實驗1DNA提取純化檢測-jgh.ppt

實驗一真核細胞染色體DNA的分離 純化和檢測 實驗目的 通過實驗學習從血液中制備染色體DNA的方法 學習瓊脂糖凝膠電泳 檢測DNA的純度 DNA的構型 含量以及分子量的大小 掌握DNA樣品的純化和定量檢測方法 紅細胞裂解液裂解紅細胞細胞裂解液裂解白細胞用蛋白酶K水解蛋白質有機溶劑酚 氯仿抽提在高鹽條件下 用乙醇沉淀DNA再用70 乙醇洗除沉淀中的鹽分即可獲得染色體DNA 基因組提取實驗原理 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時 有電荷效應與分子篩效應 前者由分子所帶凈電荷量的多少而定 后者則主要與分子大小及其構型有關 DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷 在電場中向正極移動 在用電泳法測定DNA分子大小時 應當盡量減少電荷效應 增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應 使分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度的差異所決定 提高分辨率 同時適當減低電泳時的電壓 也可使分子篩效應相對增加而提高分辨率 瓊脂糖凝膠電泳實驗原理 純凈的DNAA260 A280 1 8 制備的DNA樣品應該為1 7 1 8純凈的RNAA260 A280 2 0 制備的RNA樣品應該大于2 0如果制備的DNA樣品A260 A2802 說明樣品中RNA過高 可用RNase消化后 用酚 氯仿 異戊醇抽提 再用乙醇沉淀DNA 如果樣品A260 A280為1 8 2 0 說明樣品中鹽的含量過高 樣品沉淀后應用70 乙醇多洗一遍 提取的RNA樣品A260 A280應大于1 80 RNA樣品含有蛋白質會使A260 A280比值下降 DNA濃度測定實驗原理 實驗材料 紅細胞裂解液KHCO31g 10mM NH4Cl8 3g 155mM EDTA Na237mg 0 1mM 裂解緩沖液 lysisbuffer 10mMTris Cl pH8 0 0 1MEDTA pH8 0 0 5 m v SDSACD抗凝液檸檬酸0 48g檸檬酸鈉1 32g右旋葡萄糖1 47g加水至100ml 使用時每6ml新鮮血液加1mlACD液組織細胞動物血液樣品 將20ml新鮮血液與3 5mlACD抗凝液混勻 0 下保存數(shù)天或 70 下長期凍存 備用 酚 氯仿 異戊醇 25 24 1 70 乙醇TEbufferRNAse瓊脂糖TAE電泳緩沖液電泳設備紫外分光光度計凝膠成像系統(tǒng) 實驗材料 染色體DNA的制備方法 1 取800 l抗凝血液置于5ml離心管中 2 往管中加3ml紅細胞裂解液 輕搖數(shù)次 置冰上5分鐘 期間間歇搖動幾次 3 4000rpm 室溫離心5分鐘 棄上清 4 往管中加入3ml紅細胞裂解液 重懸沉淀 冰上5分鐘 期間搖幾次 5 4000rpm 離心5分鐘 棄上清 6 重復步驟4 5四至五遍 至出現(xiàn)明顯白色沉淀 將殘余紅細胞棄去 留下白色沉淀 7 用1 PBS3ml洗滌所得沉淀 8 4000rpm 離心5分鐘 棄上清 9 每管中加入500 l白細胞裂解緩沖液 每小組配制1ml 重懸細胞 加入20 lproteinaseK 20mg ml 混勻后轉移至1 5ml離心管 置55 水浴1小時 10 加入酚 氯仿500 l 混勻后10000rpm 離心5分鐘 取上清 至1 5ml離心管 加入氯仿500 l 混勻后10000rpm 離心5分鐘 取上清至5ml離心管 兩次取上清前用剪刀將槍頭尖剪去3mm 11 加入1ml無水乙醇 輕輕混勻可見DNA凝集 12 12000rpm 離心2分鐘 棄上清 13 用1ml70 乙醇洗滌沉淀 12000rpm 離心2分鐘 棄上清 14 開蓋室溫干燥沉淀5分鐘 15 加入30 lDDW 無菌水 溶解DNA 取10 l電泳 16 加入3mlDDW至剩余樣品中 測OD260和0D280 計算DNA濃度及OD260 0D280 染色體DNA的制備方法 瓊脂糖凝膠電泳方法 1 選擇合適的電泳儀和水平式電泳槽 調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平 檢查穩(wěn)壓電源與正負極的線路 2 將電泳板置于制膠器中或用玻璃膠帶封好制膠板兩端 防止?jié)舶鍟r出現(xiàn)滲漏 選擇孔徑大小適宜的點樣梳 垂直架在電泳板負極的一端 使點樣梳底部電泳板水平面的距離為0 5 1 0mm 3 制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA分子的大小 決定凝膠中瓊脂糖的百分含量 稱取瓊脂糖 溶解在電泳緩沖液中 大電泳槽約160毫升 小電泳槽約35毫升凝膠液 置微波爐或水浴鍋中加熱 至瓊脂糖全部溶化 4 待凝膠溶液冷至50 左右時 在凝膠溶液中加入EB 終濃度0 5 g ml 搖勻 輕輕倒入電泳板上 除去氣泡 5 待凝膠冷卻凝固后 約30分鐘 在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液 大電泳槽約需1200ml 小電泳槽約180ml 從制膠器取出電泳板 放入電泳槽 然后小心取出點樣梳 保持點樣孔的完好 去除空內(nèi)氣泡 6 待測的DNA樣品中 加五分之一體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液 6 loadingBuffer 如果待測樣品太小要用電泳緩沖液稀釋 再加五分之一體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液 如點樣體積10 l樣品與2 l溴酚藍指示劑點樣緩沖液 混勻后小心地進行點樣 記錄點樣順序和點樣量 7 打開電源 DNA的遷移速度與電壓成正比 與瓊脂糖含量有關 最高電壓不超過5V cm 大電泳槽不超過200V 小電泳槽不超過150V 8 電泳時間看實驗的具體要求而定 在電泳途中可用紫外燈直接觀察 DNA各條條帶分開后 可以結束電泳 一般20分鐘 2小時 取電泳凝膠塊直接用凝膠成像系統(tǒng)成像和分析 瓊脂糖凝膠電泳方法 DNA樣品的純化和定量檢測方法 1 取DNA粗制樣品 加入RNase至終濃度10 g l 37 反應0 5小時 2 加入酚 氯仿 異戊醇 25 4 1 等體積抽提1 3次 12000rpm 離心5分鐘 取上清 3 加入1 10倍體積3MNaAc pH5 2 2倍體積無水乙醇混勻 室溫下30 60min 4 15000rpm 離心10分鐘 5 DNA沉淀用冰預冷70 乙醇洗1次 開蓋37 干燥10min 使乙醇揮發(fā) 6 加入30 lTEbuffer 37 水浴至沉淀溶解 7 取10 lDNA1 瓊脂糖凝膠電泳 凝膠成像系統(tǒng)記錄和分析結果 估計樣品DNA分子量 8 取10 lDNA母液稀釋至1000ul 在紫外分光光度計上測A260和A280 計算樣品DNA濃度 判斷樣品濃度和DNA純度 DNA制備注意事項 1 如要11步中完整的DNA 在12步時 挑出DNA沉淀 用70 乙醇洗滌1 2次 2 步驟2 4 7中要顛倒搖動試管懸浮沉淀 不可用槍頭 尤其是沒剪去槍頭尖端 吹打沉淀 3 步驟10中吸上清槍頭使用前必須粗吸頭 微量移液槍的槍頭剪去尖端 并用火燒一下 使之圓鈍 避免機械剪切力對DNA鏈的損傷 4 為了獲得高分子量的DNA 操作中必須防止混勻 抽提及沉淀時劇烈機械震蕩造成的DNA的斷裂 5 如含有RNA 可用100ng ml的RNase在37 水解半小時 對于新血液 取ACD或EDTA抗凝 10ml全血中加3 3mlACD或1mlEDTA 電泳注意事項 1 瓊脂糖的質量 瓊脂糖 agarose 是以質量較好的瓊脂作原料制成的 瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物 瓊脂膠是一種含有硫酸根和羥基的多糖 它具有離子交換性質 這種性質將給電泳帶來電滲作用的不良影響 因而必須去除干凈 所謂瓊脂糖的質量不過關就是瓊脂糖內(nèi)含有較高比例的瓊脂膠 瓊脂糖是一種直鏈多糖 它由D 半乳糖和3 6 脫水 L 半乳糖的殘基交替排列組成的線性多聚糖 由于鏈狀瓊脂糖分子相互以氫鍵交聯(lián) 因此與瓊脂一樣能形成凝膠 瓊脂糖帶有親水性 不含有帶電荷的基因 不引起DNA變性 又不吸附被分離的物質 因此它是一種很好的凝膠劑 2 DNA分子的遷移率 影響DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的 除了決定于DNA分子大小與構型外 還有瓊脂糖的濃度 電壓大小 緩沖液pH值和電泳時的溫度等 為了精確測定其分子量的大小 采用一下措施 1 每次測定時 要有已知分子量的DNA片段作為標準 進行對照 電泳 2 選擇最合適的電泳條件 3 提高分子篩效應 降低電荷效應 電泳注意事項 3 EB染色 EB是核酸的顯色劑 使用EB對DNA染色的3種方法 1 在制膠中與電泳緩沖液中同時加入EB 2 只在膠中加入EB 在電泳緩沖液中不加 這樣可減少操作時雙手受EB污染的可能 3 在電泳結束后 取出凝膠 放在含有EB的電泳緩沖液或DDW中浸染10 30分鐘 4 溴酚藍指示劑緩沖溶液的作用 含有50 蔗糖 可增加上樣DNA溶液的密度 以確保DNA樣品沉入點樣孔內(nèi) 起DNA電泳時的前沿指示劑作用 一般溴酚藍的電泳遷移位置相當于300 400bp雙鏈線狀DNA 5 點樣量太高易產(chǎn)生拖尾與彌散現(xiàn)象 樣品遷移速度減慢 點樣量太少 分辨不清 影響結果 6 EB為強誘變劑 劇毒 操作時要帶一次性手套 并在專區(qū)間操作 用過的手套要及時將手套順手翻過來 讓有EB的面朝里 有EB的廢液和器皿不能隨便丟棄 要用