細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染.doc

細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染的預(yù)防及處理Mycoplasma國(guó)內(nèi)主要有三種譯名，醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“支原體”（分枝原體，枝原體，類菌質(zhì)體），動(dòng)物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)譯為“霉形體”或“支原體”，臺(tái)灣、香港則譯為微漿菌。 支原體是目前已知一類能在無(wú)生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物。自然界分布廣泛，種類多，有80余種，分為兩個(gè)屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個(gè)種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。與人類感染有關(guān)的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。 支原體無(wú)細(xì)胞壁，多呈不規(guī)則球狀、長(zhǎng)絲狀，可分枝，營(yíng)寄生共生或腐生。一般侵害對(duì)象為動(dòng)植物，可造成多種疾病。 細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題。國(guó)內(nèi)外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。 支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染，等等。 體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。 由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等。 組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素。 抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不渾濁。 支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒有細(xì)胞壁，故作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素等是不敏感的；對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對(duì)支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過(guò)除菌的方法對(duì)支原體是沒有作用的。 由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過(guò)濾膜，所以過(guò)濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險(xiǎn)，近年來(lái)，60Co輻射滅菌技術(shù)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗(yàn)證實(shí)以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達(dá)到了無(wú)菌要求，經(jīng)多批培養(yǎng)試驗(yàn)，輻射滅菌安全可靠；輻射滅菌的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)性能不低于過(guò)濾組，證明輻射滅菌對(duì)培養(yǎng)基性能無(wú)不良影響；對(duì)血清的輻射滅菌試驗(yàn)效果也表明60CO射線不影響培養(yǎng)效果。把干粉培養(yǎng)基經(jīng)無(wú)菌操做定量分裝于滅菌容器內(nèi)，輻射后以干粉原型貯藏，不但培養(yǎng)基的純凈性得到保障，而且營(yíng)養(yǎng)性能較過(guò)濾后以水溶液形式保存更穩(wěn)定，對(duì)谷氨酰胺等這類水溶液不穩(wěn)定者特別合適。 目前，有專門做支原體檢測(cè)的試劑盒，可以用細(xì)胞滴片檢測(cè)。市場(chǎng)上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin（InvivoGen公司），能有效的殺滅支原體，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過(guò)的細(xì)胞不會(huì)重新感染支原體。另外，配合支原體檢測(cè)試劑盒（市場(chǎng)上有售，如美國(guó)ICN公司的產(chǎn)品），可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。 細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的特點(diǎn)及檢驗(yàn) BIOX.CN 2005-6-3 19:47:34來(lái)源：生命經(jīng)緯 支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑02um)并獨(dú)立生活的微生物約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性可為圓形、絲狀或梨形。 支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群 或中央束。 支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7680)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。 支原體污染細(xì)胞后培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢甚至從培養(yǎng)器皿脫落。 為確定有無(wú)支原體污染可做如下檢酗： 相差顯微境檢測(cè)：將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。 熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長(zhǎng)滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗置于用生理鹽水配濃度為50pgml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗12min向細(xì)胞面滴加pH55磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。 電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速也可以利用透射電鏡。 DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高但方法較為復(fù)雜 支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求比細(xì)菌高。細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)，又不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，而且它對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意。國(guó)內(nèi)外研究表明，95以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來(lái)講，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素等完全不敏感；對(duì)多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過(guò)的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。對(duì)于支原體污染的細(xì)胞，可以采取補(bǔ)救措施：1 抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對(duì)于支原體污染抗生素應(yīng)用，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好。2 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用5-10小時(shí)可以殺滅支原體。但由于41度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大的影響，故處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。細(xì)胞支原體污染一般情況及預(yù)防措施信息來(lái)源：本站原創(chuàng)更新時(shí)間：2004-10-19 2:28:00 細(xì)胞株若受到細(xì)菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時(shí)，會(huì)嚴(yán)重的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。而細(xì)菌、真菌等之微生物污染時(shí)，較易自培養(yǎng)基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時(shí)，細(xì)胞之外觀較無(wú)明顯變化，但是其污染會(huì)造成細(xì)胞之生長(zhǎng)速率緩慢、細(xì)胞產(chǎn)生病變之型態(tài)改變等等變化。各國(guó)細(xì)胞庫(kù)支原體污染的統(tǒng)計(jì)表，如下：國(guó)家 受支原體污染(%) 報(bào)告年度USAFDA 15 1993(past 30 years)USAATCC 15-20 1992Japan(IFO，RIKEN，JCR) 803022 1981 1987-19931998GermanyDSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原體高污染率的原因?yàn)椋?1.支原體size 0.10.8 um，無(wú)細(xì)胞壁，可透過(guò)一般過(guò)濾膜（0.22-0.45 um） 2.支原體污染時(shí)，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 3.過(guò)去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式 4.細(xì)胞流通間缺乏品管，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染 5.研究或操作人員忽略污染問題 而支原體污染了來(lái)源: 1.已受污染的細(xì)胞 2.操作人員的疏失 3.已受污染的培養(yǎng)基、血清 4.操作環(huán)境不良、實(shí)驗(yàn)器具不潔等 由于支原體為人體口腔中之正常菌叢，實(shí)驗(yàn)室之操作人員的污染亦可能為污染源，須十分注意。而萬(wàn)一細(xì)胞已受支原體污染時(shí)，最佳的處理原則為將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細(xì)胞株。但是若是堅(jiān)持要作去除支原體污染，有以下幾種方法，只不過(guò)結(jié)果會(huì)與原始的細(xì)胞特性有差異。去除支原體污染： 1. 抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3. Anti-sera 預(yù)防與控制方面可從以下各點(diǎn)加強(qiáng)注意：G 設(shè)備方面： 1.使用已作支原體測(cè)試ok之細(xì)胞株 2.于另一隔離之區(qū)域操作未知是否有支原體污染之細(xì)胞 3.使用不添加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 G 檢測(cè)方面：定期以標(biāo)準(zhǔn)的支原體檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清、ddH2O有否被支原體污染。G 實(shí)驗(yàn)操作人員之無(wú)菌觀念與無(wú)菌操作技術(shù)之要求 有關(guān)支原體污染之問題與回答：o 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。 主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。 嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。o 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)， 應(yīng)如何處理？直接滅菌后丟棄之。o 支原體 (mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？不能。 除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外， 大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無(wú)法以其外觀分辨之。o 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。o 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。 支原體之檢測(cè)：*直接培養(yǎng)法 *原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。 特點(diǎn)：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來(lái)評(píng)估其它偵測(cè)新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。 缺點(diǎn)：培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，須35星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái) (例如M. hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對(duì)照組，可能會(huì)造成污染。 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無(wú)菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無(wú)菌培養(yǎng)皿60x15mm、L-玻棒、37培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長(zhǎng)期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無(wú)菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。） 培養(yǎng)基制備：基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細(xì)菌污染。 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22m無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70。 液體培養(yǎng)基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4，期限1個(gè)月。 固體培養(yǎng)基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121，15分鐘。放在50水中浴中，待溫度降低至50時(shí)，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50之無(wú)菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4，期限1個(gè)月。 步驟： 取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，接種于液體培養(yǎng)基中，置于37培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上，將其倒放置于37厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。 另取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。 另作正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組，正反應(yīng)對(duì)照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負(fù)反應(yīng)對(duì)照組為待測(cè)細(xì)胞之新鮮培養(yǎng)基。 結(jié)果判讀： 支原體生長(zhǎng)較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12周增殖后，再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個(gè)測(cè)試需5個(gè)星期才知正確結(jié)果。 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長(zhǎng)所致，為圓形無(wú)色透明菌落，大小約10-55m。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)（slime）。 若要區(qū)分細(xì)胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agar plate，若是細(xì)胞則不會(huì)生長(zhǎng)。 DNA螢光染色法 原理利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（5580%），所以可將其染色而偵測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 測(cè)試步驟用間接步驟，將待測(cè)細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作螢光染色。正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對(duì)照。 待測(cè)細(xì)胞亦可作直接測(cè)試，但需為吸附型細(xì)胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細(xì)胞易有螢光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟。 特點(diǎn)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測(cè)步驟。可以偵測(cè)不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有螢光背景，影響判讀。 材料 Hanks balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無(wú)菌22x22mm蓋玻片浸于酒精內(nèi)，使用前過(guò)火滅菌，一般吸附型細(xì)胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細(xì)胞面朝下放在玻片上觀察。 Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細(xì)胞須先測(cè)試無(wú)污染。MEM with 10%FBS ( medium for Vero cell) 配制試劑: 無(wú)菌HBSS配制Hanks balanced salt solution，以0.22mm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 Hoechst 33258 stock solution（100X）稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無(wú)菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20。 Hoechst 33258 working reagent取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4。 mounting solution22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4。 固定溶液（fixative）冰醋酸與甲醇以13之體積比例混合，使用前才配制。 步驟： 培養(yǎng)Vero細(xì)胞： Vero細(xì)胞可作長(zhǎng)期培養(yǎng)或制作多個(gè)冷凍保存管，測(cè)試前解凍培養(yǎng)。測(cè)試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。 在接種測(cè)試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，以12x104 cellsml培養(yǎng)于chamber slide中，每個(gè)well加入1ml細(xì)胞懸浮液，于37, 5CO2培養(yǎng)。隔日確定生長(zhǎng)良好后，即可接種測(cè)試樣品。 接種測(cè)試樣品：樣品種類：1ml待測(cè)之培養(yǎng)基，1ml待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液（可將細(xì)胞稍微刮下，0.050.1ml冷凍管之細(xì)胞懸浮液。 將測(cè)試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的螢光染色觀察。 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細(xì)胞作為正反應(yīng)對(duì)照組或是已感染支原體之細(xì)胞培養(yǎng)液或冷凍細(xì)胞液，負(fù)反應(yīng)對(duì)照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( MEM +10%FBS)。 DNA螢光染色檢測(cè) 取出培養(yǎng)5日之Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復(fù)上述之步驟，風(fēng)干10分鐘。 于每個(gè)well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。 吸掉Hoechst 33258染液后，以無(wú)菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束(330380 nm)之濾光鏡，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之螢光物產(chǎn)生。 結(jié)果判讀若有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其螢光可維持?jǐn)?shù)星期。圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測(cè)試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測(cè)試樣品有支原體的污染。 支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)，又不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，而且它對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不渾濁。由于支原體能夠透過(guò)濾膜，因此在使用一些通過(guò)過(guò)濾滅菌的試劑上，如果試劑本身帶有支原體污染，則很容易造成支原體污染的傳播。其中細(xì)胞培養(yǎng)接觸水源是支原體最容易傳播和交叉污染的地方，也是實(shí)驗(yàn)室消毒最難處理的地方，這里包括細(xì)胞培養(yǎng)箱產(chǎn)生的氣霧、培養(yǎng)箱內(nèi)專用水源以及水浴鍋等設(shè)備，AppliChem獨(dú)創(chuàng)了專業(yè)針對(duì)水池抗支原體污染的系列產(chǎn)品。用于容器表面的消毒, 以及二氧化碳培養(yǎng)箱蓄水槽, 各種水箱, 及清洗用水池的消毒。細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的預(yù)防培養(yǎng)箱及水源支原體噴霧試劑Incubator-Clean (目錄號(hào)：A5230)產(chǎn)品轉(zhuǎn)為細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱及其他儀器表面支原體消毒，能有效預(yù)防真菌（及孢子）、細(xì)菌（及桿菌孢子）、支原體以及病毒污染（包括 HIV和乙肝病毒）。該試劑活性成分為四芐基胺化合物，試劑不含汞、甲醛、苯酚和乙醇等細(xì)胞毒物質(zhì)，更重要的是，該消毒試劑對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，并且是生物可降解的，