葡萄球菌和鏈球菌的微生物學(xué)檢查.doc

青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 獸 醫(yī)微 生 物 實 驗 報 告 題 目： 葡萄球菌和鏈球菌的分離鑒定 姓 名： 阿芳 學(xué) 院： 動物科技學(xué)院 專 業(yè)： 動物科學(xué) 班 級： 201X級X班 學(xué) 號： （201XXXXX） 指導(dǎo)教師： 任慧英 完成日期 2014年3月22日葡萄球菌和鏈球菌的分離鑒定摘要目的：對實驗提供的A、B兩種細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定。主要方法：通過對細(xì)菌的分離培養(yǎng)，形態(tài)的觀察以及生化反應(yīng)的現(xiàn)象等方法進(jìn)行鑒定。關(guān)鍵詞：葡萄球菌；鏈球菌；分離鑒定引言 源自李一經(jīng).獸醫(yī)微生物學(xué)【M】.北京：高等教育出版社，2011，第五章 病原球菌。葡萄球菌是一群革蘭氏陽性球菌，因常堆聚成葡萄串狀，故名。多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病。葡萄球菌是最常見的化膿性球菌。無鞭毛，無莢膜，不產(chǎn)生芽胞，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，在含有血液和葡萄糖的培養(yǎng)基中生長更佳，需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧。2838均能生長，致病菌最適溫度為37，PH為4.59.8，最適為7.4。在瓊脂平板上形成圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，不透明的菌落。葡萄球菌在血瓊脂平板上形成的菌落較大，有的菌株菌落周圍形成明顯的完全透明溶血環(huán)（溶血），也有不發(fā)生溶血者。多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣。致病性菌株能分解甘露醇。葡萄球菌在自然界中分布很廣，健康禽類的皮膚、羽毛、眼瞼、粘膜、腸道等都有葡萄球菌存在。鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見的細(xì)菌，常排列成鏈狀，無芽胞，無鞭毛，有菌毛樣結(jié)構(gòu)，革蘭氏染色陽性。需氧或兼性厭氧，有些為厭氧菌。營養(yǎng)要求較高。普通培養(yǎng)基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生長。最適溫度37，最適PH7.47.6，血瓊脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、邊緣整齊、直徑0.50.75mm的細(xì)小菌落，不同菌株有不同溶血現(xiàn)象。根據(jù)在血瓊脂培養(yǎng)基上的溶血特征可分為三種不同類型：型溶血性鏈球菌又稱草綠色鏈球菌，菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)，致病力弱。型溶血性鏈球菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血毒素，在血瓊脂培養(yǎng)基上，可使菌落周圍出現(xiàn)寬24毫米、界限分明、無色透明的溶血環(huán)，致病力強(qiáng)。型鏈球菌不溶血。能發(fā)酵簡單的糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。鏈球菌與葡萄球菌不同，不產(chǎn)生過氧化氫酶。廣泛分布于自然界和人及動物糞便和健康人鼻咽部，大多數(shù)不致病。1 材料與方法1.1 材料兩種未知的細(xì)菌分別為A菌、B菌。1.2培養(yǎng)基1.2.1普通瓊脂培養(yǎng)基的制作（1） 稱量：牛肉膏 1克、蛋白胨 2克、NaCl 1克、蒸餾水200毫升于燒杯中。（2） 溶解：攪動，加熱溶解。（3） 調(diào)節(jié)pH值：用NaOH溶液或HCl溶液來進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)pH為7.5。（4） 分裝：將制好的培養(yǎng)基分裝入燒瓶或試管內(nèi)，塞上瓶塞，用牛皮紙包扎瓶口。在121高壓蒸汽滅菌2030min即成。（5） 制作平板:將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入3mm厚度。鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，即可接種。1.2.2血瓊脂培養(yǎng)基的制作（1）兔子心臟取血：取一只兔子，找到心跳最快的位置，先用碘酒棉擦，再用酒精棉擦。垂直于兔子的心臟將已有0.5ml檸檬酸鈉溶液的一次性針管插入，抽取血液到5ml處。（2）制作血平板：按照1.2.1的方法制作普通瓊脂培養(yǎng)液，至不燙手后，向裝有普通瓊脂培養(yǎng)液的錐形瓶里注入3ml,混合均勻。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入3mm厚度。鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，即可接種。1.3細(xì)菌的劃線分離1.3.1平板的用途（1）供分離劃線；分離劃線的目的是為了得到單個菌落，以備進(jìn)一步鑒定。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)，得到更多的菌苔。1.3.2無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種環(huán)等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品菌）于培養(yǎng)基上。1.3.3分區(qū)劃線四個方向用接種環(huán)蛇形分區(qū)劃線，每劃一次之前都要先用酒精燈滅菌，且操作要在無菌環(huán)境下進(jìn)行。2 結(jié)果與分析2.1普通瓊脂平板2.1.1 A、B菌的生長情況如圖1圖12.1.2 A、B菌的生長情況分析葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好。鏈球菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長不良?？梢猿醪綌喽ˋ菌可能為鏈球菌，B均可能為葡萄球菌。2.2血瓊脂平板2.2.1 A、B菌的生長情況如圖2圖22.2.2 A、B菌的生長情況分析葡萄球菌在血瓊脂平板上形成的菌落較大，菌株菌落周圍形成明顯的完全透明溶血環(huán)（溶血），鏈球菌營養(yǎng)要求較高，血瓊脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、邊緣整齊的細(xì)小菌落?？梢猿醪綌喽ˋ菌可能為鏈球菌，B均可能為葡萄球菌。2.3革蘭氏染色 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教程【M】.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，革蘭氏染色原理。 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教程【M】.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，觸酶試驗介紹。2.3.1基本原理革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開。2.3.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘溶液、乙醇（95%）、沙黃水溶液、生理鹽水、香柏油。（2）器材:載玻片、光學(xué)顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈等。2.3.3實驗步驟載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的已滴上生理鹽水的載玻片上涂布均勻，在火焰上稍加熱并使其粘附固定。用草酸銨結(jié)晶紫染12分鐘，水洗。再用革蘭氏碘溶液媒染13分鐘，水洗。 用乙醇（95%）脫色30秒，水洗。最后用沙黃復(fù)染30秒，水洗。在光學(xué)顯微鏡下，用油鏡，鏡檢。2.3.4試驗結(jié)果與分析葡萄球菌和鏈球菌均呈現(xiàn)藍(lán)紫色，都是革蘭氏陽性菌。兩菌試驗結(jié)果見圖3圖32.4觸酶（H2O2）試驗2.4.1基本原理葡萄球菌含有接觸酶（或H2O2），能催化H2O2產(chǎn)生水和初生態(tài)的氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡，而鏈球菌則不能產(chǎn)生氣泡。2.4.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：3% H2O2，即1ml 30% H2O2 加入9ml 蒸餾水中即成。（2）器材:小試管、細(xì)玻棒、接種環(huán)、酒精燈等。2.4.3實驗步驟取2ml 3%H2O2 ,加入干凈的小試管中，用細(xì)玻棒或接種環(huán)分別蘸取A、B兩種試驗菌，插入H2O2液面下，若有氣泡產(chǎn)生著為陽性。2.4.4試驗結(jié)果與分析A菌沒有產(chǎn)生氣泡，觸酶陽性，而B菌產(chǎn)生氣泡。初步斷定A菌為鏈球菌，B菌為葡萄球菌。B菌試驗結(jié)果見圖4 圖42.5凝固酶試驗 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教程【M】.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，凝固酶試驗介紹。2.5.1基本原理致病性葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶。是一種分泌至菌體外的游離凝固酶。作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被血漿中的協(xié)同因子激活變?yōu)槟笜游镔|(zhì)，而使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測出。2.5.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：0.5mL兔血漿、葡萄球菌。（2）器材:小試管、接種環(huán)、酒精燈。2.5.3實驗步驟挑取細(xì)菌菌苔，混懸于1:4稀釋的0.5mL兔血漿與初步確定為的金黃色葡萄球菌混合物中，充分混勻，置361C培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時，查看結(jié)果。2.5.4試驗結(jié)果與分析B菌出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。B菌試驗結(jié)果見圖5圖52.6甘露醇發(fā)酵試驗2.6.1基本原理金黃色葡萄菌發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基變混濁，顏色由紫色變黃色，是為甘露醇發(fā)酵試驗陽性。2.6.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：甘露醇。（2）器材:甘露醇發(fā)酵管、接種環(huán)。2.6.3實驗步驟無菌操作取初步確定為的金黃色葡萄球菌混合物接種于甘露醇發(fā)酵管，密封保存，37培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果。2.6.4試驗結(jié)果與分析B菌使培養(yǎng)基變混濁，顏色由紫色變黃色，是為甘露醇發(fā)酵試驗陽性。B菌試驗結(jié)果見圖6圖63 討論3.1兔子抽血量不夠由于實驗兔子多次使用，產(chǎn)血量跟不上，導(dǎo)致在心臟跳動最快的位置卻抽不出來血。3.2油鏡觀察不到或出現(xiàn)大片染色區(qū)域（1）