2運(yùn)輸產(chǎn)品含有生物活性物質(zhì)，光線(xiàn)、溫度、濕度易引起失活。運(yùn)輸工具必須清潔、干燥，有防雨防曬設(shè)施，搬運(yùn)裝卸小心較放。不得與有毒有害及其它污染物品混裝混運(yùn)。9.3貯存產(chǎn)品需于陰涼、干燥、避光處貯存。貯存?zhèn)}庫(kù)需保持清潔、陰涼、干燥、通風(fēng)，防受熱、受潮。不得與有毒有害及其它污染物品混貯。9.4保質(zhì)期產(chǎn)品原包裝需注明保質(zhì)期。在本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定條件下，保質(zhì)期為6個(gè)月。附錄A（規(guī)范性附錄）酸性蛋白酶活力的測(cè)定方法A.1原理蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過(guò)在680nm測(cè)定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計(jì)算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。A.2酶活單位定義在（400.2）、pH2.5條件下，在1min內(nèi)水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克或1微摩爾的酪氨酸的酶量，為1個(gè)酶活單位。A.3試劑和溶液 除非另有規(guī)定外，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。A.3.11 mol/L及0.1 mol/L鹽酸 (HCl)溶液取濃鹽酸85ml，加水稀釋并定容至1000 ml，即為1mol/L鹽酸溶液；取100ml 1mol/L鹽酸溶液，定容至1000 ml，即為0.1 mol/L鹽酸溶液。A.3.21mg/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液精確稱(chēng)取預(yù)先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20ml 左右1mol/L鹽酸l溶解后，再用蒸餾水定容至100ml，即為1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.3.3L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液吸取1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 ml用0.1 mol/L鹽酸定容至100 ml,即得到100 g/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取100g/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液 0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0 ml于10ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成每ml分別含L-酪氨酸0g、10g、20g、30g、40g、50g、60 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。A.3.40.4 mol/L 碳酸鈉（Na2CO3）溶液稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。A.3.5福林（Folin）試劑于2000ml磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)25g、蒸餾水700ml、85%磷酸50ml、濃鹽酸100ml。小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風(fēng)廚中加入硫酸鋰（ Li2SO4）50g，加蒸餾水50ml和數(shù)滴濃（99%）溴水，再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過(guò)量的溴），冷卻后加蒸餾水定容至1000ml?；靹?、過(guò)濾。試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)。使用時(shí)，以1份原Folin試劑與2份蒸餾水混勻，制成稀Folin試劑。A.3.6乳酸緩沖液(pH=2.5)甲液：稱(chēng)取80%90%乳酸10.6 g，加水稀釋并定容至1000ml。乙液：稱(chēng)取70%乳酸鈉16 g，加水稀釋并定容至1000ml。使用液：取甲液2份，加乙液1份，再準(zhǔn)確稀釋1倍。用pH計(jì)校正pH至2.5。A.3.71.0%酪素溶液稱(chēng)取酪素1.0000g，先用少量（3ml-4ml）濃乳酸濕潤(rùn)后，再加入乳酸緩沖液約80ml,在沸水浴中邊加熱邊攪拌直至完全溶解。冷卻后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用相應(yīng)緩沖液定容至刻度。此溶液在4冰箱貯存，有效期為3天。A.3.80.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀試劑)稱(chēng)取三氯乙酸65.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。A.4儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：A.4.1恒溫水浴鍋(400.2)。A.4.2分光光度計(jì)A.4.3酸度計(jì)精度0.01pH 。A.4.4分析天平感量0.1mg。A.4.5秒表或定時(shí)鐘。A.5測(cè)定步驟A.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制按表A.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液、0.4mol/L碳酸鈉溶液和稀Folin試劑于各管中（每管號(hào)平行作3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于40水浴，反應(yīng)20min，取出，迅速冷卻至室溫，用10mm比色杯，以空白管（0號(hào)管）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)680nm處測(cè)吸光度。以酪氨酸量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得線(xiàn)性回歸方程。當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸量（g）即為比色常數(shù)K值。線(xiàn)性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的Folin試劑制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 表A.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸使用溶液0.4mol/L碳酸鈉溶液(ml)稀Folin試劑(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）001.05.01.01101.05.01.02201.05.01.03301.05.01.04401.05.01.05501.05.0 1.06601.05.01.0A.5.2樣品的測(cè)定A.5.2.1待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱(chēng)取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。A.5.2.2測(cè)定程序取三支15150mm試管（一支空白管，二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液1.0ml 。將三支試管放入（400.2）水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%酪素溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入1.0ml 1%酪素溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向三支試管中加入2ml TCL（沉淀試劑），于空白管中加入1.0ml1%酪氨酸溶液，搖勻。將三支試管繼續(xù)置（400.2）水浴中放置10min，取出，迅速冷卻至室溫。三支試管中反應(yīng)液用濾紙（Whatman1號(hào)濾紙或新華1號(hào)濾紙）過(guò)濾。另取三支18180mm的試管（一支空白，二支樣品管）分別吸取上述相應(yīng)的濾出液1.0ml，0.4mol/L碳酸鈉溶液5.0ml，稀Foiln試劑1.0ml，搖勻，置（400.2）水浴中放置20min，取出，迅速冷卻至室溫。以空白管（對(duì)照）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)680nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或用線(xiàn)性回歸方程求出生成的酪氨酸的含量。A.6酶活力計(jì)算按照下式(A.1)計(jì)算樣品蛋白酶活力： AKV4NX1 (A.1) 1W10 式中：X1蛋白酶活力，u/g；A樣品與空白的的吸光度差K比色常數(shù)；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；4酶反應(yīng)體系總體積（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；1參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g/ml）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。 A.7精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄B（規(guī)范性附錄）半纖維素酶活力的測(cè)定方法B.1原理半纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，催化木聚糖水解生成二糖、木糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以木糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在540nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出木聚糖酶的酶活力。以此代表木聚糖酶的總酶活力。B.2酶活單位定義見(jiàn)3.3.2。B.3試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。B.3.11%（W/V）木聚糖底物 精確稱(chēng)取燕麥木聚糖(xylan from Oat spelts, 美國(guó)Sigma公司)1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4冰箱貯存，有效期為3天。B.3.2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱(chēng)取檸檬酸21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 緩沖溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（5.0 0.05）,備用。B.3.33,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。B.3.41%(W/V)木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱(chēng)取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的木糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。B.3.5木糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含木糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。B.4儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：B.4.1恒溫水浴鍋(400.2) 。B.4.2分光光度計(jì)B.4.3酸度計(jì)精度0.01pH 。B.4.4分析天平感量0.1mg。B.4.5秒表或定時(shí)鐘。B.5測(cè)定步驟B.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作按表B.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)木糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（0號(hào)管）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以木糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得線(xiàn)性回歸方程。線(xiàn)性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表B.1木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)木糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0B.5.2樣品的測(cè)定B.5.2.1待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱(chēng)取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。B.5.2.2操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%木聚糖溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或用線(xiàn)性回歸方程求出還原糖的含量。B.6酶活力計(jì)算按照下式（B.1）計(jì)算樣品的木聚糖酶的活力：AVNX1 (B.1) 0.5W10 式中：X1木聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。B.7精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄C（規(guī)范性附錄）-葡聚糖酶活力的測(cè)定方法C.1原理葡聚糖酶在一定的溫度和pH條件下，催化葡聚糖水解生成分子量較小的低聚糖、葡萄糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表葡聚糖酶的酶活力。C.2酶活單位定義見(jiàn)3.3.6。C.3試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。C.3.11%（W/V）葡聚糖底物精確稱(chēng)取葡聚糖(-glucan,from barley,Sigma 公司產(chǎn))1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。C.3.2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱(chēng)取檸檬酸21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 緩沖溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（5.0 0.05）,備用。C.3.33,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。C.3.41%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱(chēng)取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。C.3.5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。C.4儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：C.4.1恒溫水浴鍋(400.2) oC。C.4.2分光光度計(jì)C.4.3酸度計(jì)精度0.01pH 。C.4.4分析天平感量0.1mg。C.4.5秒表或定時(shí)鐘。C.5測(cè)定步驟C.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作按表C.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得線(xiàn)性回歸方程。線(xiàn)性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表C.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0C.5.2樣品的測(cè)定C.5.2.1待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱(chēng)取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。C.5.2.2操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%葡聚糖溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或用線(xiàn)性回歸方程求出還原糖的含量。C.6酶活力計(jì)算按照下式（C.1）計(jì)算樣品的葡聚糖酶的活力：AVNX1 (C.1) 0.5W10 式中：X1葡聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。C.7精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄D（規(guī)范性附錄）纖維素（CMC）酶活力的測(cè)定方法D.1原理纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，將纖維素底物（CMC，羧甲基纖維素鈉）水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出CMC酶的活力。D.2酶活單位定義見(jiàn)3.3.4。D.3試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。D.3.1羧甲基纖維素鈉（CMCNa）中國(guó)醫(yī)藥公司上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)，分析純，在25，2%水溶液粘度300800厘泊爾。D.3.2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱(chēng)取檸檬酸21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。.緩沖溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（4.8 0.05）,備用。D.3.31%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液稱(chēng)取1g羧甲基纖維素鈉，精確至1mg，緩緩加入pH為4.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液80ml，水浴加熱至全部溶解。冷卻后用2MHCL或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到（4.8 0.05），攪拌均勻，定容至100ml，再用二層紗布過(guò)濾。此溶液在4C冰箱貯存，有效期為3天。D.3.43,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。D.3.51%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱(chēng)取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。D.3.6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。D.4儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：D.4.1恒溫水浴鍋(500.2) 。D.3.2 分光光度計(jì)D.4.2酸度計(jì)精度0.01pH 。D.4.3分析天平感量0.1mg。D.4.4秒表或定時(shí)鐘。D.5測(cè)定步驟D.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作按表D.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得線(xiàn)性回歸方程。線(xiàn)性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表D.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0D.5.2樣品的測(cè)定D.5.2.1待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱(chēng)取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置50水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。D.5.2.2操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入1.5ml1%羧甲基纖維素鈉溶液，向空白管中加入3mlDNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入1.5ml1%羧甲基纖維素鈉溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中的水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或用線(xiàn)性回歸方程求出還原糖的含量。D.6酶活力計(jì)算按照下式（D.1）計(jì)算樣品的纖維素CMC酶的活力：AVNX1 (D.1) 0.5W10 式中：X1纖維素CMC酶活力，U/g；A根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。D.7精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄E糖化酶活力的試驗(yàn)方法E .1 原理糖化酶催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原末端開(kāi)始，分解1，4葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過(guò)量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算出酶活力。E .2 定義見(jiàn)3.3.5。 E .3儀器和設(shè)備a）恒溫水?。?00.2）。b）秒表。C）比色管50ml。D）移液管、滴定管等。E .4 試劑和溶液E .41 乙酸乙酸鈉緩沖液（pH4.5） 稱(chēng)取乙酸鈉（CH3COONa.3H2O）6.7g溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）2.6ml，用水定容至1000ml，配好后用pH計(jì)校正。E.42 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c（Na2S2O3）0.05mol/La）配制：稱(chēng)取硫代硫酸鈉（Na2S2O3。5H2O）12.4g和碳酸鈉0.1g溶于煮沸后冷卻的蒸餾水中，定容至1000ml，貯于棕色瓶中密閉保存，配制后放置1星期標(biāo)定使用。b） 標(biāo)定：稱(chēng)取預(yù)先在100105烘過(guò)2h的分析純碘酸鉀（KIO3）3.567g，溶于1000ml蒸餾水中，即成0.1mol/L碘酸鉀溶液。然后吸取10ml于150ml三角瓶中，加0.5g碘化鉀（KI），溶解后加1 mol/L H2SO4 2ml，用待標(biāo)定的0.05mol/L Na2S2O3溶液滴定至淡黃色時(shí)，加1淀粉指示劑23滴，繼續(xù)滴定至無(wú)色為終點(diǎn)。 碘酸鉀溶液摩爾數(shù)10 Na2S2O3溶液濃度（mol/L） 消耗 Na2S2O3的ml數(shù)E .43 碘溶液c（1/2I2）0.1mol/La）配制：稱(chēng)取碘化鉀（KI）36g溶解在100ml蒸餾水中，再加入碘（I2）12.691g溶解稀釋至1000ml，貯于棕色瓶。 b）標(biāo)定：用已標(biāo)定的0.05mol/L Na2S3O3溶液來(lái)標(biāo)定碘溶液。 吸取10ml待標(biāo)定的碘液放入250ml碘量瓶中，以0.05mol/L Na2S3O3溶液滴定至淡黃色時(shí)，加入1淀粉指示劑23滴，繼續(xù)滴定至無(wú)色為終點(diǎn)。 碘溶液濃度（mol/L） 0.05消耗Na2S3O3的ml數(shù) 10E44 氫氧化鈉溶液c（NaOH）0.1mol/L 稱(chēng)取4gNaOH溶解定容至1000ml。E45 20氫氧化鈉溶液 稱(chēng)取20gNaOHa溶解定容至100ml。E46 硫酸溶液c（1/H2SO4）2mol/L 量取濃硫酸（相對(duì)密度為1.84）5.6ml，緩緩注入80ml水中，冷卻后定容至100ml。E47 1淀粉指標(biāo)劑 將2淀粉溶液稀釋1倍。E48 20g/L可溶性淀粉溶液 稱(chēng)取絕干可溶性淀粉2g，然后用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入已沸的蒸餾水中，加熱煮沸至透明，冷卻后定容至100ml，此溶液需當(dāng)天配制。 注：采用浙江菱湖食品化工聯(lián)合公司生產(chǎn)的專(zhuān)供酶制劑行業(yè)用的可溶性淀粉。E .5 試驗(yàn)方法E51 待測(cè)酶液制備 稱(chēng)取定量酶粉(見(jiàn)表1)精確至0.0009g，先用少量的緩沖溶液(4.1)溶解，用玻璃棒搗研，將上清液小心傾人容量瓶中，沉渣部分再加少量緩沖液，如此搗研34次，最后全部移人容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻，通過(guò)4層紗布過(guò)濾，濾液供測(cè)定用。 表1 酶活力稀釋倍數(shù)表酶 活 力稀 釋 倍 數(shù)稱(chēng) 量定 容（ml）50 0003331.5050080 0005002.001 000100 0005002.001 000E52 測(cè)定a) 于甲、乙兩支50ml具塞比色管中，分別加入可溶性淀粉溶液25ml及緩沖液5ml，搖勻后于40恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）加入酶樣2ml，立即搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立即各加20NaOH溶液0.2ml搖勻，將兩管取出迅速冷卻，并于乙管中（空白）中補(bǔ)加待測(cè)酶樣2.00ml。 b) 吸取上述反應(yīng)液與空白液5.0ml，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘溶液10.0ml，再加0.1molL NaOH溶液15.00m1，搖勻，密塞，于暗處反應(yīng)15min，取出，加2molL H2SO4 2.0ml，立即用Na2S203標(biāo)準(zhǔn)液滴定，直至藍(lán)色剛好消失為其終點(diǎn)。E53 計(jì)算 X = (V0一V) c90.0532251/2n2579.9(V0一V) cn式中 : X樣品的酶活力（Ug） Vo空白消耗Na2S203標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（m1） V樣品消耗Na2S203標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml） C - Na2S203標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（molL） 90.05與1.00ml Na2S203標(biāo)準(zhǔn)溶液c（1/2 Na2S203） 1.000molL 相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜钠咸烟堑馁|(zhì)量 32.2反應(yīng)液的總體積（ml） 5 吸取反應(yīng)液的體積（ml） 1/2吸取酶液2.00ml，以1.00ml計(jì) n 樣品稀釋倍數(shù) 2反應(yīng)30min換算成1h的酶活力系數(shù)附錄F（資料性附錄）果膠酶活性：F.1原理果膠酶能將聚半乳糖醛酸降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中果膠酶的活力成正比。因此，通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中果膠酶的活力。F.2酶活定義見(jiàn)3.3.3F.3.試劑與溶液除特殊說(shuō)明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。F.3.1葡糖糖溶液，c（C6H12O6）為10.0mg/ml：稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。F.3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）為0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。F.3.3 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）為0.1mol/L： 稱(chēng)取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。F.3.4 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）為200g/L：