蛋白質的性質及分離分析技術.ppt

第六節(jié)蛋白質的性質及分離分析技術 蛋白質的理化性質 一 兩性性質及等電點二 膠體性質三 變性與復性作用四 蛋白質的沉淀作用五 沉降作用六 蛋白質的顏色反應七 蛋白質的紫外吸收性質 一 蛋白質的兩性解離與等電點 蛋白質分子中氨基酸殘基的側鏈上存在游離的氨基和羧基 因此蛋白質與氨基酸一樣具有兩性解離性質 具有特定的等電點 pI 溶液pH pI時 蛋白質所帶正負電荷相等 pH pI時 蛋白質帶凈負電荷 pH pI時 蛋白質帶凈正電荷 等電點時特點 1 凈電荷為零 2 一定離子強度的緩沖液 等離子點特征常數(shù) 3 多數(shù)蛋白質在水中等電點偏酸堿性AA 酸性AA等電點胃蛋白酶0 21 0血紅蛋白1 76 7細胞色素C2 910 7菊糖酶0 348 2 4 導電性 溶解度 黏度及滲透壓都最小 等電沉淀和蛋白電泳 遷移率與凈電荷量 分子大小 分子形狀等有關 帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳 electrophoresis 電泳 What selectrophoresis 一 蛋白質的兩性解離與等電點 蛋白質分子在一定pH的溶液中可帶凈的負電荷或正電荷 故可在電場中發(fā)生移動 不同蛋白質分子所帶電荷量不同 且分子大小也不同 故在電場中的移動速度也不同 據(jù)此可互相分離 一 蛋白質的兩性解離與等電點 二 蛋白質的膠體性質 蛋白質分子的顆粒直徑已達1 100nm 處于膠體顆粒的范圍 親水膠體 蛋白質具有膠體溶液的性質 布朗運動 丁道爾現(xiàn)象 不能透過半透膜 具有吸附力等 1 蛋白質具有膠體溶液的性質 二 蛋白質的膠體性質 2 穩(wěn)定蛋白質親水溶膠的兩個重要因素 水化膜 通過氫鍵與水結合表面電荷 在非等電點狀態(tài)下 雙電層 帶同性電荷蛋白質分子互相排斥 蛋白質顆粒的表面電荷和水化膜 3 蛋白質凝膠凝膠作用 蛋白質顆粒周圍的水膜是不均勻 使它們以一定的部位結合形成長鏈 這些長鏈又彼此結合成為復雜的網(wǎng)狀結構的凝膠體 溶膠 蛋白質作為分散相 水為連續(xù)相形成的溶液 凝膠 蛋白質為連續(xù)相 水為分散相形成的網(wǎng)狀凝膠體 二 蛋白質的膠體性質 3 蛋白質凝膠凝膠具有脹潤作用 分類 1 可逆性凝膠 2 不可逆性凝膠部分破壞水化膜 適當加熱和遠離等電點4 蛋白質膠體性質的應用滲析 透析 超濾 二 蛋白質的膠體性質 三 蛋白質的變性 復性與凝固作用 在某些物理或化學因素的作用下 蛋白質嚴格的空間結構被破壞 肽鍵不斷裂 一級結構不變 從而引起蛋白質若干理化性質和生物學性質的改變 稱為蛋白質的變性 denaturation What sdenaturationofprotein 1 變性理論蛋白質的變性就是天然蛋白質分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式 2 引起蛋白質變性的因素 物理因素 高溫 高壓 紫外線 電離輻射 超聲波 機械攪拌 化學因素 強酸 強堿 有機溶劑 尿素 胍 重金屬鹽等 變性的因素及作用機制 物理性質 旋光性改變 溶解度下降 結晶能力下降 沉降率升高 粘度升高 光吸收度增加等 化學性質 官能團反應性增加 呈色反應增強 易被蛋白酶水解 生物學性質 原有生物學活性喪失 抗原性改變 變性蛋白質的性質改變 蛋白質變性的可逆性 復性 某些蛋白質變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結構 并恢復原來部分理化特性和生物學活性 這個過程稱為蛋白質的復性 renaturation 蛋白質變性的可逆性與復性 蛋白質在體外變性后 絕大多數(shù)情況下不能復性 如變性程度淺 蛋白質分子的構象未被嚴重破壞 或蛋白質具有特殊的分子結構 并經(jīng)特殊處理則可以復性 核糖核酸酶的變性與復性 天然構象 蛋白質變性的可逆性與復性 可逆變性 變性條件除去后仍可恢復天然狀態(tài)的變性 不可逆變性 變性條件除去后不能恢復天然狀態(tài)的變性 蛋白質的熱變性與凝固作用 1 熱變性熱變性的定義熱變性三個階段影響熱變性的因素 溫度 砂糖 H 濃度 蛋白質含水量 電解質 蛋白質的熱變性與凝固作用 2 蛋白質的凝固作用天然蛋白質變性后 變性蛋白質分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質的凝固 coagulation 凝固作用分兩個階段 首先是變性 其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結絮 蛋白質變性的應用 理論上 研究蛋白質分子結構與功能 分子量測定 亞單位拆分 生產(chǎn)生活中有利的一面 食品加工 消毒滅菌等 非蛋白生物物質提取純化 終止酶促反應 生產(chǎn)生活中不利的一面 活性蛋白制品 酶 抗體 的分離提取和保存 外加一些因素去除蛋白質膠體的穩(wěn)定因素后 使蛋白質分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀 precipitation 1 What sprecipitationofprotein 變性后的蛋白質由于疏水基團的暴露而易于沉淀 但沉淀的蛋白質不一定都是變性后的蛋白質 四 蛋白質的沉淀作用 2 沉淀種類 可逆與不可逆 四 蛋白質的沉淀作用 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質失去生物活性的沉淀方法 2 沉淀種類 可逆與不可逆 四 蛋白質的沉淀作用 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 1 鹽析 中性鹽沉淀法 2 有機溶劑沉淀法 3 酸沉淀法 1 鹽析 中性鹽沉淀 鹽溶作用鹽析作用 What ssaltprecipitationofprotein 蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 1 鹽析 中性鹽沉淀 定義 在蛋白質溶液中加入大量中性鹽 以破壞蛋白質的膠體性質 使蛋白質從溶液中沉淀析出 稱為鹽析 saltprecipitation 作用機制 中和電荷的同時破壞水化膜 What ssaltprecipitationofprotein 蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 常用的中性鹽 硫酸銨 氯化鈉 硫酸鈉等 鹽析時 pH在蛋白質的等電點處效果最好 鹽析沉淀蛋白質通常不會引起蛋白質的變性 優(yōu)點鹽析應用舉例 1 鹽析 中性鹽沉淀 蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 分段鹽析 半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿球蛋白 而飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的血漿清蛋白 因此 使用不同濃度的硫酸銨溶液就可將分子量不同的蛋白質進行初步分離 1 鹽析 中性鹽沉淀 凡能與水以任意比例混合的有機溶劑 如乙醇 甲醇 丙酮等 均可用于沉淀蛋白質 沉淀原理 脫水作用 破壞水化膜 使水的介電常數(shù)降低 蛋白質溶解度降低 2 有機溶劑沉淀法 蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 處理條件 低溫操作 沉淀完全后盡快分離 2 有機溶劑沉淀法 蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法 機制 破壞電荷 等電點沉淀 3 酸沉淀法 1 重金屬鹽沉淀法 2 生物堿試劑沉淀法 除蛋白作用 3 熱凝固沉淀法 4 抗體對抗原蛋白質的沉淀 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質失去生物活性的沉淀方法 四 蛋白質的沉淀作用 沉降的概念沉降速率 v dx dt沉降常數(shù)與單位應用 沉降速度法測定分子量的原理 梯度離心分離蛋白質 氯化銫 五 蛋白質的沉降作用 六 蛋白質的顏色反應 1 雙縮脲反應2 茚三酮反應3 考馬斯亮藍G2504 福林酚試劑反應5 黃色反應 芳香族氨基酸的特有反應6 米倫氏反應 酪氨酸的特有反應7 乙醛酸反應 色氨酸的特有反應8 坂口反應 精氨酸特有的反應 六 蛋白質的顏色反應 1 雙縮脲反應 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用 生成粉紅色復合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物 能發(fā)生同樣反應肽鍵的反應 肽鍵越多顏色越深 粉紅 紫紅 藍紫受蛋白質特異性影響小蛋白質定量測定 測定蛋白質水解程度 六 蛋白質的顏色反應 2 茚三酮反應靈敏度差 3 考馬斯亮藍G 250本身為棕色 與蛋白質反應呈藍色與蛋白的親和力強 靈敏度高1 1000微克 毫升 六 蛋白質的顏色反應 4 福林酚試劑反應酪氨酸 色氨酸的反應 還原反應 福林試劑 磷鉬酸 磷鎢酸與雙縮脲法結合 Lowry法在堿性條件下 蛋白質與硫酸銅發(fā)生反應蛋白質 銅絡合物 將福林試劑還原 產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍混合物靈敏度提高100倍 六 蛋白質的顏色反應 5 黃色反應 芳香族氨基酸的特有反應濃硝酸與酪氨酸 色氨酸的反應生成黃色化合物指甲 皮膚 毛發(fā) 6 米倫氏反應 酪氨酸的特有反應酪氨酸的顯色反應 酚羥基反應 米倫試劑為硝酸 亞硝酸 硝酸汞 亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中 加入米倫試劑 產(chǎn)生白色沉淀 加熱后變成紅色 六 蛋白質的顏色反應 7 乙醛酸反應 色氨酸的特有反應在蛋白質溶液中加入HCOCOOH 將濃硫酸沿管壁緩慢加入 不使相混 在液面交界處 即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應 吲哚環(huán)的反應 鑒定蛋白質中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸 六 蛋白質的顏色反應 8 坂口反應 精氨酸特有的反應精氨酸的反應 胍基的反應 精氨酸與 萘酚在堿性次氯酸鈉 或次溴酸鈉 溶液中發(fā)生反應 產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質中是否含有精氨酸定量測定精氨酸 七 蛋白質的紫外吸收性質 大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸 這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收 因此 大多數(shù)蛋白質在280nm附近顯示強的吸收 可以對蛋白質進行定性和定量檢測 蛋白質濃度 mg ml 1 45A280 0 74A260 蛋白質的分離純化 一 分離純化的基本方法 1 鹽析與等電點沉淀 根據(jù)溶解度不同分離2 層析法離子交換層析法 根據(jù)電荷不同分離凝膠過濾法 根據(jù)分子量 分子形狀不同分離親和層析 根據(jù)特異性親和力不同分離3 梯度離心法 2 層析 層析 chromatography 是一種利用混合物中各組分理化性質的差異 在相互接觸的兩相 固定相與流動相 之間的分布不同而進行分離分析的技術方法 What schromatography 主