基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1及其抑制因子TIMP1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義.doc

基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1及其抑制因子TIMP1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義【摘要】目的研究基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）及其抑制因子TIMP1mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）異位和在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)，探討其在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用。方法應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR ）和免疫組化SP法檢測(cè)43例EMs的異位和在位內(nèi)膜及20例正常子宮內(nèi)膜中MMP1，TIMP1mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果在EMs異位內(nèi)膜中MMP1mRNA及蛋白均呈高表達(dá)，TIMP1mRNA及蛋白均呈低表達(dá)，與EMs在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜相比，差異有顯著性，P005。MMP1/TIMP1比值在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜分別為146057，115038，均顯著高于正常內(nèi)膜（P005）；而且異位內(nèi)膜中比值1的幾率（33/39，846%）明顯高于在位內(nèi)膜（P005），兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。異位內(nèi)膜組織中MMP1，TIMP1mRNA及蛋白的表達(dá)無周期性變化，但與rAFS臨床分期有相關(guān)性（P005）。結(jié)論異位內(nèi)膜組織中MMP1高表達(dá)，TIMP1低表達(dá)，導(dǎo)致MMP1/TIMP1平衡失調(diào)，使異位內(nèi)膜組織具有更強(qiáng)的侵襲能力，在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜異位癥；基質(zhì)金屬蛋白酶；金屬蛋白酶組織抑制因子；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學(xué)子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是婦科常見的一種良性病變，但卻具類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。近年研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的降解與重建是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關(guān)鍵因素1?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組鋅依賴性的、在結(jié)構(gòu)上高度同源的蛋白水解酶，是降解ECM成分的最顯要的一組酶類2，其活性在體內(nèi)受到天然組織抑制劑金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）的特異性抑制。MMPs與TIMPs間的平衡調(diào)節(jié)對(duì)于協(xié)調(diào)ECM降解與重建、維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整具有重要作用。目前研究表明EMs患者的在位及異位子宮內(nèi)膜均可分泌MMPs及TIMPs，推測(cè)其在EMs的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法和RTPCR技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥異位和在位內(nèi)膜中MMP1 和TIMP1 的表達(dá)，以探討MMPs/TIMPs在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用。1 材料和方法11 對(duì)象 45例EMs異位內(nèi)膜組織標(biāo)本均來自本院2003年7月—2005年4月因EMs而行手術(shù)的患者，平均年齡（35564）歲，其中增生期25例，分泌期20例。根據(jù)rAFS分期標(biāo)準(zhǔn)，期20例，期16例，期9例。22例EMs在位內(nèi)膜標(biāo)本取自上述因EMs行子宮切除的患者，其中增生期14例，分泌期8例。另取同期因子宮肌瘤而行子宮切除術(shù)患者正常子宮內(nèi)膜20例為對(duì)照組，平均年齡(35548)歲，其中增殖期子宮內(nèi)膜12例，分泌期8例。所有患者術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未接受任何激素治療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。月經(jīng)周期的劃分根據(jù)末次月經(jīng)及子宮內(nèi)膜病理檢查結(jié)果確定。12 試劑 MMP1 ，TIMP1 鼠抗單克隆抗體、SP試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑盒均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。引物由上海生工生物工程公司合成。13 檢測(cè)方法及結(jié)果判定131 免疫組化SP法 試驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行，DAB顯色，PSB代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽性染色的乳腺癌組織切片為陽性對(duì)照。陽性細(xì)胞為光鏡下細(xì)胞漿或胞膜中出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒，參照Shimizu等3方法，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞分布進(jìn)行分析。132 RTPCR 總RNA的提取利用TRIzol試劑盒完成，cDNA合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行，所得cDNA用作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MMP1的引物序列為5CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA3及5AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT3；TIMP1的引物序列為5ATCCTGTTGTTGCTGTG3及5GACTGGAAGCCCTTTTCAGA3 反應(yīng)；內(nèi)參照GAPDH基因的引物序列為5CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA3及5ATGATCTTGAGGCTGTTGTCAA3。三者的擴(kuò)增片段分別為786 bp，520 bp及450 bp。MMP1和GAPDH的擴(kuò)增參數(shù)為95 45 s，57 45 s，72 1 min，33個(gè)循環(huán)，最后72 延伸5 min。TIMP1和GAPDH基因的擴(kuò)增參數(shù)為95 40 s，59 50 s，72 1 min 共33個(gè)循環(huán)，最后72 延伸5 min。取10 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠（05 mg/L）的2%瓊脂糖凝膠中電泳，80 V，1 h，用DNA100作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，利用VADAS 21系統(tǒng)（德國(guó)OPTON公司）進(jìn)行圖像掃描分析。14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS115軟件包分析資料，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、精確概率法、KruskalWallis檢驗(yàn)及相關(guān)分析。2 結(jié)果21 MMP1，TIMP1蛋白的分布及表達(dá) MMP1，TIMP1蛋白主要分布于子宮內(nèi)膜腺上皮和內(nèi)膜基質(zhì)中。MMP1蛋白在EMs異位內(nèi)膜中表達(dá)較強(qiáng)，以（+）（+）為主，在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)尤為豐富，陽性表達(dá)率高達(dá)41/45（911%），顯著高于正常內(nèi)膜和EMs在位內(nèi)膜相比P005，而在后二者之間差異無顯著性。TIMP1蛋白在EMs異位和在位內(nèi)膜中均呈弱陽性表達(dá)，以（+）（+）為主，明顯低于正常內(nèi)膜（P005）。詳見表1。表1 MMP1，TIMP1蛋白在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)（略）與正常子宮內(nèi)膜組相比,P0.01,P0.05;與EMs在位內(nèi)膜相比,P0.052.2 MMP1，TIMP1mRNA的表達(dá) EMs異位內(nèi)膜中MMP1mRNA的表達(dá)量顯著增高，TIMP1mRNA的表達(dá)量顯著降低，與正常內(nèi)膜相比差異有顯著性（P0.01），而且二者在異位內(nèi)膜中的表達(dá)有相關(guān)性（P0.05）。TIMP1mRNA在EMs在位內(nèi)膜中的表達(dá)也明顯低于正常內(nèi)膜（P0.05）。詳見表2。2.3 MMP1/TIMP1mRNA比值分析 EMs異位和在位內(nèi)膜中MMP1/TIMP1mRNA比值明顯高于正常內(nèi)膜（P0.05）。表2 MMP1，TIMP1mRNA在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)（略）與正常內(nèi)膜相比,P0.05;與EMs在位內(nèi)膜相比,P0.05）；而與rAFS臨床分期具有相關(guān)性，隨rAFS臨床分期的增高而分別增加或降低（P0.05）。3 討論子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病學(xué)說紛紜眾多，但仍以子宮內(nèi)膜細(xì)胞隨經(jīng)血逆流種植為主導(dǎo)理論。依此學(xué)說，內(nèi)膜細(xì)胞必須突破腹水、腹腔細(xì)胞及ECM，才能完成黏附、侵襲、血管形成的過程。研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶在異位內(nèi)膜生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、種植多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)ECM和基膜的降解起重要作用。MMP1是MMPs 家族中的主要成員，作用底物主要是纖維類膠原，其中，型膠原是ECM嗜銀網(wǎng)狀纖維的主要成分，是細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移必須跨越的屏障。既往研究發(fā)現(xiàn)4，間質(zhì)中MMP1的表達(dá)強(qiáng)度與嗜銀纖維網(wǎng)的破壞和基質(zhì)崩解密切相關(guān)，在僅有腺上皮表達(dá)的病灶中，很少觀察到網(wǎng)狀纖維的破壞和基質(zhì)崩解。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMP1mRNA及蛋白在EMs異位內(nèi)膜中的表達(dá)量顯著增強(qiáng)，且MMP1蛋白在異位內(nèi)膜間質(zhì)中的表達(dá)尤為豐富，陽性表達(dá)率高達(dá)91.1%（41/45），明顯高于正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)。因此認(rèn)為MMP1在異位內(nèi)膜組織中的過強(qiáng)表達(dá)，尤其在異位內(nèi)膜間質(zhì)中的過強(qiáng)表達(dá)，使其更易降解ECM網(wǎng)狀纖維中的I型和III型膠原纖維，使網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)破壞，基質(zhì)崩解，導(dǎo)致異位內(nèi)膜向周圍組織不斷侵襲、種植，使異位病灶不斷擴(kuò)大，在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在體內(nèi)，MMP1的水解活性受其天然特異性組織抑制因子TIMP1的緊密調(diào)控，生理狀態(tài)下，MMP1與TIMP1之間存在著一種動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡是協(xié)調(diào)ECM降解與重建、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜組織中MMP-1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯增高，TIMP1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低，MMP1/TIMP1mRNA比值明顯增高，MMP1與TIMP1之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破。TIMP1的低表達(dá)使其對(duì)MMP1蛋白水解活性的抑制作用減弱，MMP1降解ECM的能力增強(qiáng)。因此認(rèn)為，MMP1/TIMP1平衡失調(diào)使EMs異位內(nèi)膜較正常子宮內(nèi)膜具有更強(qiáng)的向周圍組織侵襲的能力，在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)EMs患者與非EMs患者的在位內(nèi)膜之間存在差異，EMs在位內(nèi)膜的蛋白水解能力強(qiáng)于正常內(nèi)膜，但又較異位內(nèi)膜差，呈現(xiàn)出獨(dú)特的分子生物學(xué)特征，從而提出在位內(nèi)膜決定論的新觀點(diǎn)，這也是解釋EMs家族傾向和遺傳性的理論基礎(chǔ)5。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TIMP1mRNA及蛋白在EMs在位內(nèi)膜中的表達(dá)低于正常子宮內(nèi)膜，MMP1/TIMP1mRNA比值明顯增高，TIMP1與MMP1之間平衡失調(diào)，使MMP1破壞和降解ECM的蛋白水解活性增強(qiáng)。當(dāng)此種內(nèi)膜組織隨經(jīng)血逆流入腹腔并與腹膜發(fā)生異位黏附后，侵襲并種植于腹膜的能力較正常內(nèi)膜增強(qiáng)，從而更易于在腹腔內(nèi)種植生長(zhǎng)形成異位病灶，進(jìn)一步佐證了在位內(nèi)膜決定論的觀點(diǎn)。這與SharpeTimms等6應(yīng)用原位雜交法研究的結(jié)果相一致。但是，EMs在位內(nèi)膜在EMs發(fā)病機(jī)制中是因是果，即在位內(nèi)膜MMPs/TIMPs的失衡是導(dǎo)致最初腹膜異位種植、發(fā)生EMs的原因，還是由于發(fā)生EMs后機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變而致在位子宮內(nèi)膜發(fā)生的變化，尚有待于進(jìn)一步研究。子宮內(nèi)膜異位癥是一種慢性進(jìn)行性疾病，病情常常不易控制而進(jìn)行性加重。本研究結(jié)果顯示，EMs異位內(nèi)膜中MMP1，TIMP1的表達(dá)與rAFS分期有相關(guān)性，隨著EMs嚴(yán)重程度的增加，MMP1含量有增高的趨勢(shì)，而TIMP1有降低的趨勢(shì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為MMPs的過度表達(dá)與細(xì)胞的浸潤(rùn)行為和轉(zhuǎn)移傾向存在正相關(guān)，MMPs的過度表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和種植能力。隨著EMs嚴(yán)重程度的增加，異位病灶中MMP1含量逐漸增高，TIMP1逐漸降低，MMP1/TIMP1平衡嚴(yán)重失調(diào)，MMP1水解ECM的活性不斷增強(qiáng)，從而使富含MMP1的異位內(nèi)膜不斷侵襲破壞周圍組織屏障，使病灶不斷蔓延擴(kuò)大，使病程不斷進(jìn)展加劇，這可能是EMs病程不斷遷延進(jìn)展且難以根治的重要原因之一。同時(shí)異位病灶的周期性出血和脫落再種植也可能是EMs不斷進(jìn)展的重要因素。因此，在臨床上早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是控制異位癥病情進(jìn)展，減輕病人痛苦的有效措施。【參考文獻(xiàn)】 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