嶗山奶山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)分析.doc

嶗山奶山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)分析戈新1,李培培1，李成渤2，王建華1，張寶珣1,王建民2基金項(xiàng)目：青島市科技局項(xiàng)目(06-2-2-17-jch)作者簡(jiǎn)介：戈新(1957-)，男，研究員，主要從事動(dòng)物生產(chǎn)與繁育研究。 *通訊作者：王建民，教授，E-mail：。(1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島266100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)摘要：利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)嶗山奶山羊群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，通過每世代有效遷移個(gè)體數(shù)(Nm)、遺傳距離、F-統(tǒng)計(jì)量以及瓶頸效應(yīng)分析等，判斷嶗山奶山羊群體目前的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：嶗山奶山羊群體的多態(tài)信息含量在0.41800.8019之間，群體平均雜合度為0.7035，群體內(nèi)近交系數(shù)為38.8%，文登奶山羊與嶗山群體的分化系數(shù)最大，達(dá)0.1077，遺傳距離最大(0.3335)。瓶頸效應(yīng)分析表明：嶗山奶山羊在無限等位基因模型(IAM)下，沒有明顯的雜合度過剩現(xiàn)象；在逐步突變模型(SMM)下，平均雜合度為0.765，擁有顯著的雜合度過剩座位數(shù)，推斷其有效群體大小近幾十年來明顯下降，上述研究結(jié)果對(duì)于嶗山奶山羊的保種和開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；嶗山奶山羊；遺傳結(jié)構(gòu)嶗山奶山羊是我國優(yōu)良的奶山羊品種之一，具有體軀大、產(chǎn)奶量高、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，1989年列入中國羊品種志1，并以優(yōu)良的產(chǎn)奶性能享譽(yù)世界。但是近年來，由于國外品種的大量引進(jìn)和產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)形勢(shì)的影響，嶗山奶山羊的生存空間縮小，數(shù)量急劇下降，為防止品種資源滅絕、混雜和優(yōu)良基因丟失，開展嶗山奶山羊的保種研究工作迫在眉睫。品種資源保護(hù)的首要前提是獲得該品種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)信息，該信息不僅對(duì)研究群體遺傳變異、探討品種起源與系統(tǒng)地位具有重要意義，而且可以為品種分類及品種改良提供重要資料，并可探討品種瀕危的原因和現(xiàn)狀，為品種資源保護(hù)、開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)2。因此，應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記開展群體遺傳結(jié)構(gòu)研究受到廣泛重視，已經(jīng)成為家畜遺傳資源研究的主要內(nèi)容之一。1 材料與方法1.1材料 以簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法，在青島市城陽區(qū)、即墨市、嶗山區(qū)分別抽取具有獨(dú)立血統(tǒng)的嶗山奶山羊42、21、33只，文登市抽取文登奶山羊33只，頸靜脈采血，ACD抗凝，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-20保存?zhèn)溆谩?.2 方法1.2.1微衛(wèi)星座位的選取選擇5對(duì)微衛(wèi)星引物，引物序列見。由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.2 模板DNA提取苯酚-氯仿/異戊醇法提取基因組DNA，溶于適量TE，-20保存?zhèn)溆?。1.2.3 PCR反應(yīng)體系及程序 PCR反應(yīng)體系為20l：Mg2+(2.5mmol/L) 1.251.5l，10loading buffer 2l，dNTPs (2.5mmol/L) 1.6l，上下游引物(50mol/L)各0.8l，Taq酶(5U) 0.2l，DNA模板0.8l，加三蒸水至終體積20l。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5預(yù)變性10min；94變性30s，56.763退火30s，72延伸30s，2935個(gè)循環(huán)；72延伸10min，4保存。1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及基因型判斷 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離產(chǎn)物，四硼酸鈉顯色法顯色，JUNYI 凝膠成像系統(tǒng)拍照，Gel-Analysis軟件分析基因片段的分子量。1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 Popgene(Version1.3.1)計(jì)算觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)；Molkin(Version3.0)4計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)、標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。使用MEGA(Version3.1)軟件按照NJ(鄰接法)聚類5。FSTAT (Version 2.9.3)計(jì)算F-統(tǒng)計(jì)量6。群體每代遷移數(shù)(Nm)計(jì)算公式：其中Fst為群體間基因分化系數(shù)。瓶頸效應(yīng)分析：根據(jù)微衛(wèi)星座位的等位基因頻率，用BOTTLENECK程序，計(jì)算各微衛(wèi)星座位在突變-漂變平衡(mutation-drift equilibrium)假設(shè)下的期望雜合度和在無限等位基因模型(Infinite Allele Model, IAM)、逐步突變模型(Stepwise Mutation Model, SMM)下的平均雜合度(Hei和Hes)。用sign test 和standardized differences test7檢驗(yàn)嶗山奶山羊群體是否存在顯著數(shù)目的雜合度過剩座位，從而對(duì)該群體近期是否經(jīng)歷過瓶頸事件和有效群體數(shù)量減少進(jìn)行判斷。2 結(jié)果與分析2.1群體內(nèi)遺傳多樣性 等位基因組成是長期進(jìn)化的產(chǎn)物，有效等位基因數(shù)是用來度量群體遺傳多樣性的指標(biāo)。本研究中，5個(gè)微衛(wèi)星座位在129只嶗山奶山羊中共檢測(cè)到44個(gè)等位基因，平均每個(gè)基因座檢測(cè)到8.80個(gè)等位基因，有效等位基因數(shù)在2.04508.4796之間，平均值為4.8151，基因頻率的差異，導(dǎo)致有效等位基因數(shù)目和實(shí)際檢測(cè)到的等位基因數(shù)目有差異。雜合度反映群體在多個(gè)座位上的遺傳變異，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)8，分觀察雜合度和期望雜合度，兩者越接近，表明該品種受外來選擇及近交等因素的影響較小，群體處于遺傳平衡狀態(tài)。從表1看出，5個(gè)座位的觀察雜合度在0.24370.7360之間，平均值為0.4332。觀察雜合度遠(yuǎn)低于期望雜合度，可能因?yàn)槠贩N數(shù)量的不斷減少，導(dǎo)致不同程度的近交，從而使等位基因純合的機(jī)率增加，品種雜合度降低。PIC是等位基因頻率和等位基因數(shù)變化的函數(shù)。用PIC描述群體在微衛(wèi)星座位上的遺傳變異程度，PIC值越大，說明群體內(nèi)基因一致性差，變異越大，選擇潛力也大；反之，PIC越小，說明群體變異性越小，選擇潛力也小。從表1中看出：5個(gè)座位的PIC值在0.41820.8728之間，平均值為0.7016。除BMS812為中度多態(tài)外，其余皆為高度多態(tài)。表1 嶗山奶山羊群體內(nèi)遺傳多樣性Table 1 Genentic diversity within population of Laoshan milk goatLocusNaNeHoHePICBM1438.005.76680.31750.82990.8019BM3025.003.39740.77950.70840.7594BM13297.002.70030.54690.63210.6522BMS8126.002.03760.44530.51120.4180CSSM6613.005.95900.24170.83570.8723Mean7.803.97720.46620.70350.70082.2 F-統(tǒng)計(jì)量 Wright提出的3個(gè)固定指數(shù)Fis、Fst和Fit均是反映群體近交程度或群體間遺傳分化的指標(biāo)，其值越大，表示偏離Hardy-Weinberg平衡程度越明顯，各亞群間遺傳分化越大9。Fis是亞群內(nèi)個(gè)體間由于非隨機(jī)交配而導(dǎo)致亞群內(nèi)雜合度的缺乏，也稱為群體內(nèi)近交系數(shù)；Fst是反映各亞群內(nèi)平均雜合度與總?cè)后w平均雜合度的差異程度，其值越大，表明各亞群間遺傳分化越明顯。Fit則反映總?cè)后w雜合度的缺乏程度，也稱為總?cè)后w的近交系數(shù)。F-統(tǒng)計(jì)量結(jié)果見表2，群體內(nèi)近交系數(shù)為38.8%，表明群體內(nèi)近交嚴(yán)重，群體間基因分化系數(shù)為6.1%，表明群體間分化程度較小。表2 F-統(tǒng)計(jì)量結(jié)果和5個(gè)微衛(wèi)星座位的期望雜合度Table2 The result of F-statistic and expected heterozygosities for 5 microsatellites in Laoshan Milk GoatLocusFisFstFitHeiHesBM1430.5670.1200.6190.6550.795BM3020.0590.0060.0650.4930.664BM13290.3570.0910.4150.6030.760BMS8120.1110.0280.1360.5590.724CSSM660.7180.0500.7320.7890.882Mean0.3880.0610.4260.6200.765注：Fis為群體內(nèi)近交系數(shù)；Fst為群體間基因分化系數(shù)；Fit為群體總近交系數(shù)；Hei為IAM模型下的期望雜合度；Hes為SMM模型下的期望雜合度。2.3基因流和遺傳距離 4個(gè)群體間遺傳分化程度見表3。嶗山群體與其余3個(gè)群體分化顯著，文登奶山羊與城陽群體分化顯著。其中嶗山群體與文登奶山羊的Fst最大(0.1077)，從而這兩個(gè)群體間的每世代兩群體間有效遷移個(gè)體數(shù)最小。即墨群體與城陽群體間的Fst最小(0.0202)，每世代兩群體間有效遷移數(shù)自然最大(16.1683)。表3 群體間基因分化系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離Table3 Pairwise estamates of Fst and Standard genetic distancesPopulations文登奶山羊(WD)城陽群體(CY)即墨群體(JM)嶗山群體(LS)文登奶山羊(WD)0.19600.20660.3335城陽群體(CY)0.0579*0.10550.2487即墨群體(JM)0.05460.02020.1354嶗山群體(LS)0.1077*0.0734*0.0438*注：下三角為群體間基因分化系數(shù)，上三角為群體間標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。嶗山奶山羊4個(gè)群體間的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離見表3。嶗山群體和文登奶山羊之間的遺傳距離最大，值為0.3335。并在此基礎(chǔ)上用NJ法聚類(圖1)，文登奶山羊與城陽群體聚為一類，即墨群體與嶗山群體聚為一類，然后兩大分支聚在一起。圖1 嶗山奶山羊4個(gè)群體Reynolds距離UPGMA聚類圖，圖中數(shù)字代表枝長Figure 1 UPGMA tree constructed from Reynolds distance among 4Laoshan Milk Goat populations, the number on the figure were the branch length2.4種群動(dòng)態(tài) 哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明：5個(gè)微衛(wèi)星座位只有BM1329處于平衡狀態(tài)，其余4個(gè)座位均極顯著偏離哈代-溫伯格平衡。根據(jù)等位基因頻率，使用BOTTLENECK軟件，計(jì)算各微衛(wèi)星座位在無限等位基因模型、逐步突變模型下的期望雜合度Hei和Hes，見表2。當(dāng)使用sign test 檢驗(yàn)時(shí)，假設(shè)所有座位適合IAM模型，當(dāng)達(dá)到突變-漂變平衡時(shí)，具有雜合度過剩的座位數(shù)期望值為2.98，而實(shí)際有4個(gè)座位雜合度過剩，1個(gè)座位雜合度不足，檢驗(yàn)概率為32.90%(表2)。假設(shè)所有座位適合SMM，當(dāng)達(dá)到突變-漂變平衡時(shí)，具有雜合度過剩座位數(shù)期望值為2.98，3個(gè)座位(BM1329、BMS812、CSSM66)具有雜合度不足，檢驗(yàn)概率為32.57%，具有不顯著的雜合度過剩。當(dāng)使用standardize differences test檢驗(yàn)時(shí)，在IAM下和SMM下的T值分別為1.501和-2.689，檢驗(yàn)概率為0.067和0.0036，即嶗山奶山羊群體在SMM模型下具有極顯著的雜合度過剩。3 討論3.1 F-統(tǒng)計(jì)量與其它幾個(gè)遺傳指標(biāo)的關(guān)系 Wright提出的3個(gè)固定指數(shù)均是通過對(duì)群體觀察雜合度和期望雜合度的簡(jiǎn)單計(jì)算得出的，其基本公式表示為：，其中Ho為觀測(cè)雜合度，He為期望雜合度。Fis范圍為-11；Fst范圍為01，其值越大，表明各亞群間遺傳分化越明顯，本研究中Fst平均值為6.1%，說明4個(gè)群體間遺傳分化不明顯。Fit的范圍為-11，4個(gè)嶗山奶山羊群體的總?cè)后w近交系數(shù)為42.6%，說明總?cè)后w近交比較嚴(yán)重。Fis和Fit為極顯著的正值時(shí)，則表示群體內(nèi)近交程度較嚴(yán)重，如果是極顯著的負(fù)值時(shí)，群體內(nèi)觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，則表示群體內(nèi)存在遠(yuǎn)交10。F-統(tǒng)計(jì)量的3個(gè)固定指數(shù)與經(jīng)典群體遺傳學(xué)中評(píng)價(jià)遺傳多樣性豐富程度的指標(biāo)存在聯(lián)系，但同時(shí)它們之間又存在區(qū)別。比如一個(gè)群體內(nèi)檢測(cè)到較高的Fis，表明該群體內(nèi)近交較嚴(yán)重，但并不代表其PIC一定最低；反之，不能說其PIC一定最高。例如，本研究中CSSM66座位的Fis最高，但PIC也是最高的。嶗山奶山羊群體內(nèi)近交系數(shù)較高，可能由于近年來，大量引進(jìn)外來品種，產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)形勢(shì)變化，近親交配，種公羊品質(zhì)不高，自繁等因素造成品種數(shù)量迅速減少。3.2 基因分化系數(shù)與群體間遺傳分化 本研究中，4個(gè)群體基因分化系數(shù)為5.96%，說明4個(gè)群體間遺傳分化不明顯。遺傳距離可以估測(cè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)和群體間的分化關(guān)系。遺傳距離信息可以作為品種分化最基本的指標(biāo)，根據(jù)微衛(wèi)星座位得出的遺傳距離能客觀的反映群體間的遺傳變異和分化時(shí)間的長短，一般認(rèn)為分化時(shí)間越短，遺傳距離越小，當(dāng)兩個(gè)群體間的遺傳距離小于0.05時(shí)，則認(rèn)為這兩個(gè)群體沒有產(chǎn)生分化11,12。本研究中，4個(gè)群體間的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離較小，反映各群體分化時(shí)間較短。3.3群體動(dòng)態(tài) 一般認(rèn)為遺傳多樣性豐富的群體生存力強(qiáng)，根據(jù)遺傳多樣性情況，可以從分子水平估測(cè)有效群體大小。對(duì)一個(gè)近期經(jīng)歷了有效個(gè)體減少的群體來說，其座位的等位基因數(shù)和雜合度將減少，由于稀有等位基因更容易丟失，因此等位基因數(shù)目的減少比雜合度的減少更快，計(jì)算出的期望雜合度比基因座位實(shí)際處于突變漂變平衡下的期望雜合度更大，如果一個(gè)群體處于突變漂變平衡下，則一個(gè)座位顯示雜合度過剩和雜合度不足的概率是一樣的。本研究利用兩種檢驗(yàn)方法(sign test 和standardized differences test)對(duì)嶗山奶山羊群體是否存在顯著的雜合度過剩座位數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，嶗山奶山羊群體在SMM模型下具有極顯著的雜合度過剩，在IAM模型下具有不顯著的雜合度過剩，從而推斷近幾十年來其有效群體大小下降。畜禽遺傳資源的保護(hù)對(duì)我國乃至世界畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展、動(dòng)物遺傳資源的開發(fā)利用、保持良性的生態(tài)平衡和開展相關(guān)基因的研究都具有重要意義。嶗山奶山羊是我國優(yōu)良的奶山羊品種之一，近幾十年來，嶗山奶山羊生存空間逐漸減小，養(yǎng)殖數(shù)量急劇下降，為保護(hù)嶗山奶山羊優(yōu)良的種質(zhì)資源，本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)與分析，其結(jié)果對(duì)于嶗山奶山羊的保種選育和開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)1 中國羊品種志編寫組. 中國羊品種志M. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989.2毛永江，常洪，楊章平，等. 3個(gè)中國地方黃牛品種遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳分化的研究J. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007,38(2):125-132.3 薩姆布魯克,弗里奇,曼尼阿帝斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M.第2版.黃培堂譯.北京:科學(xué)出版社, 2002.4Gutierrez J P, Royo L J, Alvarez I., Goyache F. 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