應(yīng)用紅外光譜研究生物大分子的結(jié)構(gòu).doc

應(yīng)用紅外光譜研究生物大分子的結(jié)構(gòu)謝孟峽 劉媛北京師范大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100875，一、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)主要有四級(jí)，其結(jié)構(gòu)層次示意圖見(jiàn)圖1。穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要作用力有五種，分別是鹽鍵、氫鍵、疏水作用、范德華力和二硫鍵。這些都是共價(jià)鍵相互作用，其中對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)，最重要的作用力是蛋白質(zhì)分子中的氫鍵。圖1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次示意圖其中：Q為四級(jí)結(jié)構(gòu)，T/為由結(jié)構(gòu)域組成的三級(jí)結(jié)構(gòu)或亞基，D/T為結(jié)構(gòu)域或三級(jí)結(jié)構(gòu)，sS為超二級(jí)結(jié)構(gòu)，S為二級(jí)結(jié)構(gòu)，A為組成一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸在所有已測(cè)定的蛋白質(zhì)中，都有廣泛的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式主要包括-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲四種。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)中將螺旋看成蛋白質(zhì)復(fù)雜構(gòu)像的基礎(chǔ)，折疊是蛋白質(zhì)中又一種普遍存在的規(guī)則構(gòu)像單元。無(wú)論是螺旋還是折疊都存在著許多氫鍵，致使規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)都具有相當(dāng)?shù)膭傂?，如果一段肽鏈中沒(méi)有氫鍵或其他相互作用，那么各個(gè)殘基之間就有更大的自由度，轉(zhuǎn)角就是典型的介于此兩種情況之間的一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，是一種部分規(guī)則的構(gòu)像（見(jiàn)圖2）。此外還有一些肽段相對(duì)于前面的三種二級(jí)結(jié)構(gòu)是無(wú)規(guī)則，它們有更大的任意性，可是這些肽段的構(gòu)像又不是完全任意的，因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)肽鏈中存在的這一類(lèi)型空間構(gòu)像幾乎是相同的，所以蛋白質(zhì)中無(wú)規(guī)卷曲也是具有其特定構(gòu)像的。螺旋平行和反平行折疊轉(zhuǎn)角圖2、蛋白質(zhì)典型二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征與氫鍵的形成方式緊密相關(guān)，無(wú)論-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角或其它構(gòu)象，都有其特定的氫鍵結(jié)構(gòu)，而這種氫鍵結(jié)構(gòu)的差異能夠在對(duì)于氫鍵敏感的紅外光譜中得到反映，主要表現(xiàn)為譜帶峰位及半峰寬的變化。這使我們有可能利用峰位不同的譜帶來(lái)識(shí)別不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其組成情況。圖3 人血清白蛋白（HSA）在重水中的紅外吸收譜在蛋白質(zhì)的紅外光譜中，無(wú)論是酰氨I帶還是酰氨III帶，都由代表了不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的譜峰重疊而成?？梢酝ㄟ^(guò)曲線擬合將重疊在一起的譜峰分開(kāi)。曲線擬合的一般步驟是，首先對(duì)得到的蛋白質(zhì)相應(yīng)的譜帶進(jìn)行基線校正，然后采用二階導(dǎo)數(shù)和傅立葉去卷積確定了子峰數(shù)目和各子峰位置，通過(guò)調(diào)整各子峰的高度及半峰寬得到滿意的曲線擬合譜圖，最后根據(jù)擬合譜峰的峰面積定量計(jì)算不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。對(duì)于各子峰的歸屬我們也已經(jīng)做了較多的研究【】。酰氨I帶中，-螺旋：1652 cm-1 (H2O); 1650 cm-1 (D2O); 1656 cm-1 , 1658 cm-1 ；非標(biāo)準(zhǔn)-螺旋（310Helix）：1660 cm-1；-折疊：1635 cm-1，1625 cm-1，1620 cm-1 ；反平行-折疊：1693 cm-1 (H2O); 1675 cm-1 (D2O); 但1675 cm-1 的強(qiáng)度只有低波數(shù)的1/10.-轉(zhuǎn)角： 1660 cm-1 1700 cm-1無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)：1657 cm-1 (H2O); 1643 cm-1 (D2O)。酰氨III帶中，-螺旋：13301290 cm-1；-折疊：12501220 cm-1；-轉(zhuǎn)角：12951265 cm-1；無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)：12701245 cm-1；【高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào) 2003】圖4 蛋白質(zhì)酰氨I帶合酰氨III帶擬合結(jié)果目前蛋白質(zhì)的兩個(gè)譜帶分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)都有一點(diǎn)的局限性，如酰氨I帶雖然譜峰歸屬比較成熟，但是受水汽干擾很?chē)?yán)重；而酰氨III帶雖然不受水汽干擾，而且不同二級(jí)結(jié)構(gòu)在這里的吸收更加特征，但是由于其信號(hào)較弱一直以來(lái)也沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。我們首先提出了將酰氨I帶和III帶結(jié)合起來(lái)定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量的方法，該方法可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，更加準(zhǔn)確的分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。二、藥物與蛋白質(zhì)相互作用的研究藥物在人體內(nèi)的分布是由蛋白質(zhì)控制的，它們由人血清白蛋白儲(chǔ)存、攜帶到達(dá)目標(biāo)組織。藥物與蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度可以用來(lái)對(duì)藥物進(jìn)行篩選。因此研究藥物與蛋白作用機(jī)理具有十分重要的意義，可以對(duì)藥物分子的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。多酚類(lèi)藥物主要包括脂肪多酚有機(jī)化合物、多酚苯乙烯酸系列化合物、多酚苯甲酸系列化合物、單寧酸和黃酮類(lèi)藥物。多酚有機(jī)酸包括脂肪酸和芳香酸，其中芳香酸有可大致分為苯乙烯酸系列和苯甲酸系列。目前研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的方法主要有熒光光譜、紫外光譜、平衡透析法以及紅外和拉曼光譜法等等。利用紅外光譜法可以分析蛋白與藥物作用前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。利用差譜技術(shù)觀察藥物與蛋白質(zhì)作用前后紅外光譜的變化，推測(cè)藥物與蛋白質(zhì)作用的主要基團(tuán)，蛋白質(zhì)中氨基酸殘基側(cè)鏈吸收峰的信息，如Tyr, 1515cm-1， His, 1105 cm-1等 。同時(shí)可以結(jié)合其它方法對(duì)結(jié)合機(jī)理、結(jié)合部位進(jìn)行推測(cè)。以人血清白蛋白（HSA）和苯乙烯酸系列有機(jī)酸的相互作用為例，通過(guò)紅外光譜分析計(jì)算可得到蛋白質(zhì)與藥物作用前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果見(jiàn)表1。其中CI為肉桂酸；CO為香豆酸；CA為咖啡酸。表1 HAS與苯乙烯酸系列有機(jī)酸作用后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化苯乙烯酸系列有機(jī)酸（n1）藥物CI（0.4）CO（11）CA（16）-螺旋（）-2.5-4.9-8.1-折疊（）-1.5-0.7-1.9-轉(zhuǎn)角（）2.74.07.7無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)（）HAS與氯原酸（CLA）和阿魏酸（FA）相互作用后-螺旋分別減少7和5；-轉(zhuǎn)角分別增加約4和3；無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)約增加3。結(jié)合熒光光譜測(cè)得二者與HAS的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均為1，結(jié)合強(qiáng)度分別為氯原酸4.37 104 M-1，阿魏酸2.23 104 M-1。蛋白質(zhì)與藥物作用前后其酰氨I帶和III帶的擬合譜圖見(jiàn)圖5圖5 HAS與藥物作用前后酰氨I帶和III帶譜圖擬合結(jié)果人血清白蛋白與另外三個(gè)不同結(jié)構(gòu)有機(jī)酸，芥子酸（SA）、沒(méi)食子酸（GA）和莽草酸（SI），相互作用研究后發(fā)現(xiàn)，HSA與實(shí)驗(yàn)中最大濃度的芥子酸作用后-螺旋和-折疊分別減少了6.2%和2.0%，-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)分別增加了5.0%和3.2%；芥子酸在HSA上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，表觀結(jié)合強(qiáng)度分別為2.5103 LMol-1和4.9108 LMol-1。與沒(méi)食子酸作用后-螺旋和-折疊分別減少了5.2%和1.5%，-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)分別增加了5.4%和 1.3%；一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，KA為1.1104 LMol-1。這三種有機(jī)酸的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。圖6 a芥子酸，b沒(méi)食子酸，c 莽草酸水解單寧酸（PGG）與蛋白質(zhì)的相互作用同樣可以應(yīng)用紅外光譜進(jìn)行研究，結(jié)合酰氨I帶和III帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與藥物作用后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散。與PGG作用后，蛋白質(zhì)的-螺旋結(jié)構(gòu)降低了約8，-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)分別增加了約6和4 ，數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2。熒光結(jié)果顯示隨著PGG濃度的增加，它在HSA上有兩個(gè)個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。表觀結(jié)合強(qiáng)度分別為1.66104 Lmol-1 和8.98108 Lmol-1 。人血清白蛋白（HSA）分子是一個(gè)含有585個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽鏈，形成9個(gè)回折，其間以二硫鍵相連。通?？梢詫AS分子劃分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域（I、II、III），每個(gè)域又包含兩個(gè)子域（IA、IB、IIA）。HAS分子中有兩個(gè)主要的活性位點(diǎn)，site I位于IIA子域，主要可以和電荷位于分子中央的較大的雜環(huán)陰離子結(jié)合；site II位于IIIA子域，主要可以結(jié)合負(fù)電荷位于一端的長(zhǎng)鏈脂肪羧酸。上文中談到的幾種有機(jī)酸結(jié)合位置研究發(fā)現(xiàn)，CI、CO、CA、FA和GA在HAS上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，它可能結(jié)合在site I的IIA亞域，而CLA結(jié)合在IIIA亞域。SA和PGG低濃度時(shí)在HAS上有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但是在高濃度時(shí)出現(xiàn)了第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)該分別結(jié)合在IIA和IIIA亞域。第一個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，激活了第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。表2 與水解單寧酸作用前后HAS的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化CPGG/CHSAAmide-helix (%)-sheet (%)-turn (%)Coil (%)0I54.30.423.10.40.1III54.10.323.50.30.20.01I6.50.1IIII0.30.3III50.70.51I45.80.421.70.422.30.410.20.3III46.40.32I11.60.2III45.60.322.00.30.33I45.00.50.311.90.2III45.40.322.70.40.1苯乙烯酸、苯甲酸和單寧酸等與蛋白質(zhì)都有特征性的結(jié)合，而莽草酸基本上不與蛋白質(zhì)結(jié)合。莽草酸分子不具有芳香性，其它幾種藥物都具有芳香性。從藥物結(jié)構(gòu)分析藥物與蛋白的結(jié)合機(jī)理，可知COO-1，苯環(huán)、酚羥基在結(jié)合過(guò)程中起到了重要作用。人血清白蛋白分子中的活性位點(diǎn)Site I 和 Site II 結(jié)合腔的內(nèi)壁主要由疏水性氨基酸殘基組成，而腔的入口處是帶正電荷的堿性氨基酸。藥物分子中的COO與腔口帶正電荷的堿性氨基酸 Arg257、Arg222、Lys199、His242、Arg218和Lys195發(fā)生靜電吸引，靠近結(jié)合腔。 苯環(huán)與腔中的疏水性殘基，如Leu219、Phe223、Leu234、Leu238、Leu260、Ala261等發(fā)生疏水性相互作用。酚羥基與腔體中的Trp214、Glu292、Phe 211等氫鍵給予體形成氫鍵 。酚羥基與主肽鏈的C=O、N-H等基團(tuán)之間形成氫鍵，破壞了主鏈原有的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。主要體現(xiàn)在-螺旋 結(jié)構(gòu)的降低，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，使蛋白質(zhì)的親水性增加，熒光發(fā)射峰紅移。PGG與HSA間的強(qiáng)相互作用也是由其分子結(jié)構(gòu)決定的（其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7）。 PGG分子體積大酚羥數(shù)多，非常有利于藥物分子和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，特別是多個(gè)酚羥基與蛋白質(zhì)主鏈及側(cè)鏈氨基酸之間的氫鍵作用，使PGG可以牢固的結(jié)合在蛋白質(zhì)上，同時(shí)也使維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的力體系發(fā)生了改變，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。當(dāng)CPGG/CHSA0.5時(shí)PGG在HAS上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1，0.5CPGG/CHSA3時(shí)n=2，從兩個(gè)位點(diǎn)的表觀結(jié)合常數(shù)kA和第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)kA數(shù)量級(jí)來(lái)看，HSA在PGG濃度高時(shí)出現(xiàn)的第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)PGG的親合力并不亞于第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。 但PGG并未在低藥物濃度時(shí)與這兩個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生結(jié)合。第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可能是在PGG與HSA上第一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生作用引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化以后才形成或者暴露出來(lái)的。 圖7 -1,2,3,4,6-五-O-倍酰-D-葡萄糖(PGG) 的結(jié)構(gòu)Baxter等人研究了沒(méi)食子酸丙酯、-1,3,6-三-O-倍酰-D-葡萄糖(TGG)和PGG與富脯氨酸肽段(PRP)的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間主要的作用模式為多元酚苯環(huán)與脯氨酸之間的疏水力堆積作用。小體積的多元酚靠苯環(huán)與一個(gè)脯氨酸殘基發(fā)生疏水作用，體積較大的單寧酸則可以和PRP肽段中連續(xù)的兩個(gè)或三個(gè)脯氨酸發(fā)生作用。Baxter等還研究了單寧酸和球蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間還可通過(guò)單寧酸的苯環(huán)與暴露于球蛋白表面帶苯環(huán)的氨基酸殘基間發(fā)生疏水作用。三、光動(dòng)力作用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響光動(dòng)力作用產(chǎn)生的自由基能引起蛋白質(zhì)的失活、斷裂、集聚、側(cè)鏈氧化、變性、水解活性變化、疏水性變化、構(gòu)象改變、新反應(yīng)物形成等。蛋白質(zhì)自由基形成后都會(huì)引起其結(jié)構(gòu)改變，這一過(guò)程的具體機(jī)制還不清楚。以前認(rèn)為，自由基最初改變一些作為接收器的氨基酸殘基（如Cys、Tyr、Trp），這一作用再通過(guò)其它方式影響其余的氨基酸，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，但是，最初的作用位點(diǎn)和作用的轉(zhuǎn)移方式都不清楚。在有氧條件下將蛋白質(zhì)置于能產(chǎn)生自由基的物化環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)過(guò)氧化物的存在，這些過(guò)氧化物在金屬離子存在時(shí)被分解，生成反應(yīng)力更強(qiáng)的自由基。這些自由基是引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞或鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)的關(guān)鍵 。我們通過(guò)紅外光譜研究了光動(dòng)力作用對(duì)細(xì)胞表面蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果從光動(dòng)力作用前后蛋白質(zhì)紅外光譜的差譜中就可以明顯的看到變化，見(jiàn)圖8。經(jīng)過(guò)譜圖擬合計(jì)算后發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力作用之后，細(xì)胞表面蛋白有從有序結(jié)構(gòu)向相對(duì)無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，見(jiàn)表3。表3 光動(dòng)力作用對(duì)細(xì)胞表面蛋白結(jié)構(gòu)的影響-H