構建shRNA干擾穩(wěn)定細胞系ppt課件.ppt

創(chuàng)造價值 追求卓越 BioChen出品 構建shRNA干擾穩(wěn)定細胞系 設計siRNA序列根據(jù)siRNA序列設計shRNA片段構建shRNA瞬時轉染檢測干擾效果構建穩(wěn)定細胞系 1 選擇設計siRNA 而不是shRNA 輸入基因的登錄號或者序列 使用默認參數(shù)或者按需修改參數(shù) 使用BLOCK iT RNAiDesigner設計siRNA序列 2 綜合Rank Tushcl規(guī)則 選擇3條左右進行實驗驗證 siRNA不是100 有效果的 使用BLOCK iT RNAiDesigner設計siRNA序列 3 pRNAT U6 1 Neoisdesignedformammaliantransfection ItcarriesaNeomycinresistancegeneastheselectablemarker whichcanbeusedforestablishingstablecellline TheGFPmarker coralGFP cGFP underCMVpromotercontrolcanbeusedtotrackthetransfectionefficiency ItusesU6promoterforsiRNAexpression 索取質(zhì)粒 請聯(lián)系 QQ 676743449 pRNAT U6 1 Neo質(zhì)粒 4 右圖是pSUPER質(zhì)粒的設計圖 與pRNAT U6 1 Neo區(qū)別不大 序列轉換工具 反向 互補 反向互補 shXRN1 S shXRN1 AS 59nt 送到DNA合成公司按照合成引物的方式合成 根據(jù)siRNA序列設計shRNA合成片段 5 1 將合成的兩條鏈稀釋成10uM 各取10ul 退火 95度5分鐘 緩慢降至室溫 可以用PCR儀做 2 用BamHI和HindIII將pRNAT U6 1 Neo質(zhì)粒切開 質(zhì)粒不需要很多 但務必切干凈 回收 3 連接 2ul載體 1ul酶 4ul5Xbuffer 13ul片段 轉化 4 挑單克隆 搖菌 提質(zhì)粒 酶切 BamHI HindIII 驗證 質(zhì)粒多切一點 如果切出60bp左右的帶是陽性克隆 5 送測序 質(zhì)粒構建 6 將shRNA干擾質(zhì)粒瞬時轉染 提取mRNA做半定量PCR 或者提取蛋白做western檢測干擾效果 如下圖 sh1和sh2有效果 sh3沒有效果 瞬時轉染檢測干擾效果 7 構建shRNA穩(wěn)定表達細胞系 將pRNAT U6 shRNA質(zhì)粒用BglII酶切線性化 必須的 可以增加整合效率 回收 轉染進10cm培養(yǎng)皿的細胞 轉染后48小時加G418篩選 不同細胞對G418敏感情況不一樣 之前需要做好濃度測試 Hela細胞對應的G418濃度 大概是500ug ml 1000ug ml 一開始細胞會大量死去 10cm皿傳6cm 6cm皿傳3 5cm皿 細胞太稀不利于生長 之后細胞會增長 3 5cm皿傳6cm皿 6cm皿傳10cm皿 當90 以上的細胞都有熒光之后 這個穩(wěn)定細胞系差不多就成功了 然后做一下實時定量PCR或者western檢測一下干擾效果 就可以用于更進一步實驗了