化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用.ppt

化學發(fā)光免疫技術 第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定 CLEIA chemiluminescenceenzymeimmunoasssay 第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術 CLIA chemiluminescenceimmunoassay 第四章電化學發(fā)光免疫測定技術 ECLI electrochemiluminescenceimmunoassay 化學發(fā)光免疫技術 集靈敏的化學發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術 概念 特點 特異性高 敏感性高 分離簡便 快速 試劑無毒 安全穩(wěn)定 可自動化 化學發(fā)光免疫技術的類型 按發(fā)光劑不同分為1 發(fā)光酶免疫測定 CLEIA chemiluminescenceenzymeimmunoasssay2 化學發(fā)光免疫測定技術 CLIA chemiluminescenceimmunoassay3 電化學發(fā)光免疫測定技術 ECLI electrochemiluminescenceimmunoassay按分離方法不同分1 微粒子化學發(fā)光免疫測定2 磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定 第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑 一 發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時 釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射 1 光照發(fā)光 發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài) 當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光 2 生物發(fā)光 反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能 生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素 后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出 3 化學發(fā)光 在常溫下由化學反應產(chǎn)生的光的發(fā)射 化學發(fā)光是一個多步驟的過程 熒光素酶ATP O2 Mg2 氧化螢火蟲熒光素 螢火蟲熒光素 生物發(fā)光 返回 光 AMP O2 CO2 化學發(fā)光 機制 某些化合物可以利用化學反應產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài) 當此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時 以發(fā)射光子的形式釋放能量 即發(fā)光 二 化學發(fā)光劑 化學發(fā)光劑或發(fā)光底物 在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物 發(fā)光劑分為熒光素 生物發(fā)光劑 化學發(fā)光劑 能參與化學發(fā)光反應 與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑 偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力 應不改變或極少改變被標記物的理化特性 特別是免疫活性 化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件 返回 1 酶促反應的發(fā)光底物 是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物 CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾 對 羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD 4 MUP 熒光底物 特點 可作標記物 也可作過氧化物酶的底物 1 1魯米諾 H2O2 OH HRP N2 H2O 光 對 羥基苯乙酸 HPA HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體 熒光物質(zhì) 在350nm激發(fā)光作用下 發(fā)出450nm波長的熒光 可用熒光光度計測量 1 2HPA H2O2HRP 熒光 氧化二聚體 AMPPD AMPPD在堿性條件下 被AP酶解生成相當穩(wěn)定的AMP D陰離子 其有2 30min的分解半衰期 發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光 在15min時其強度達到高峰 15 60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定 光 AP OH HPO42 1 3AMPPD 4 MUP 4 MUP被AP催化生成4 甲基傘形酮 在360nm的激發(fā)光的作用下 發(fā)出448nm的熒光 可用熒光光度計進行測量 熒光 AP 1 44 MUP 4 MU 360nm激發(fā)光 H3PO4 2 直接化學發(fā)光劑 特點 不需催化劑 只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì) 反應迅速 背景低 信比高 發(fā)光量與AE濃度呈線性關系 常用試劑 吖啶酯 acridinium AE CO2 光 3 電化學發(fā)光劑 是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì) 特點 反應在電極進行 電子供體為 三丙胺 TPA 化學發(fā)光劑 三聯(lián)毗啶釕 返回 三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖 第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定 CLEIA 一 原理屬于酶免疫測定的一種 只是最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑 通過發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定 二 技術類型根據(jù)酶促反應底物不同可分為 1 熒光酶免疫測定技術2 化學發(fā)光酶免疫測定技術 根據(jù)免疫學反應模式分1 雙抗體夾心法和雙抗原夾心法3 固相抗原競爭法 熒光酶免疫測定技術反應原理圖 洗滌棄上清 是利用理想的酶熒光底物 生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強的熒光強度 通過測定熒光強度進行定量 化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖 洗滌棄上清 是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光 通過光強度的測定而直接進行定量 電化學發(fā)光原理圖 這一過程可在電極表面周而復始地進行產(chǎn)生許多光子 使光信號增強 返回 激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定 基態(tài) 電極 1 抗原抗體結(jié)合反應將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應杯中 經(jīng)溫育一定時間后 再加入AP標記抗體 溫育 形成固相包被抗體 抗原 酶標抗體復合物 技術要點 2 分離技術將復合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上 用緩沖液洗滌 沒結(jié)合的抗原被洗脫 酶標抗體 抗原 膠乳微?？贵w復合物則被保留在纖維膜上 3 酶促發(fā)光反應加入4 MUP 酶標抗體上AP將4 MUP分解 形成4 MU 它在360nm激發(fā)光的照射下 發(fā)出448nm的熒光 經(jīng)熒光儀記錄 放大 根據(jù)標準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量 1 磁顆粒分離法 用抗原或抗體包被磁顆粒 與標本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后 最終通過磁場將結(jié)合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術 分離技術 2 微粒子捕獲法 所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體 然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離 3 包被珠分離法 用聚苯乙稀等材料制成小珠 在小珠上包被抗原或抗體 經(jīng)抗原抗體反應后 將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離 第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術 CLIA 一 原理用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體 與待測標本中相應Ab或Ag 磁顆粒性的Ag或Ab反應 通過磁場把結(jié)合狀態(tài) 沉淀部分 和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來 然后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應 通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測 二 技術類型1 分離方法常用磁顆粒分離技術2 免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術3 不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶 1 抗原抗體結(jié)合反應將包被McAb的磁顆粒和待測標本加入到反應管中 標本中待測Ag與磁珠上Ab結(jié)合 再加上AE標記Ab 經(jīng)過溫育 形成磁珠Ab Ag AE標記Ab復合物 技術要點 2 分離技術在電磁場中進行2 3次洗滌后 很快地將未結(jié)合的多余Ag和標記Ab洗去 3 化學發(fā)光反應經(jīng)洗滌的磁珠中 加入H2O2和pH糾正液NaOH 這時AE不需要催化劑即分解并發(fā)光 由集光器接收 經(jīng)光電倍增管放大 記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能 其積分與被測物含量成正比 按標準曲線 儀器可計算出被測物含量 1 AE其低背景噪音 化學反應簡單 快速而無催化劑 方法評價 2 AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量 從而增加靈敏度 靈敏度可達10 15g ml 3 AE標記試劑有效期長 可達一年 4 固相分離劑為極為幼細的磁粉 除增大包被面積 加快反應外 亦同時使清洗及分離更簡易 快捷 第四節(jié)電化學發(fā)光免疫測定技術 ECLI 一 原理是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應 實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程 ECL是電啟動發(fā)光反應 而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應 用化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 Ru bpy 3 2 標記Ab 通過Ag Ab反應和磁珠分離技術 根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量 定性 二 技術類型1 分離方法常用磁顆粒分離技術2 免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術3 相應標記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶 1 三聯(lián)吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本同時加入一個反應杯中孵育反應 技術要點 2 將鏈霉親和素 SA 包被磁珠加入反應杯中 再次孵育 使生物素 B 通過與親和素 A 的結(jié)合 將磁珠 Ab連接為一體 形成雙Ab夾心法 3 蠕動泵將形成的 Ru bpy 3 2 Ab Ag Ab B SA 磁珠復合體吸入流動測量室 磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面 同時 游離的Ab也被吸出測量室 4 蠕動泵加入TPA 電極加電壓 啟動ECL反應過程 該過程在電極表面周而復始地進行 產(chǎn)生許多光子 光電倍增管檢測光強度 其與 Ru bpy 3 2 的濃度呈線性關系 故可測出待測Ag的含量 原理圖 返回 抗體包被樣本Ru byp 2 TPA緩沖的磁珠抗原標記抗體液洗滌 3 方法評價 標記物的再