第02章 色譜分析法導(dǎo)論-P7.doc

第二章色譜分析法導(dǎo)論第一節(jié) 色譜法概述一、 色譜法的特點(diǎn)、分類和作用 1.概述 混合物最有效的分離、分析方法。色譜法是一種分離技術(shù)， 俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。 試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。 兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2.色譜法分類 (1)氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。 按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜； 按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜(2)液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液）。 按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。 離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動(dòng)相。(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜： 比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：測聚合物分子量分布。超臨界色譜: CO2流動(dòng)相。高效毛細(xì)管電泳: 九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。3.色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2） 靈敏度高 可以檢測出g.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3） 分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4） 應(yīng)用范圍廣 氣相色譜：沸點(diǎn)低于400的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。 液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。 不足之處： 被分離組分的定性較為困難。二、色譜分離過程色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的。填充柱色譜: 氣固(液固)色譜和氣液(液液)色譜，兩者的分離機(jī)理不同。氣固(液固)色譜的固定相: 多孔性的固體吸附劑顆粒。 固體吸附劑對(duì)試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液(液液)色譜的固定相: 由 擔(dān)體和固定液所組成。 固定液對(duì)試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機(jī)理: 吸附與脫附的不斷重復(fù)過程；氣液色譜的分離機(jī)理： 氣液(液液)兩相間的反復(fù)多次分配過程。1. 氣相色譜分離過程 當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時(shí)，被固定相溶解或吸附; 隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附; 揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相溶解或吸附; 隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。2. 分配系數(shù)（ partion factor） K組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，用K 表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù) K 的討論 一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢； 試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)； 每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同； 選擇適宜的固定相可改善分離效果； 試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)； 某組分的K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。3.分配比 （partion radio）k在實(shí)際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：分配比也稱： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)；分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長。 分配比可以由實(shí)驗(yàn)測得。4. 容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系 右式中為相比。 填充柱相比：635；毛細(xì)管柱的相比：501500。 容量因子越大，保留時(shí)間越長。 VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積； VS為固定相體積，對(duì)不同類型色譜柱， VS的含義不同； 氣-液色譜柱： VS為固定液體積； 氣-固色譜柱： VS為吸附劑表面容量；5. 分配比與保留時(shí)間的關(guān)系 滯留因子（retardation factor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示：若組分和流動(dòng)相通過長度為L的分離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得： tR = tM(1+k)三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線 無試樣通過檢測器時(shí)，檢測到的信號(hào)即為基線。2.保留值 （1）時(shí)間表示的保留值 保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間； 調(diào)整保留時(shí)間（tR ）：tR= tRtM （2）用體積表示的保留值保留體積（VR）： VR = tRF0F0為柱出口處的載氣流量，單位：m L / min。 死體積（VM）： VM = tM F0調(diào)整保留體積(VR)： V R = VR VM 3. 相對(duì)保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。4. 區(qū)域?qū)挾扔脕砗饬可V峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度 Y1/2 =2.354 s（3）峰底寬(Wb)：Wb=4 s第二節(jié) 色譜理論基礎(chǔ)色譜理論色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；一、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)1.塔板理論（plate theory）半經(jīng)驗(yàn)理論； 將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；塔板理論的假設(shè)： (1) 在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到； (2) 將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過程； (3) 試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略； (4) 每次分配的分配系數(shù)相同。色譜柱長：L，理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為： 虛擬的塔板間距離：H， 色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：n = L / H 注意：保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配!2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。 用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：有效塔板數(shù)與理論塔板數(shù)的關(guān)系n有效=n理論k/(1+k)23.塔板理論的特點(diǎn)和不足(1)當(dāng)色譜柱長度一定，塔板數(shù) n 越大(板高H 越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。二、 速率理論-影響柱效的因素1. 速率方程（也稱范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度， u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效； 存在著最佳流速； A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？A渦流擴(kuò)散項(xiàng)A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。B/u 分子擴(kuò)散項(xiàng)B = 2 Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，1。 Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H(n)，分離變差; (3) 分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速，滯留時(shí)間，擴(kuò)散; (4) 擴(kuò)散系數(shù)：Dg (M載氣)-1/2 ； M載氣，B值。Cu 傳質(zhì)阻力項(xiàng)C =（Cg + CL）傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即： k為容量因子； Dg 、DL為擴(kuò)散系數(shù)。 減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。2.載氣流速與柱效最佳流速載氣流速高時(shí)： 傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時(shí)： 分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速,柱效 。H - u曲線與最佳流速：由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。氣相與液相色譜的區(qū)別（1）. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素（2）.流速流速大于0.5 cm/s時(shí), Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。（3）.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。3. 速率理論的要點(diǎn)(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。(4) 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。三、 分離度塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。 難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素； 區(qū)域?qū)挾壬V過程的動(dòng)力學(xué)因素。 色譜分離中的四種情況如右圖所示：色譜分離中的四種情況的討論： 柱效較高，K(分配系數(shù))較大,完全分離； K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；柱效較低，K較大,但分離的不好； K小，柱效低，分離效果更差。分離度的表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：討論：（1）分離度與柱效 分離度與柱效的平方根成正比， r21一定時(shí)，增加柱效，可提高分離度，但組分保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長。（2）分離度與r21 增大r21是提高分離度的最有效方法，計(jì)算可知，在相同分離度下，當(dāng)r21增加一倍，需要的n有效 減小10000倍。 增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。分配比對(duì)分離度的影響（3）k大，R大方法：改變柱溫； 改變相比例題1：在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5 。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1 cm，柱長是多少？解： r21= 100 / 85 = 1.18 n有效 = 16R2 r21 / (r21 1) 2 = 161.52 (1.18 / 0.18 ) 2 = 1547（塊） L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 155 cm 即柱長為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。例題2在一定條件下，兩個(gè)組分的保留時(shí)間分別為12.2s和12.8s，計(jì)算分離度。要達(dá)到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長。解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？第三節(jié)色譜定性、定量分析一、色譜定性鑒定方法1.利用純物質(zhì)定性的方法 利用保留值定性：通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。 利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。2.利用文獻(xiàn)保留值定性利用相對(duì)保留值r21定性 相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。3.保留指數(shù)又稱Kovats指數(shù)()，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法： 將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。 其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z1個(gè)碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：保留指數(shù)計(jì)算方法4.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法小型化的臺(tái)式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS） 色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定二、 色譜定量分析方法1. 峰面積的測量 （1）峰高（h）乘半峰寬（Y 1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實(shí)際峰面積的0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對(duì)稱時(shí)，可在峰高0.15和0.85處分別測定峰寬，由下式計(jì)算峰面積： A =