茚三酮比色法測(cè)定賴氨酸含量.doc

茚三酮比色法測(cè)定賴氨酸含量一. 目的了解賴氨酸總含量的測(cè)定方法。掌握用比色法測(cè)定谷物類樣品中賴氨酸含量。二. 原理 蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基上具有一個(gè)游離的e-NH2，它與茚三酮起顏色反應(yīng)呈藍(lán)紫色，在波長570nm處其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸殘基的含量成線性關(guān)系。 亮氨酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目相同，它僅有的一個(gè)氨基（a-NH2）相當(dāng)于蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量。但計(jì)算濃度時(shí)必須乘上兩種氨基酸的分子量之比（賴氨酸與亮氨酸分子量之比為1.11:1）。式中 W：樣品質(zhì)量 C ：樣品中游離氨基酸的量，各種作物種子中游離氨基酸的含量大約是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麥：0.05% X ：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的賴氨酸的質(zhì)量三. 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1. 材料 玉米粉 2. 儀器 分光光度計(jì) 分析天平 恒溫水浴 3. 器材 刻度試管： 25mL11 移 液 管： 1mL1 2mL2 20mL1 燒 杯： 250mL2 50mL1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 濾 紙： f11cm 研缽、漏斗、洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各1四. 試劑的配制 1. 檸檬酸緩沖液（0.2mol/L，pH5.6）(參見附錄二) 2. 茚三酮試劑 稱3g茚三酮溶于100mL 95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化錫，攪拌溶解后加入100mL檸檬酸緩沖液中，攪勻備用。 3. 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（50mg/mL） 準(zhǔn)確稱取5mg亮氨酸，用蒸餾水稀釋定容到100mL，則得濃度為50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。五. 操作步驟 1. 樣品液的制備 (1) 取材：稱取烘干、粉碎（過80目篩）的玉米粉0.3g（油料種子須經(jīng)脫脂處理）。 (2) 提?。簩⒎Q取的樣品放入試管，準(zhǔn)確加入20mL蒸餾水，搖勻。讀取樣品懸液的總體積 mL，置于80恒溫水浴中提取20min。（可間歇搖動(dòng)） (3) 定容：冷卻后，用蒸餾水將試管中懸液定容至（2）中懸液總體積刻度 mL,，即最終樣品液總定容體積仍為20mL，搖勻。 (4) 過濾：將提取液用濾紙過濾，收集濾液作為待測(cè)樣(濾紙不能用蒸餾水濕潤)。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品測(cè)定 取9支刻度試管，按下表所示順序操作。六. 結(jié)果處理 1. 由06號(hào)管的數(shù)據(jù)，以亮氨酸含量(mg)為橫坐標(biāo)，A570為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2. 求樣品管A570的平均值570； 3. 由530從