DNA-RNA提取.doc

DNA的提取純化編輯本段回目錄一、細(xì)菌培養(yǎng)物的生長從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR322類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以完全抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素(g/ml)已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。二、細(xì)菌的收獲和裂解細(xì)菌的收獲可通過離心來進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于個因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。1、大質(zhì)粒(大于15kb) 容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。2、可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌菌株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。4、當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒芡耆珳缁顑?nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：氯仿進(jìn)行抽提)可以避免此問題。5、目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。 大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費(fèi)事，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA 的量以與不加氯霉素時從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。三、質(zhì)粒DNA的純化常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和( 每個堿基對大約結(jié)合個溴化乙錠分子) （antor 和chimmel,1980）。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中最好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級沉淀法，最近已得到改進(jìn)（R.Treisman,個人通訊）并達(dá)到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級沉淀法與氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法有一點(diǎn)不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開，因此， 純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒（大于15kb）及用于生物物理學(xué)測定的閉環(huán)質(zhì)粒時、平衡離心仍是首選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體。可幸，對于更常規(guī)的操作，則可全然免卻進(jìn)一步提純的問題。目前所用的質(zhì)粒大多數(shù)復(fù)制量大，小量制備質(zhì)粒即可得到足量的DNA完成以下種種工作； 限制酶圖的繪制、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、特定DNA片段的分離、常規(guī)亞克隆及放射性標(biāo)記探針的制備。四、質(zhì)粒DNA的小量制備一）細(xì)菌的收獲和裂解、收獲）將2ml含相應(yīng)抗生素的加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。2、煮沸裂解該法根據(jù)olmex和Quigley(1985)的方法改進(jìn)而成。1）將細(xì)菌沉淀收獲細(xì)菌和步驟）所得重懸于350lSTET中。STET0.1mol/L NaC10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-1002）加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振蕩秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。3）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。4）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。5）用無菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。6）在上清中加入40l 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420l異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置分鐘。7）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心分種，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。9）加1ml乙醇，于4以12 000g離心分鐘。10）按步驟）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（）分鐘。11）用50l含無DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20。i當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒時，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能完全滅活內(nèi)切核酸酶，以后在g2+存在下溫育（中用限制酶時）質(zhì)?？杀唤到狻?在上述方案的步驟）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問題。ii此法制備的高考貝數(shù)質(zhì)粒（如f3哉p），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌增減物g。iii如果要通過限酶切割反應(yīng)來分析，可取l溶液加到另一個含l水的微量離心管內(nèi)，加l 10x限制酶緩沖液和單位所需限制酶，在適宜溫度溫育小時。將剩余的貯存于20。通過凝膠電泳分析經(jīng)限制酸消化的片段。如果小量制備的不被限制酶切開，很有可能在收獲細(xì)菌的步驟）或上述步驟）未能很好地去除所有液體。這種情況下，可用酚：氯仿抽提終產(chǎn)物，然后用乙醇重新沉淀，通常，用510倍過量的酶（特別是并不昂貴的酶）在100-200l 體積中進(jìn)行消化，可以克服限制酶切割反應(yīng)遇到切割反應(yīng)遇到的困難。消化后， 加0. 1 體積3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和倍體積乙醇沉淀。（二）質(zhì)粒小量制備的問題與對策裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：1）有些工作者首次進(jìn)行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化。2）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。五、質(zhì)粒DNA的純化（一）聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒這里介紹的方法（R.Tresman,個人通訊）已卓有成效地用于純化堿裂解法制備的質(zhì)粒。1）將核酸溶液上頁步驟）所得轉(zhuǎn)入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用orvall SS34 轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于4下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子。2）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。3）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。4）用500l含無酶的胰酶(20g/ml ）的（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。5）加500l含13（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于以12000g離心分鐘，以回收質(zhì)粒。6）吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。7）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100l 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于以12 000g離心分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒。8）吸去上清，加200l處于以12 000g離心分鐘。9）吸去上清，敞開管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。10）用500l（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋用（pH8.0) 后測量260，計算質(zhì)粒的濃度（26050g質(zhì)粒/ml）， 然后將貯于20。（二）氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)1、連續(xù)梯度1）測量溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。2）每10ml溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表成）與氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度應(yīng)為大約g/ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子）。于室溫保存。3）于室溫用Sorvall SS34頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以8000轉(zhuǎn)/分離心分鐘， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。4）用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到適用于Beckman Ti65重直轉(zhuǎn)頭或i50、Ti65或Ti70 角轉(zhuǎn)頭（或與它們相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）的離心管（Beckman Quick-seal或與之相當(dāng)?shù)碾x心管）中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。5）于20對所得的密度梯度以45 000轉(zhuǎn)/分離心16小時（VTi65 轉(zhuǎn)頭）、 以45000轉(zhuǎn)/分離心48小時（Ti50轉(zhuǎn)頭）、以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時（Ti65轉(zhuǎn)頭）或者以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時（Ti70.1轉(zhuǎn)頭）。在普通光照下，在梯中心可見兩條區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細(xì)菌（染色體）和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠復(fù)合物，位于sCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。BeckmanQuick-Seal離心管中的CsCl溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒而不至超負(fù)荷。如有更大量的質(zhì)粒存在，將擴(kuò)展為一條寬帶，并與染色體相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達(dá)到極高水平時才會出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為個梯度即可解決。如出現(xiàn)負(fù)荷，可收集整個區(qū)高水平時才會出現(xiàn)，只要產(chǎn)將該質(zhì)粒提取物分為個梯度即可解決。如出現(xiàn)超負(fù)荷，可收集整個區(qū)帶，用CsCl溶液（1.58g/ml）將體積調(diào)到15ml，在兩個離心管中再度離心，使達(dá)到平衡。6）收集帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進(jìn)入，為盡量減少污染的機(jī)會，首先用號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將號皮下注身針頭（其斜面向上）斤插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀收集到一次性使用的管內(nèi)，用造型粘土塊封信皮下注射針頭的未端并將第根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第根皮下注射針頭（18號），將下部的質(zhì)粒區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。2、不連續(xù)梯度該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中，這樣可以加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到小時。1）將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（1.47g/ml）。2）將8ml氯化銫溶液加到Beckman Quick-Seal 離心管（或與其相當(dāng)?shù)墓埽┲校瑪R置一旁等步聚）使用。3）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質(zhì)粒溶液的體積精確地調(diào)到3ml。4）在質(zhì)粒溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30以促進(jìn)鹽溶解， 小心地混勻溶液直至鹽溶解。5）稱量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達(dá)13.2g，用天平稱量時應(yīng)注意去除管的重量。6）加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時溶液瓣體積應(yīng)大約為7.5ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)于室溫貯存在避光容器中（如完全用錫箔包裹的瓶子）。小心：溴化乙錠是一咱強(qiáng)誘變劑，并在中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。7）于室溫用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)法）以8000轉(zhuǎn)/ 分離心分鐘，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。8）將22.86cm的巴期德吸管放入裝有步驟）制備的CsCl的離心管中， 吸頭應(yīng)接觸管底。用吸管小心地將步驟）所制備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內(nèi)，使樣本層位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情步驟）中制備的CsCl溶液（=1.47g/ml)添滿離心管，封口。9）將封口的管，（與相應(yīng)的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭中），于20以60 000轉(zhuǎn)/分將密度梯度離心小時。10）回收閉環(huán)質(zhì)粒區(qū)帶（三）從經(jīng)過純化的質(zhì)粒中去除溴化乙錠下面方法對于從經(jīng)過氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心純化的中去除溴化乙錠都同樣奏效。方法：有機(jī)溶劑抽提小心：溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。用后這些溶液應(yīng)用后述的方法進(jìn)行凈化處理。1）將溶液放入玻璃或塑料管中，加等體積的水飽和丁醇或異戊醇。2）振蕩混合兩相。3）用臺式離心機(jī)于室溫以1500轉(zhuǎn)/分離心分鐘。4）用巴期德吸管將下層水相移至一干凈的玻璃或塑料管內(nèi)。5）反復(fù)抽提步驟）次直到粉紅色從水相和有機(jī)相中均消失。6）用以下任意一種方法從溶液中除CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)透析，對TE(pH8.0)透析24-48小時，并換液數(shù)次或者用倍體積水進(jìn)行稀釋并于用倍體積乙醇（即終體積相當(dāng)于原未稀釋體積的倍）沉淀15分鐘，再于以10 000g 離心15 分釧， 將沉淀的溶于約1ml TE(pH8.0)中。如將的乙醇溶液置于-20，CsCl會沉淀。7）測定終溶液的260值，計算的濃度， 將分成小份貯存于-20。如果終制備的含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提次，然后用乙醇沉淀。（四）溴化乙錠溶液的凈化處理小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時務(wù)必戴上手套，這些溶液經(jīng)使用應(yīng)按下面介紹的方法進(jìn)行凈化處理。1、溴化乙錠濃溶液（即濃度0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的凈化處理方法： 用少門氏菌微粒體測定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。1）加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。2）加入0.2體積新配制的次磷酸和0.12體各新配制的0.5mol/L 亞硝酸鈉，混勻。切記：檢測該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50溶液，具有腐蝕性，應(yīng)小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。3）于室溫溫育24小時后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。返回切記：檢測該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50溶液，具有腐蝕性，應(yīng)小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。3）于室溫溫育24小時后，加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些， 該溶液可予丟棄。(五)從質(zhì)粒制品中去除對于某些用途（例如用31進(jìn)生活化或用噬菌體多核苷酸激酥標(biāo)記質(zhì)粒的限制切片段的端），必須獲得無污染的制品。盡管在通過氯化銫化乙錠梯度平衡離心所制備的質(zhì)粒中，這樣的污染物的重量微不卟道，但對說來，其中的分子數(shù)卻可能相當(dāng)可觀，并可在限制酶消化反應(yīng)的全部端中占據(jù)砂容忽視的比例。通過下述方法，可以從質(zhì)粒制品中去除A 。1、通過Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B進(jìn)行層析1）制備質(zhì)粒。2）有等體積的經(jīng)TE(pH8.0)平衡后的酚抽提次。3）將至多1ml的水相鋪在經(jīng)TE(pH8.0)和0.1平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。4）將裝入層柱并在柱的上部連接上含0.1的TE(pH8.0)的貯液瓶，立即開始以0.5ml流出液為流進(jìn)行收集。5）當(dāng)收集到15份時，關(guān)閉柱底部，為明確質(zhì)粒的分布情況，可心眾每份收集物中取10g樣品，通過0.7瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠熒光（見附錄）進(jìn)行分析。6）將含質(zhì)粒的組成合并在一起，加倍體積的乙醇于沉淀10分鐘，然后于以大于10 000g離心15分鐘，以回收?；蚪MDNA的提取編輯本段回目錄基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達(dá)到提取的目的。在提取過程中,染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時, 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法超聲波法研磨法凍融法。2化學(xué)方式：異硫氰酸胍法堿裂解法3生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等試驗(yàn)步驟：1、貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心收集。2、細(xì)胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗(yàn)步驟2再重新作一邊。3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混勻。4、加入25ul蛋白酶K使終濃度達(dá)到100ug/ml混勻，50水浴3h5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm離心10min。棄上清。8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20預(yù)冷無水乙醇。-2020min。9、12000r/min室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。從植物組織提取基因組DNA 編輯本段回目錄一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。 二、設(shè)備 移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 三、試劑 1、提取緩沖液：100mmol/L TrisCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取緩沖液：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方見第一章。 5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步驟：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液, 60水浴預(yù)熱。 2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產(chǎn)量高), 不時搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。 9. 加入5l RNaseA(10g/l), 37 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。 10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2體積的冰乙醇,混勻,-20放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。 11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。 12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。 13. 取2l DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15l稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質(zhì)量。注意 5g樣品可保證獲得500g DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。（二）. 從李(蘋果)葉子提取基因組DNA 1. 取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。 2. 加入提取緩沖液10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液20ml, 混勻。65, 30-60min, 常搖動。 4. 同（一）中步驟3-13操作。 從動物組織提取基因組DNA編輯本段回目錄一、材料 哺乳動物新鮮組織。 二、設(shè)備 移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、水浴鍋。 三、試劑 1、分離緩沖液：10mmol/L TrisCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步驟:1. 切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。 3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。 4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保溫1-2小時, 直到組織完全解體。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。 6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。7. 取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。 8. 移去上層乙醚,保留下層水相。 9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。 10. 用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。 細(xì)菌基因組DNA的制備 編輯本段回目錄一、材料 細(xì)菌培養(yǎng)物。 二、設(shè)備 移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺式離心機(jī)，水浴鍋。 三、試劑 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 四、操作步驟：1. 100ml 細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。 2. 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。 5. 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。 6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。 7. 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8. 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以上一節(jié)的操作步驟處理。 基因組DNA的檢測編輯本段回目錄上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。1. DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質(zhì)量。 2. 取2-5l 在0.7% agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。 3. 取2g DNA, 用10單位(U)Hind酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。 如果DNA中所含雜質(zhì)多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理： （1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白質(zhì)和多糖。 （3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度離心, 去除雜質(zhì), 分離大片段DNA(可用作文庫構(gòu)建)。組織DNA的提取和純化編輯本段回目錄原理 本法用含EDTA的溶液洗滌細(xì)胞，SDS（十二烷基硫酸鈉）破碎、裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚并使細(xì)胞內(nèi)的DNA酶失活，用酚、氯仿變性蛋白質(zhì)并去除雜質(zhì)，最后用乙醇沉淀得到純化的DNA。試劑裂解緩沖液1、 苯酚-氯仿溶液2、 氯仿-異戊醇溶液3、 冰無水乙醇及70%乙醇4、 TE緩沖液5、 5mol/L NaCl操作處死小白鼠一只，取新鮮肝臟，用生理鹽水清洗去血水。1、 每克組織加10ml裂解液制成勻漿。2、 取2ml勻漿于離心管中，加等體積苯酚-氯仿溶液，加蓋，緩緩來回顛倒5min， 離心2500rpm10min。3、 取上層水相，加等體積氯仿-異戊醇溶液，加蓋，緩緩來回顛倒5min，離心 2500rpm10min。4、 取上層水相至玻璃管內(nèi)，加5mol/L NaCl至終濃度為0.3mol/L（2ml+100ul，3ml+150ul）。5、 加2.5倍體積的冰無水乙醇，加蓋，緩慢搖勻，見白色絮狀沉淀DNA出現(xiàn)。6、 用玻棒撈起DNA沉淀置于試管中，用1mLTE溶解。7、 定量 吸取DNA溶液100ul+2.9mlTE（30倍稀釋），在260nm和280nm下讀 取吸光度值，8、 計算 DNA濃度（ug/ml）=A260nm501/光徑稀釋倍數(shù)石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用編輯本段回目錄一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，直接進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990）對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。表 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟1切除多余石蠟，暴露組織2將組織切碎（最大徑0.5mm），稱重；3溶于TE9提取液（組織20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關(guān)外，可能的原因還有：組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當(dāng)組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA大小無絕對區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標(biāo)本所獲得的DNA分子量大?？赡芟瀴K中仍存在導(dǎo)致DNA降解的因素。組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。三、提高DNA提取質(zhì)量的方法1蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標(biāo)本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)乃啦糠智腥ズ笤儆?。盡可能地選用新近標(biāo)本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。2DNA提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進(jìn)行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA純化等問題上取得了進(jìn)展。DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%2%，蛋白酶K200500g/ml，最高可達(dá)1mg/ml；作用時間一般為24天，最長可達(dá)7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發(fā)現(xiàn)，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者對DNA提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（4mol/L）尿素和2-巰基乙醇。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得