液相流動相緩沖鹽選擇.doc

下面內(nèi)容綜合了Agilent和網(wǎng)上查到的一些資料： 一般來說，反相HPLC的流動相包括有機(jī)相和水相，有機(jī)相常用的為色譜甲醇和乙腈，不太常用的還有四氫呋喃和異丙醇。甲醇有其性價比的優(yōu)勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度；乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是當(dāng)樣品峰形不好或者分離不好時，更換溶劑是一個很好的選擇，因為不同的溶劑可提供不同的選擇性。 在反相色譜中，流動相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化，因此控制pH對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要，通常在pH24的條件下，保留時間對pH的微小改變穩(wěn)定性最高，因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸?？紤]到重現(xiàn)性，所用的pH應(yīng)高于或低于待分析物pKa或pKb上下一個pH單位。當(dāng)待分析物pKa或pKb未知時，應(yīng)測試一種以上流動相pH（如pH2.0和pH6.5緩沖鹽溶液），可提供最好結(jié)果。對流動相的優(yōu)化主要體現(xiàn)在水相上。流動相pH值對色譜分離的影響有多鐘方式，根據(jù)待分析物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非極性較強(qiáng)或中性的化合物，pH對分離度和保留的影響一般不明顯。如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨pH改變非常明顯。 （1） 酸性分析物，應(yīng)選擇低pH緩沖液流動相，以防止分析物離子化。了解分析物的pKa，才能有效的選擇流動相pH。緩沖范圍應(yīng)在其緩沖液離子pK值1 pH單位，使流動相的優(yōu)化具有一定的靈活性。例如，醋酸鹽的pKa為4.8，緩沖范圍為pH3.85.8。 （2） 堿性化合物，在高pH條件下才能得到其非離子形態(tài)，但這對色譜柱不利。通常許多堿性化合物在低pH條件的保留就已經(jīng)滿足要求了，所以可選擇低pH條件。如果選擇高pH條件，則注意需選擇耐強(qiáng)堿的色譜柱。 水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改變pH值、改善峰形、提高分離度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。單純做液相時，低波長下磷酸最合適；而做液質(zhì)時首選三氟乙酸，或甲酸、乙酸。開發(fā)液相分析方法時流動相可首選0.1%的磷酸水溶液，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。在單獨用酸不行的時候再考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)、配制簡單，需要調(diào)pH值時要有相應(yīng)的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，還有醋酸鹽，常用的鹽濃度在1020mM左右（根據(jù)實際情況，有時可以選擇更低或更高濃度，建議最高濃度不超過50mM）。下表是Waters提供的一個資料，常規(guī)實驗室建議使用的緩沖鹽體系。緩沖鹽/流動相改性劑pKa緩沖范圍揮發(fā)性？(1 pH)是否MS兼容？備注TFA0.3-是是離子對試劑，能夠抑制MS信號，通常使用的濃度范圍0.020.1%乙酸4.76-是是同乙酸銨一起使用具有最大的緩沖能力，通常使用的濃度范圍0.11.0%甲酸3.75-是是同甲酸銨一起使用具有最大的緩沖能力，通常使用的濃度范圍0.11.0%乙酸鹽（銨鹽）4.763.765.76是是通常使用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽是非揮發(fā)性的甲酸鹽（銨鹽）3.752.754.75是是通常使用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽是非揮發(fā)性的磷酸鹽12.151.153.15否否傳統(tǒng)的低pH緩沖體系，UV透光度很好磷酸鹽27.26.28.2否否當(dāng)pH超過7時，降低操作溫度/緩沖鹽濃度以及使用保護(hù)柱可以延長色譜柱壽命磷酸鹽312.311.313.3否否當(dāng)pH超過8時，降低操作溫度/緩沖鹽濃度以及使用保護(hù)柱可以延長色譜柱壽命4-甲基嗎啡啉8.47.49.4是是通常使用濃度為10mM或更少氨水碳酸氫銨9.210.3(HCO3-)9.2(NH4+)8.210.28.211.3是是通常使用濃度為510mM（用于MS工作時保持離子源溫度超過150）。用氨水或乙酸調(diào)節(jié)pH值，在pH10時具有很好的緩沖能力。乙酸銨9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM甲酸銨9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM硼酸9.28.210.2否否降低溫度，減少濃度并使用色譜柱來延長柱壽命CAPSO（3-環(huán)己胺基-2-羥基丙磺酸9.78.710.7否否兩性離子緩沖液，同乙腈互溶，通常使用濃度為110mM，氣味小Glycine甘氨酸2.4,9.88.810.8否否兩性離子緩沖液，比使用硼酸鹽對柱子的損傷更小些1-甲基哌啶10.29.311.3是是通常使用濃度為110mMCAPS10.49.511.5否否兩性離子緩沖液，同乙腈互溶，通常使用濃度為110mM，氣味小三乙胺（乙酸鹽）10.79.711.7是是通常使用濃度為0.11.0%。當(dāng)使用乙酸滴定時形成可揮發(fā)性的緩沖液（不可用鹽酸或磷