光合細(xì)菌的分離及初步鑒定.doc

光合細(xì)菌的分離及初步鑒定【摘要】利用從西南大學(xué)北校區(qū)崇德湖的邊泥，富集分離得到兩種光合細(xì)菌，該菌株厭氧培養(yǎng)后呈現(xiàn)出紅色和綠色，革蘭氏染色呈陰性，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及文獻(xiàn)資料查詢鑒定，初步鑒定為該菌株屬于紅假單胞菌屬和藍(lán)細(xì)菌。【關(guān)鍵詞】光合細(xì)菌 富集 分離 鑒定目的初步了解無(wú)氧操作，學(xué)會(huì)無(wú)菌操作和革蘭氏染色，掌握微生物實(shí)驗(yàn)的基本技能，學(xué)習(xí)分離厭氧光合細(xì)菌及初步鑒定的方法。原理 光合細(xì)菌在有光照缺氧的環(huán)境中能進(jìn)行光合作用，利用光能進(jìn)行光合作用，利用光能同化二氧化碳，與綠色植物不同的是，它們的光合作用是不產(chǎn)氧的。光合細(xì)菌在自身的同化代謝過(guò)程中，又完成了產(chǎn)氫、固氮、分解有機(jī)物三個(gè)自然界物質(zhì)循環(huán)中極為重要的化學(xué)過(guò)程。從厭氧且能得到光照的環(huán)境采樣，選用特定的富集和分離培養(yǎng)基，在厭氧并有光照的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可分離到不同的光合細(xì)菌。材料與用具1、材料 崇德湖池塘邊透光處采取淤泥2、培養(yǎng)基及試劑 光合細(xì)菌液體富集培養(yǎng)基（以下配方為500ml所用）：CH3COONa 1.5 g；CH3CH2COONa 0.15 g；NaCl 0.5 g；(NH4)2SO4 0.15 g；MnSO4 12.5 mg；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaCl2 0.025 g；MgSO47H2O 0.1 g；FeSO47H2O 0.0025 g；酵母膏0.05 g；蛋白胨0.005 g；蒸餾水500 ml；pH 70光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基（以下配方為500ml用）：CH3COONa 1.5g；CH3CH2COONa 0.15g；NaC1 0.25 g；NH4CI 0.5 g；MgSO47H2O 0.1g；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaC12 0.025g；MnC124H2O 00015 g；FeSO4-7H2O 0.0025 g；酵母膏0.05g；蛋白胨0.005 g；谷氨酸0.0001 g；蒸餾水500 ml；瓊脂10 g；pH 7.27.4無(wú)菌水、無(wú)菌液體石蠟3、儀器及用具 光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、接種環(huán)、接種針、玻璃珠等。操作步驟（一）采集含菌樣品 從崇德湖湖邊某向陽(yáng)處挖取淤泥。（二）培養(yǎng)基的制作 按照給出的配方配制培養(yǎng)基。（二）富集培養(yǎng) 取已經(jīng)滅菌的200ml的光合細(xì)菌液體富集培養(yǎng)基，加入少許玻璃珠，同時(shí)接入泥樣10g，振蕩混勻，液面注入0.5cm 高滅菌液體石蠟，棉塞封口，造成厭氧環(huán)境。在溫度28、光照5000lx的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至培養(yǎng)液呈紅棕色，并且在瓶底淤泥表面有深紅色沉積物，使欲要分離的光合細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)種。（三）多次富集 取適量經(jīng)初步富集的菌液于試管液體富集培養(yǎng)基中，再次富集，重復(fù)兩次，使光合細(xì)菌進(jìn)一步繁殖增多，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種。 （四）光合細(xì)菌的分離 采用混菌法，在無(wú)菌培養(yǎng)皿上滴加1ml富集培養(yǎng)液，然后倒入一層厚厚的分離培養(yǎng)基 (融化后的培養(yǎng)基應(yīng)冷卻至50后再覆蓋)，混勻后置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)分離，直至得到純的單個(gè)菌落。采用雙層平板劃線法和雙層平板涂布發(fā)，即先在無(wú)菌培養(yǎng)皿上倒一層培養(yǎng)基，然后涂布和劃線菌液，再在其表面倒一層培養(yǎng)基，形成無(wú)氧環(huán)境。繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。待單菌落長(zhǎng)出后，用穿刺法繼續(xù)純化目的菌，即用接種針在平板中挑取菌落為紅色和綠色的菌落，插入培養(yǎng)基底部，繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行菌種鑒定。（五）光合細(xì)菌的初步鑒定 首先觀察分離平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)及特征，對(duì)不同菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液剛開(kāi)始逐漸成為紅褐色，持續(xù)一段時(shí)間后變?yōu)榫G色，并能看到明顯的綠色藻狀物。分離培養(yǎng)基底部得到了兩種厭氧菌落，一種為紅色菌落，菌落表面微光滑、突起、濕潤(rùn)、有光澤、不透明，菌落邊緣整齊，革蘭氏染色表明該菌株為革蘭氏陰性菌，光學(xué)顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)為桿狀，長(zhǎng)明顯大于寬。另一種菌落呈綠色，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，革蘭氏染色表明該菌株也為革蘭氏陰性菌，光學(xué)顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)為球狀或鏈狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、根據(jù)兩種厭氧菌的形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果，查文獻(xiàn)初步判定紅色菌落為紅假單胞菌屬，綠色菌落為藍(lán)細(xì)菌，當(dāng)然這只是初步的判斷，還得經(jīng)過(guò)系列實(shí)驗(yàn)才能得出具體結(jié)論，但由于實(shí)驗(yàn)條件有限，不能進(jìn)一步鑒定其生理生化特征。2、鑒于光合細(xì)菌能進(jìn)行光合作用自養(yǎng)，因此所用培養(yǎng)基含碳源和氮源甚少，不利于大多數(shù)微生物生長(zhǎng)，所以培養(yǎng)基中雜菌很少，只在分離平板表面上出現(xiàn)一種乳白色、濕潤(rùn)、凸起、呈漿狀的雜菌。3、在配置培養(yǎng)基的過(guò)程中遇到了麻煩，首次所配的液體培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)了很多沉淀，猜想可能由于PH值未嚴(yán)格控制，或藥品加入順序不對(duì)，或各藥品間會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)沉淀所造成，于是重配培養(yǎng)基，按要求調(diào)PH，查藥品加入順序，各藥品先各自溶解再混合，但結(jié)果仍有沉淀，前后共配三次也未改變。不知原因出現(xiàn)在何處。由于觀察發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌一開(kāi)始是從瓶體的沉淀中長(zhǎng)出（沉淀中出現(xiàn)紅褐色），猜想可能光合細(xì)菌需要附著于類似泥的物體上才能生長(zhǎng)。4、在目的菌未進(jìn)行富集之前，做了一次雙層平板劃線，即先在平板上倒一層富集培養(yǎng)基，然后用接種環(huán)劃線，最后再在上面倒一層培養(yǎng)基，結(jié)果底層無(wú)目的菌，表面長(zhǎng)出了雜菌。富集后進(jìn)行混菌法分離，即現(xiàn)在培養(yǎng)皿中加入菌液，然后倒入培養(yǎng)基，結(jié)果在培養(yǎng)基底部長(zhǎng)出很多目的菌，說(shuō)明所取材料中光合細(xì)菌含量不多，不經(jīng)富集難以成為優(yōu)勢(shì)種，或說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)中混菌法分離比雙層平板法有效。6、穿刺分離法的效果很好，采用此法得到了非常干凈的紅色目的菌落，穿刺路徑呈紅色，為光合細(xì)菌，下面分布很多小菌落，無(wú)任何雜菌長(zhǎng)出。5、整個(gè)操作過(guò)程中都要在無(wú)菌條件下進(jìn)行，要么在酒精燈旁操作，要么在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，且每次接菌前都應(yīng)將灼燒接種環(huán)或接種針，避免雜菌污染，這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【1】 董艷珍，陳碧華，肖文淵. 一株光合細(xì)菌分離與初步鑒定【J】. 西昌學(xué)院學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2010 年9 月第24 卷第3 期.【2】 席寅峰, 張孟婧, 黃小帥, 郝燕佳. 1株光合細(xì)菌的分離鑒定及其脫氮能力研究【J】. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38( 27) : 14847- 14849, 14875.【