野生干蕨菜對亞硝酸鹽清除作用研究 實驗方案.doc

野生干蕨菜對亞硝酸鹽清除作用研究實驗方案2.實驗方案2.1.儀器分光光度計、電子天平、粉碎機、比色皿、移液管、燒杯、棕色容量瓶、三角瓶、恒溫水浴鍋、精密pH值試紙2.2試劑對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸、氨水均為分析純，蒸餾水。對氨基苯磺酸溶液（0.4 %）：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，置棕色瓶中混勻，避光保存；鹽酸萘乙二胺溶液（0.2 %）：稱取0.2g鹽酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混勻后，置棕色瓶中，避光保存；亞硝酸鈉標準溶液：準確稱取0.1000g于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于200g的亞硝酸鈉；亞硝酸鈉標準使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標準溶液5.00ml，置于200ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于5g亞硝酸鈉；O.5mol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=3.0）：取0.1mol/L檸檬酸18.6ml（21.01gm/l），0.1mol/L檸檬酸鈉1.4ml（29.41g/ml）加蒸餾水定容至100ml。鹽酸（0.1mol/l）：量取5ml鹽酸（35%-37%），用水稀釋至600ml。25%氨水；2.3.原料野生干蕨菜。2.4實驗方法2.41. 樣品的制備將干蕨菜粉碎，稱取7份5g蕨菜粉，分別加入7個三角瓶中，各加入30ml蒸餾水，在不同條件（溫度、時間、配比，pH值）下提取，然后用4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液備用。2.42. 最大吸收波長的確定準確吸取5g/ml硝酸鈉標準液7ml置于25ml容量瓶中，加入0.4 %對氨基苯磺酸1.0mL，搖勻，靜置4min，加入0.5mL0.2 %鹽酸萘乙二胺，加水定容至刻度,搖勻，靜置15min。另以蒸餾水代替亞硝酸鈉，用同樣配制方法的溶液作為空白（即參比溶液），做光譜掃描, 測定最大吸收波長。2.43. 標準曲線的繪制分別吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL亞硝酸鈉標準使用液分別置于25ml容量瓶中，加入0.4 %對氨基苯磺酸1.0mL，搖勻,靜置4min，加入0.5mL0.2 %鹽酸萘乙二胺，加蒸餾水定容至刻度,搖勻，靜置15min于最大波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，另以蒸餾水代替亞硝酸鈉，用同樣配制方法的溶液作為空白（即參比溶液）。（R=0.999）2.44 .樣品提取液對亞硝酸鹽的清除能力的測定準確吸取5g/mL NaNO27mL，置于25mL容量瓶中，加入5mL蕨菜提取液，反應(yīng)10min，然后加入0.4%對氨基苯磺酸1mL，搖勻，靜置4min,再加入0.2%鹽酸萘乙二胺0.5mL，搖勻加水定容至25mL，靜置15min，用2cm 比色皿于最大吸收波長處測定吸光度A1；以蒸餾水代替提取液做空白，測得吸光度A2。按下式計算蕨菜提取液對亞硝酸鹽的清除率。清除率（%）=（A2-A1）/A2100%A1加蕨菜汁提取液測得值；A2未加蕨菜汁提取液測得值。2.45. 浸提溫度對清除亞硝酸鹽的影響試驗取在不同溫度（20、30、40、50、60、70、80）水浴下提取液7份5mL于7個25mL容量瓶中，均加入5g/mlNaNO27ml，在室溫下反應(yīng)10min，均加入對氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺定容、顯色，測得在最大吸收波長處的吸光值，試驗重復(fù)三次，計算清除率。表1不同提取溫度對亞硝酸鹽的清除率溫度（）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）20（室溫）3040506070802.46 .蕨菜汁提取液與亞硝酸鹽提取時間試驗取在不同提取時間（0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min）下提取液7份5mL于7個25mL容量瓶中，均加入5g/mlNaNO27ml，在室溫下反應(yīng)10min，均加入對氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺定容、顯色，測得在最大吸收波長處的吸光值，試驗重復(fù)三次，計算清除率。表2不同提取時間對亞硝酸鹽的清除率時間（min）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）03060901201501802.47. 蕨菜汁用量對亞硝酸鹽清除率的影響試驗取在不同提取配比下的提取液（0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml）7份5mL于7個25mL容量瓶中，均加入5g/mlNaNO27ml，在室溫下反應(yīng)10min，均加入對氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺定容、顯色，測得在最大吸收波長處的吸光值，試驗重復(fù)三次，計算清除率。表3不同提取用量對亞硝酸鹽的清除率用量（ml）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）01234562.48.不同pH值對亞硝酸鹽清除試驗取在不同提取pH值（1、2、3、4、5、6、7）下提取液7份5mL于7個25mL容量瓶中，均加入5g/mlNaNO27ml，在室溫下反應(yīng)10min，均加入對氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺定容、顯色，測得在最大吸收波長處的吸光值，試驗重復(fù)三次，計算清除率。表4不同提取pH對亞硝酸鹽的清除率pHA1(n=3)A2(n=3)清除率（%）12345672.4.9.最佳清除條 以提取溫度、提取時間、提取液用量、提取PH值,做L9（34）正交試驗，確定最佳清除條件。表5 L9(34)正交試驗結(jié)果分析試驗號 A B C D 清除率%111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3123 R2.5.模擬胃液條件下亞硝酸鹽NaNO2消除反應(yīng)取O.5molL檸檬酸鈉-HC1緩沖液